Protocol
1. בימוי התמיינות של הרשתית המופק מתאי גזע
הערה: כל שלבי הדגירה מתבצעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2
- לשמור על קווי הס או ירכיים (להאכיל יומי) בתקשורת תחזוקה (MM; טבלת 1). ברגע שהקווים הגיעו סטנדרטים מספקים של בקרת איכות, לשמור אותם בשכבה של תאים מזינים עכבר עוברי (MEFs) זורעים בצפיפות של 250,000 / גם צלחת גם שש. יכולות גם להיות שנוצרו תרבויות ללא קסנו הבא הפרוטוקול שהוקם על ידי et al טאקר. 40.
- לאפשר למושבות של תאי גזע להגיע confluency.
- לעבור לתקשורת בידול עם Nicotinamide (DM / NIC; טבלת 1); להאכיל יומי.
- אחרי שלושה שבועות בתרבות, לעבור לתקשורת בידול עם nicotinamide וגם Activin-או IDE-1 (DM / NIC / AA או DM / NIC / IDE1; טבלת 1) כדי לשפר את בידול הרשתית. אחרי חמישה שבועות בתרבות, לחזור לDM / NIC. האכלות יומיות אינן נחוצות עוד פעם אינדיקטורים pH בתחנת התקשורת הופכת צהוב ביום שלאחר ההאכלה.
- חכה לאיים של תאי פיגמנט להופיע כי הם גדולים מספיק כדי לחתוך ולהסיר (ראו איורים 2D-F ו3A).
2. איי פיגמנט בידוד
- מעיל הבארות של צלחת 24 גם עם מטריצה המחקה את סביבת התא הטבעית (ללא קסנו עדיף).
הערה: להבי קרנית ומלקחיים חדים, קנס שקצו הם מאוד שימושיים לקטיף. גיליון השלם של תאים מובחנים יכול לנתק תוך קטיף. למנוע זאת על ידי עבודה בזהירות ובהתחלת קטיף מושבות במרכז הצלחת. - מלא בארות רבות של הצלחת 24 גם עם תקשורת בידול (DM; טבלת 1) במידת צורך. החלטה זו תהיה תלויה במספר מושבות פיגמנטשנאסף.
- במנדף תרבית תאים עם היקף לנתח, לחתוך באופן ידני את איי פיגמנט. לקצוץ את כל איון בתחתית הצלחת המקורית באמצעות אזמל בכ 2-6 חתיכות ולתפוס את חלקי פיגמנט עם מלקחיים חדים.
- העבר 1-2 חתיכות פיגמנט לכל 24 גם.
- אין לשנות תקשורת במשך 3-5 ימים, עד שתאים לדבוק, אז להתחיל לשנות מדיה שלוש פעמים בשבוע. (אם הם לא לדבוק בתום תקופה זו, הסבירות היא טובה כי הם לעולם לא).
- להרחיב תאים במשך 3-4 שבועות בתקשורת בידול (DM; טבלת 1) - תמונה של תרבות טיפוסית מוצגת באיור 3. תאים עדיין לא יכולים למלא את כל טוב אבל מחכים כבר לא נראים כדי לעזור. להאכיל את תאים שלוש פעמים בשבוע.
- לאחר כ 3 שבועות, להסיר באופן ידני אשכולות של תאים לבנים בגושים במידת צורך עם מלקחיים חדים. אל תעשו את הצעד הזה, אלא אם כן יש צורך - זה קל להציג את המזהמים. הוא אידיאלי לאנסה להשיג אוכלוסיות הטהורות ביותר של הרשתית ממושבות פיגמנט המקוריות בשלב 1.6.
מקורן בתאי גזע 3. Passaging הרשתית
- ניתוק תאים עם 200 μl עם פתרון תא דיסוציאציה (רצוי לא טריפסין-מגיב כי יכול להיות מובטל בדילול עדיף) במשך 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ולהשבית אותו על ידי דילול עם DM. השתמש פיפטה 200 μl כדי לשטוף את כל התאים וresuspend אותם (אם נבחר גם מכיל רק כמה תאים, שוקלים איגום התאים משני 24 בארות).
- צנטריפוגה (800 XG במשך 5 דקות), להשליך supernatant, וגלול בתקשורת DM 3 מיליליטר.
- תאים-צלחת מחדש מאחד (או שתיים) 24 בארות למטריצה אחד 6-גם מצופה ב 3 מיליליטר של DM בכל טוב (1: 5 הרחבה).
