Abstract
embriyolarda tam uzunlukta nöronal projeksiyonlar görselleştirme nöronal ağlar nasıl geliştiğini memeli bir anlayış kazanmak esastır. Burada yerinde birkaç genetik manipüle fare hatları kullanarak fenotipik özelliklerini değerlendirmek için dorsal kök ganglion (DRG) akson projeksiyonlar bir alt kümesini etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. TrkA pozitif nöronların ağrı sinyallerinin iletimi için özel nosiseptör nöronlar vardır. Biz sağlam fare embriyo tüm TrkA-pozitif çevresel akson yörüngeleri etiketlemek için bir TrkA taulacZ fare hattını kullanmak. Biz daha bağımsız nöronal sağkalım üzerine genetik manipülasyonlar olası etkilerinin büyüme ile ilgili soruları değerlendirmek amacıyla, esasen nöronal apoptoz ortadan kaldıran bir Bax boş bir arka plan üzerine TrkA taulacZ hattını doğurmak. Daha sonra, ilgi genetiği değiştirilmiş fareler TrkA Taul ile yetiştirilenACZ / Bax boş hattı ve daha sonra burada tarif edilen teknikler kullanılarak çalışma için hazırdır. Bu sunum, tüm montaj hazırlanmasında tam uzunlukta aksonal yörüngeleri görünüm için izin diseksiyon, doku hazırlanması, boyama ve temizleme sırasında detaylı fare üreme planları hakkında bilgi, genotiplendirmesi içerir.
Introduction
Kesin nöronal ağların kurulması sinir sisteminin işlevselliği için gerekli karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Bu süreçte sorunlar olduğu insan nörolojik hastalıklar 1-3 implike edilmiştir nöronal fonksiyon bozukluğuna yol açar. Memelilerde akson büyümesi ve hedef innervasyon yatan moleküler mekanizmaları incelemek için, iki genetiği değiştirilmiş fare hatları bir arada kullanarak duyusal nöronlar TrkA-ifade aksonal yörüngeleri görselleştirmek için bir protokol geliştirmiştir.
TrkA sinir büyüme faktörü NGF için bir alıcı, ve nosiseptif duyu nöronlarının 4 fonksiyonel bir işaretleyici olarak kullanılabilir. TrkA derece erken gelişimi sırasında nosiseptif nöronların ifade ve NGF-bağımlı nöron hayatta kalma, akson büyümesini, arborization ve hedef innervasyon 5-9 aracılık eder. TrkA taulacZ farelerde, vahşi tip TrkA geninin taulacZ sentezleme c değiştirilirfarazi TrkA pozitif nöronlarının akson morfolojisi 11 boyama β-gal (X-gal) ile görüntülenebilir şekilde assette 10. Heterozigot TrkA taulacZ / WT hattını kullanarak, düzenlemek veya in vivo duyusal afferent projeksiyonlar gelişmesine engel olabilir faktörleri inceleyebilirsiniz.
Ayrıca, TrkA ifadeleri, bu nedenle, NGF / TrkA sinyal olmadığında mekanizmaları teşvik akson büyümesini belirlemek üzere kullanılabilir homozigot TrkA taulacZ / taulacZ farelerde, yoktur. Nosiseptif nöronlar, NGF / TrkA sadece akson büyümesi için sinyal bağlı olduklarından, aynı zamanda hayatta kalmak için, başka türlü hücre ölümden kurtarmak, embriyonik DRG nöronlarının apoptosisi engellemek için, pro-apoptotik Bax geni eksik bir fare hattı kullanır TrkA sinyallemesinin yokluğunda gözlemlenen. Bax - / - Arka plan 12 Böylece molecu sağlarözellikle akson büyüme 7-9,13-15 etkileyen sinyal yollarının lar diseksiyonu. TrkA yılında - / -: Bax - / - fareler, DRG nöronlar hayatta, ama deride duyu afferent innervasyon tamamen 14,15 kaldırılmıştır. Biz seçici akson projeksiyonlar gelişmesine kendi katkılarını belirlemek için sinyal yolları aktive edebilirsiniz. Bu yöntemin yarar farklı genetik değişiklikler TrkA taulacZ / taulacZ üzerine yetiştirilen zaman aksonal büyüme fenotipleri değişikliklerin değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır: Bax - / - veya TrkA taulacZ / WT: Bax - / - kökenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ile uyumlu. Hayvan protokolü Weill Cornell Medical College IACUC tarafından onaylanmıştır.
1. Doku Hazırlanması
- Servikal dislokasyon 15 ile zamanlanmış-gebelik kadın Euthanize. Ayrı ayrı soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurulmuş bir 6-yuvalı plakasının gözenekleri içinde zamanlanmış hamilelik kadın ve yer embriyolardan E18 embriyoları - embriyonik E16 ayır.