- להרחיב במשך 1-2 שבועות עד שהתאים הם ~ ומחוברות 90%; דמותה של התרבות הטהורה מובחנת באופן מלא מוצגת באיור 3 ג.
- ניתוק תאים עם ד תא 1 מיליליטרפתרון issociation כ 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס, להשבית אותו על ידי דילול עם DM, להשתמש 1,000 פיפטה μl כדי לשטוף את כל התאים, וresuspend אותם.
- ספין למטה (800 XG במשך 5 דקות), להשליך supernatant, וגלול בתקשורת DM 18 מיליליטר.
- תאים-צלחת מחדש מאחד 6-גם כל לשש מטריצה מצופה 6-בארות ב 3 מיליליטר של DM בכל טוב (1: 6 הרחבה) או אחד מצופי 75cm 2 בקבוק (1: 7.5 הרחבה).
- חזור על שלבים 3.4-3.8 צריכים, עד שמספיק תאים מתקבלים.
הערה: נסה לאסוף מושבות רבות ככל האפשר להרחבה ולא מתכנן להגביר את התרבויות באמצעות passaging מאז כל קטע גורם dedifferentiation הרשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצעדים המפורטים בכתב היד הזה, כפי שהוא מתואר באיור 1, יכולים לשמש כדי ליצור בקלות הרשתית מתאי גזע כפי שדווחו בעבר 10,12. לאחר שמירת קווי iPS במשך כמה שבועות, מושבות פיגמנט יתחילו להופיע במושבות לאחר 5-7 שבועות (תרבויות בן 7 שבוע מוצגות באיור 2 א-ג). מושבות אלה יכולים להמשיך לצמוח במשך שבועות כנשמרות התרבויות. ברגע שמגיע לגדלים מספיק, כפי שמוצג באיור 2 ד-F (תרבויות בן 8 שבוע), הם יכולים להיות נכרת באופן ידני כפי שמודגמים באיור 3 א. כריתה זהירה, כדי למנוע זיהום בתאים שאינם הרשתית תקל על הדור של תרבויות הרשתית מספיק טהורות (איור 3 ב-ג) באופן משמעותי.
איור 1: מתאר סכמטי גזירת iPS-הרשתית אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ActivinIDE-1 ד לשפר את התשואה של iPS-הרשתית. () מושבות פיגמנט קטנות מתחילות להופיע לאחר שבעה שבועות בתרבות באופן ספונטני בין תאים-הרשתית שאינו בגיליון יחיד שדוגל בתחתית צלחת 6-היטב (חלק מסומנים בחיצים). (B ו- C) תוספת של תוצאות IDE-1 או Activin במראה של אף מושבות פיגמנט יותר (חלקם מסומנים בחיצים בAC) מפגין תוספים שגם עם Activin או IDE-1 משפר הרשתית בידול. (DF) לאחר 8 שבועות את ההשפעות של תוספים עם IDE-1 או Activin הם אפילו בולטים יותר. שני המספרים והגדלים של האיים פיגמנט הם גדולים יותר לאחר התמיינות מכוונת. בר סולם = 5 מ"מ
איור 3: הרחבה ובידול מסוף שלתמונת נציג iPS-הרשתית פיגמנט. (א) למושבת iPS-הרשתית פיגמנט שהוא גדול מספיק כדי בלו. תאים שאינו הרשתית מקיפים את המושבה בתחתית צלחת 6-היטב. המתווה הכחולה מסמנת את האזור שיהיה נכרת. תמונה (B) של תאים לא בשלים iPS-הרשתית לאחר מחוברות בתרבות לאחר שלב ההרחבה הראשון. תאי בן חודשים (C) סופני הבדיל iPS-הרשתית. שים לב לנוכחותם של גבולות ברורים תא ורמות הומוגנית של פיגמנטציה מפגינים בידול מתקדם. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה אנו מתארים את הצעדים כדי ליצור ביעילות מספר גדול של תרבויות iPS-הרשתית טהורות. הראינו בעבר שימוש בפרוטוקול זה בבימויו בידול עם Activin שאנחנו יכולים ליצור iPS-הרשתית שמאוד דומה לhRPE מבוסס על transcriptomics, פרוטאומיקה, metabolomics, ופונקציונליות, וכי הם לעכב ניוון רשתית כאשר מושתלים בחולדות RCS 12,31,32 . תהליך יצירת iPS-הרשתית הוא גוזל זמן, אך לא מייגע (איור 1). ברגע שתרבויות iPS להגיע confluency הם חייבים להיות מוזנים עם תקשורת בידול על בסיס יומי. אנחנו משלימים את התקשורת עם או Activin או IDE-1 מולקולה קטנה פחות יקר, ולהמשיך האכלה שבועיים תוך מעקב התרבויות למושבות iPS-הרשתית פיגמנט שבדרך כלל מופיעים לאחר 5-7 שבועות (איור 2 א-ג). ברגע שמגיע לגדלים מספיק (האיורים 2D-F ו3A), colonies יוסרו באופן ידני והועבר לצלחות חדשות להרחבה. זה מתרחש בערך לאחר 8 שבועות והוא הצעד מייגע ביותר של כל הפרוטוקול.
ההיבט המאתגר ביותר הוא הימנעות זיהום עם תאים שאינם הרשתית בתרבויות הרחבת על ידי איסוף בטעות תאים שכנים לא רצויים או סביב מושבות פיגמנט. בהתאם לרמת זיהום, האיים של תאים הלא-הרשתית ניתן להסיר באופן ידני במהלך התרחבות, אם כי בכל פעם שהתרבויות מטופלות סיכונים נוספים של החדרת זיהום חיידקים או פטרייתי גדל. ראוי לציין כי בניסיון שלנו iPS-הרשתית יכולה "לגבור" למעשה מספר קטן של תאי זיהום במהלך שלבי passaging. אבל אנחנו ממליצים בחום לקחת בזהירות רבה בעת בחירת מושבות כדי לוודא שהם טהורים ככל האפשר כדי להימנע מהצורך לנקוט את הצעדים הבאים. על ידי המעבר השני או שלישי תרבויות iPS-הרשתית הם מספיק טהורות וsuffiמספרים מספיקים של תאים זמינים לאפיון והשתלה.
הטכניקה דיווחה כאן היא בהחלט לא השיטה היחידה להפקת הרשתית מקורן בתאי גזע. למעשה זה לא קל ולא המהיר ביותר. השיטה הקלה ביותר והנרחבת ביותר היא להשתמש בהתמיינות ספונטנית. (עם זאת, תוספים עם IDE-1 במשך שבועיים הוא לא יקרים ומגדילים מאוד את התשואה של iPS-הרשתית.) גם iPS-הרשתית שנוצרו בגופי embryoid שלהתמיין תחומי תאי RPE מקוטבים שניתן לכפות לדבוק פני השטח של צלחות ותרבות להרחיב כmonolayer. תאי RPE ליצור בשיטה זו יש גם מאופיינת מאוד נמרץ וחזקה דומה 27 hRPE. הרשתית יכולה להבחין בקצב מהיר ביותר (רק 14 ימים) מתאי גזע ידי להשלים את התקשורת עם nicotinamide, IGF1, Noggin, Dkk1, וbFGF להמיר אותם לגורלם מוליד רשתית עצבי, ואחר כך הוספה פרו-הרשתית גורמי nicotinamidend Activin 37. יכולה גם להיות שנוצרה הרשתית עוד יותר במהירות ישירות מfibroblasts כבחודש על ידי transducing fibroblasts עם מספר מינימלי של גורמי שעתוק כוללים cMYC, MITF, OTX2, Rax, וCRX 44. עם זאת, בעוד שתוצאות אלו מאוד מעודדות את הרשתית נוצר שתי הטכניקות האחרונות טרם מאופיינות בקפדנות על ידי השתלתם in vivo. לכן, אנו מציעים שהקורא לשקול את כל אפשרויות גזירת הרשתית בזהירות כאשר מחליטים אילו להעסיק בלימודיהם.
היתרונות של שימוש בפרוטוקול שתואר כאן הם הפשטות שלו ותשואות גבוהות באופן עקבי של הרשתית מאוד באיכות גבוהה 31. תוספת של IDE-1 ולא Activin מקטינה באופן משמעותי את העלות הכוללת ומורידה את הסיכון כרוך בשימוש בחלבונים רקומביננטי. מאחר שעדיין לא ברור אם הבחירה להשתמש בשיטות בידול שונות תהיההשפעה על התוצר הסופי, זה יכול להיות יתרון לנצל פרוטוקולים סטנדרטיים, במיוחד אם השוואה ישירה בין הרשתית שנוצרה במעבדות שונות תהיה צורך (אולי במיוחד במקרה של מודלים מחלה). פרוטוקול פשוט, כמו זו שדורשת מומחיות וריאגנטים קטנים, ושיוצרת תשואה גבוהה של iPS-הרשתית, יכול להיות אידיאלי למצבים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
- Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T.
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
- Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
- Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
- Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
- Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
- Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
- Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).