- Soğuk PBS embriyolar durulayın.
- Daha sonra genotipleme için önceden hazırlanmış bir proteinaz K solüsyonunda embriyo ve yer amniyotik zarın küçük bir kısmını çıkarmak. Amniyotik zar kaybolur Alternatif olarak, eğer embriyo kuyruk ucu küçük bir bölümünü kaldırmak ve proteinaz K çözeltisi yerleştirin
- Tüm böcek işaretçilerine (yan başına en az 100) kullanılarak embriyo çevresindeki deri içine delikleri Poke.
- (PFA) taze% 2 paraformaldehid ekleyin yavaş yavaş PBS çıkarın vekuyu pH 7.4.
- Yavaşça 4 ° C'de 2 saat boyunca çalkalanır.
- PBS içinde iki kere embriyo yıkayın ve boyama kadar 4 ° C de PBS içinde depolar.
2. Genotipleme
- Üreticinin talimatlarına göre proteinaz K karışımı içinde amniyotik membranlar veya embriyo kuyrukları daldırın.
- 10 dakika boyunca 56 ° C'de inkübe edilir.
- Bir ticari olarak temin edilebilir DNA saflaştırma kiti kullanılarak DNA ekstrakte edin.
- Gen spesifik sens ve antisens primerler (10 uM), her biri 0.5 ul, 2 ul dNTP karışımı ile birleştirmek, genomik DNA solüsyonu arıtıldı toplam 200 ul, 0.5 ul alın (dATP 2.5 mM, dCTP, dGTP ve dTTP) 0.2 ul Taq polimeraz (5 U / ul) ve 2 ul PCR tamponu (10x), 20 ul toplam hacim H2O ekleyin.
NOT: Primer dizileri aşağıda (Tablo 1):
TrkA: TrkA_F: GCG GGC GCC KİK JGK ATG, TrkA_R: GAA GCC KİK TGC GCG GTT CTG CCA GGG TG; PCR fragment uzunluğu: 400 baz çifti (bp).
Bax: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG, Ex5F: TGA TCA GAA CCA TCA TG, neoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG; PCR fragmanı uzunlukları: vahşi tip, 304 bp; Bax boş, 507 bp.
TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA, lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G; PCR parçası uzunluğu: 360 bp. - TrkA aşağıdaki program ile bir PCR çalıştırın: Aşama 1: 1 dakika 95 ° C, aşama 2 için: 30 saniye için 72 ° C: 68 ° C, aşama 4'te, 20 saniye: 95 ° C, aşama 3 10 san. 40 döngü için 4 - Tekrar 2 adımları.
- LacZ ve Bax, aşağıdaki program ile bir PCR çalıştırın: Aşama 1: 1 dakika 95 ° C de, aşama 2: 10 saniye 95 ° C, aşama 3: 1 dak 54 ° C, aşama 4: 72 ° C'da 1 dakika 35 döngü için 4 - ° C, tekrar adımları 2.
- DNA merdiveni bir şerit 20 dakika süre ile 1x Tris-Asetat-EDTA tampon maddesi içinde 100 V de,% 2 agaroz jel üzerinde yapılmıştır, PCR numuneleri fragmanı uzunlukları değerlendirmek.
- Vahşi tip TrkA, T varlığı için embriyolar analizRKA-tauLacZ ve Bax boş allel. Bax - / -, deneysel sorular bağlı: - - / ve TrkA taulacZ / taulacZ Bax: Deneysel embriyoların genotipleri TrkA taulacZ / WT vardır. TauLacZ muhabiri eksik Embriyolar aksonal boyama için olumsuz olacak ve bu nedenle boyama işlemini kalibre etmek için negatif kontroller hizmet edebilir.
3. Embriyo Boyama
- 3.8 - 3.2 bölümlerde de aşağıda tarif edildiği gibi, bazı modifikasyonlarla, lacZ boyama için bir ticari kit kullanın. Burada, Millipore kiti kullanın.
- Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, en az 1 saat süre ile tampon çözeltisi içinde, embriyolar bırakın.
- Doğrudan, oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, en azından 15 dakika için, Tampon B embriyolar bırakın.
- Embriyolar Tampon A / B, 37 ° C'de önceden sıcak Doku baz çözelti içinde iken. Her embriyo için doku baz çözeltisi 5 ml kullanın.
- Embriyolar Tampon A / B olarak da, yeni 5-br hazırlanmasıomo-% 100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 40 mg / ml arasında bir konsantrasyonda 3-indolil α-D-galaktopiranosid (X-gal) 4-klorofenil.
- 1 mg / ml bir konsantrasyonda önceden ısıtılmış Doku baz çözeltisi içine X-gal ile seyreltilir ve bir cam sintilasyon şişesine X-gal / Doku baz karışımı 5 ml ilave ediniz.
- X-gal / Doku baz karışımını ihtiva eden bir cam sintilasyon şişesine embriyolar aktarın. Parafilm ile kapağı kapatın ve boyası olup olmadığını kontrol, bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Taze% 4 PFA, pH 7.4 ile Postfix'i embriyolar. Yavaşça 4 ° C de 4 saat süre ile çalkalanır.
- Soğuk PBS iki kez embriyolar durulayın.
4. Doku Dehidrasyon ve Takas
- Cam şişeler içinde çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 50 metanol /% 50 PBS karışımı içinde yer embriyolar.
- Cam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 75 metanol /% 25 PBS kurutmak için devam edin.
- % 90 kurutmak devam metanol /% 10 pCam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında, 30 dakika, BS.
- Cam şişeler içinde çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (2x) için% 100 metanol içinde kurutmak için devam edin.
- 1 (v: v) benzoil alkol ve benzoil benzoat karışımı embriyolar dehidrasyon iken, bir 1 hazırlayın.
Not: Benzoil alkol ve benzoil benzoat toksiktir. - 1: 1 embriyolar daldırın (v: v),% 100 metanol karışımı: 15 dakika boyunca% 100 BABB. BABB plastik eriyecektir çünkü sadece camını kullanın.
- Tamamen açık doku% 100 Babb embriyolar daldırın ve temizlenmiş embriyo X-gal boyama görselleştirmek için.
NOT: kısa sürede X-gal leke zamanla solmaya çünkü görüntü.
5. Tüm Dağı Görüntüleme
- Fotoğrafçılık ile metal forseps için uygun açılarda,% 100 Babb dalmış embriyo, stabilize. Işık-up ve altında ışık ışık kaynaklarının bir arada kullanarak Aydınlatmak.
- Diseksiyon mikroskobu görüntüleri EdinmeBir dijital kamera ile donatılmış. 0.5 mm aralıklı Z ekseni boyunca beş ardışık odak düzlemleri birden fazla parlak bir alan poz alın. Pozlama süreleri ve f-durur aydınlatma ve kamera özelliklerine göre değişir ve her kurulum için optimize edilmesi gerekebilir.
- Bindirme görüntüleri işlemek ve fotomontajların oluşturmak için standart görüntü işleme yazılımı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TrkA ağ / taulacZ genotipleri: Bax - / - ve TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriyolar açıkça standart PCR genotipleme ile tespit edilebilir (Şekil 1). X-gal lekeleme görüntüler geleneksel lekeli embriyolar (Şekiller 2, 3a) 'da deri altından periferik aksonal milleri ayrıntılı ve doku temizleme sonra embriyo boyunca (Şekil 3b, 4).
- / - Hattı nörona özgü Nestin promotör 17 kontrolü altında konstitütif kinaz aktive B RAF (V600E), mutasyon (LSL-kaBraf 16) taşıyan fareler elde etmek LSL- Bax: Bu TrkA ağ / taulacZ çoğalmalarına kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - fareler. Tamamen TrkA sinyal eksikliği bu embriyolar, olarak, nosiseptör periferik projeksiyonlar morfolojisi yine neredeyse normal (Şekil 4) geliştirdi. Bu göstermek- / - genetik geçmiş sinyal TrkA bağımlı yaşam kaybı ile ikame B-Raf, periferik akson büyümesi sinyalleşme ve SA önemli özelliklerinden birisi hayatta kalma ve TrkA sinyallemesinin fonksiyonlarını destekleyen akson büyümesi Bax ile ayrılabilir olduğunu göstermektedir .
Şekil 1: transgenik farelerin Genotipleme Temsilcisi agaroz jel görüntüleri.. Örnek 1: TrkA ağ / taulacZ: Bax ağ / - Örnek 2: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -, örnek 3: TrkA ağ / taulacZ: Bax - / -.
Şekil 2: E18.5 TrkA ağ / taulacZ fare X-gal ile lekelenmiştir, trigeminal ganglionların akson çıkıntılar gövde ve ısıtma yıllık.D, bir temizlenmemiş embriyo gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 1 mm.
Şekil 3:. E18.5 TrkA WT / taulacZ önce X-gal (A) ile boyandı fare ve orta-gövde içinde DRG'ler gelen BABB Projeksiyonlar ile temizledikten sonra (B) gösterilmektedir. Ölçek çubuğu: 2 mm.
Şekil 4: Bir E16.5 LSL-kaBraf: TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / -:. X-gal ile boyanmış ve BABB kaBraf ile temizlenir Nestin-Cre fare embriyosu bir kinaz, B-Raf kinaz proteinini kodlayan, B-Raf V600E. DRG nöronları Kab-RAF sentezlenmesi TrkA sinyal olmadığında, normal akson uzantısı yakın tam uzunlukta sonuçlanmıştır. Ölçek çubuğu: 1 mm. Kontrolleri de dahil olmak üzere daha fazla görüntü için, ref bakın. 15, Şekil2.
| PCR genotipleme için kullanılan primerler | ||
| 1 | TrkA | DNA parçası boyutu: 400 bp |
| TrkA_F | GCG GGC GCC GCC GCG ATG | |
| TrkA_R | GAA GCC KİK TGC GCG GTT CTG CCA GGG TG | |
| 2 | Bax | DNA parçası boyutu: 304 bp (vahşi tip), 507 bp'lik (Bax boş) |
| In5R | GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG | |
| Ex5F | TGA TCA GAA CCA TCA TG | |
| NeoR | CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG | |
| 3 | TauLacZ | DNA parçası boyutu: 360 bp |
| lacZup | ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA | |
| lacZdown | ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G | |
Tablo 1: PCR genotipleme için kullanılan primerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Embriyonik TrkA taulacZ farelerin yukarıda tarif edilen X-gal lekeleme prosedürü sağlam, sabit embriyo uzun mesafe akson çıkıntıların hızlı ve ayrıntılı olarak gösterebilir. Bu fareler akson büyümesi ve nöronal hayatta hem de katkıda bulunabilir mekanizmalar sinyal tarama izin Bax boş arka plan Çünkü. Ilgi transgenik veya nakavt fareler ile çiftleşme aksonal fenotip kapsamlı değerlendirilmesi için izin verir ve daha detaylı bir şekilde akson büyüme sinyalini incelemek için gelecek deneyler için de yararlı bir rehber hizmet edebilir. In vivo akson büyüme çalışmaları için önemli bir zorluk doku hazırlamak için zamanı bölümleri ve herhangi bir genetik manipülasyon yoluyla çeşitli şekillerde etkilenebilir büyüyen akson karmaşık fenotipleri değerlendirmek. TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - çizgi genin tam etkilerinin değerlendirilmesini sağlarPeriferik nosiseptör akson gelişimine ilgi.
teknik normalde erken gelişim dönemlerinde TrkA ifade ediyorum nosiseptör aksonal yörüngeleri görselleştirilmesi ile sınırlıdır. Periferik nosiseptörler yanı sıra, sempatik ve bazal ön beyin kolinerjik projeksiyonları görselleştirmek mümkün olabilir; Bununla birlikte, bu boyama teknikleri özel optimizasyon gerektirir
Doku temizleme Burada anlatılan protokol önemli bir adım olduğunu. Bu tüm montaj hazırlıkları derin yalan projeksiyonlar ve bu nedenle farklı fenotip potansiyel kimlik detaylı bir değerlendirme sağlar. Bulduk çünkü bu tür tdTomato veya GFP muhabir 18,19 gibi floresan haberci, belirli koşullar altında, görsel netlik sunabilir, ancak, X-gal ile boyama aksine, floresan sinyalleri esnasında esas fade tüm montaj görüntü elde etmek zordur Doku temizleme prosedürü. DIIboyanması ve aynı zamanda yaygın olarak akson etiketleme 20 için kullanılır; eksiklikleri seçici gibi burada nosiseptör lifleri gibi akson belirli bir alt tipi etiket olamaz, ve tam çevre uzun yörüngeleri etiketlemek için zordur.
Özetle, biz fare embriyo nosiseptif akson tam milleri rutin görselleştirme izin iki genetiği değiştirilmiş fare hatları bir arada kullanan bir protokol sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar anlayışlı tartışma ve önerileriniz için TrkA taulacZ fareler Dr. Annette Markus Dr. Louis Reichardt teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Burke Vakfı yanı sıra Whitehall Vakfı araştırma bursu 2010-08-61, Yaşam Vakfı (WFL-ABD-028/14) için Wings bir araştırma hibe başlangıç fonları tarafından desteklenen, gelen ZB1-1102-1 hibe Christopher & Dana Reeve Vakfı, ve JZ Ulusal Göz Enstitüsü hibe 1R01EY022409 ve 3R01EY022409-01S1. KJO bir Goldsmith üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B | |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B | |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 | |
| Incubator | Labline | Model 120 | |
| Insect pins | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6-well dish | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primers | IDT | custom DNA primers | |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 | |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Dissecting microscope | Leica | M205A | |
| Camera | Leica | DFC310FX | |
| Ring light | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
References
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
