Protocol
줄기 세포 유래 망막 색소 상피 1. 감독 차별화
주 : 모든 인큐베이션 단계는 5 % CO 2에서 37 ℃에서 수행
- 유지 보수 미디어 (; 표 1 MM)의 배아 줄기 또는 엉덩이 라인 (매일 공급)를 유지한다. 라인이 품질 관리 기준을 충분히 도달했으면, 마우스 배아 피더 세포의 층에이를 유지 보수 (MEFs에)은 250,000의 밀도 / 웰의 여섯 웰 플레이트에 시딩. 제노없는 배양 또한 터커 외. (40)에 의해 확립 된 프로토콜은 다음 생성 될 수있다.
- 줄기 세포 식민지 포화 상태에 도달 할 수 있습니다.
- 니코틴 아미드 (; 표 1 DM / NIC)와 차별화 미디어로 전환; 매일 공급.
- RPE 차별화를 강화하기 위해, 문화 삼주 후, 니코틴 및 중 하나를 Activin-A 또는 IDE-1 (표 1 DM / NIC / AA 또는 DM / NIC / IDE1)와 차별화 미디어로 전환합니다. 문화 오주 후, DM / NIC로 전환. 매일 먹이를 더 이상 공급 후 노란색 하루를 돌려 미디어 정지의 pH를 표시 한 번 필요하지 않습니다.
- (그림 2D-F와 3A 참조)만큼 잘라 제거 할 큰이 나타나는 색소 세포의 섬 기다립니다.
2. 분리 안료 독도
- 외투 세포 자연 환경 (이종이없는 것이 바람직하다) 본뜬 매트릭스 24- 웰 플레이트의 웰.
참고 : 각막 블레이드 날카로운, 뾰족한 집게 따기위한 매우 유용합니다. 따기 동안 분화 된 세포의 전체 시트를 분리 할 수 있습니다. 신중하게 작업하고 처음에 접시의 중앙에 식민지를 선택하여이 피하십시오. - (; 표 1 DM) 필요에 따라 차별화 미디어를 24 웰 플레이트의 많은 우물을 입력합니다. 착색 된 콜로니의 수에 의존 할 것이다 이러한 결정수집.
- 해부와 세포 배양 후드에서 수동으로 착색 된 섬을 잘라. 약 2-6 조각으로 메스를 사용하여 원래 판의 맨 아래에 각각의 섬을 잘라 날카로운 집게로 착색 된 부분을 잡아.
- 각 24 웰에 1-2 착색 된 조각을 전송합니다.
- 세포가 준수 할 때까지 3~5일을 위해 미디어를 변경하지 마십시오, 다음 미디어에게 일주일에 세 번 변경 시작합니다. (그들은이 시간 이후 준수하지 않는 경우, 가능성은 결코 좋은입니다).
- (; 표 1 DM) - 전형적인 문화의 이미지가 그림 3b에 도시되어 차별화 미디어 3-4 주 동안 세포를 확장합니다. 세포는 여전히 전체를 잘 채울 수 있지만 더 이상 기다리는 것은 해결 될 수 없다. 일주일에 세포를 세 번 피드.
- 약 3 주 후, 수동 날카로운 집게로 필요한 경우 대단히 짧은 흰색 세포의 클러스터를 제거합니다. 필요한 경우가 아니면이 단계를 수행하지 마십시오 - 그것은 오염 물질을 소개하기 쉽습니다. 그것은에 이상적입니다단계 1.6 원래 색소 식민지에서 RPE의 순수한 인구를 얻으려고.
3.과 Passaging 줄기 세포 유래 망막 색소 상피
- 세포 해리 용액 200 μL를 가진 세포를 분리하여 37 ℃에서 5-8 분 동안 (바람직 희석 바람직하다 통하여 불 활성화 될 수있는 시약의 트립신 생략), 및 DM 희석하여 비활성화. 모든 세포를 씻어하고 (두 24 우물에서 세포를 풀링을 고려, 몇 세포가 포함되어 잘 선택한 경우)을 재현 탁하기 위해 200 μL 피펫을 사용합니다.
- 원심 분리기 (5 분 800 XG)는, 3 ㎖의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
- 다시 플레이트 세포 하나 (또는 2) 잘 당 DM의 3 ㎖ 한 매트릭스 코팅 6 자에 24 우물에서 (1 : 5 확장).
- 세포가 ~ 90 % 컨 플루 언트 될 때까지 1~2주 대한 확대; 완전히 차별화 된 순수 문화의 이미지는 그림 3C에 표시됩니다.
- 1 ml의 세포 D와 세포를 분리37 ° C에서 약 5-8 분 issociation 솔루션은, DM 희석하여 비활성화 모든 세포를 씻어 1,000 μL 피펫을 사용하고이를 재현 탁.
- (5 분 800 XG) 스핀 다운 18 ML의 DM 미디어에서 뜨는 및 재현 탁를 폐기합니다.
- (6 팽창 1) 또는 (2) 75cm 플라스크 하나가 코팅 된 (1 : 7.5 확장) 여섯 매트릭스로 한 각 6- 웰 플레이트에서 다시 셀 웰 당 3 ㎖ DM 6- 웰 코팅.
- 충분한 세포를 얻을 때까지 반복 3.4-3.8 필요한 단계를 반복합니다.
참고 : 오히려 각 통로 RPE의 탈분화를 유도하기 때문에 계대를 통해 문화를 증폭 계획보다 확장 가능한 한 많은 식민지를 수집하려고합니다.
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Representative Results
도 1에 도시 된 바와 같이,이 논문에서 설명하는 단계는, 이전에보고 된 바와 같이 (10, 12)를 용이하게 줄기 세포에서 RPE를 생성하는데 사용될 수있다. 몇 주 동안 만능 줄기 라인을 유지 한 후, 색소 식민지 5-7주 (7 주 된 문화가 그림 2A-C에 나와 있습니다) 후 식민지에서 나타나기 시작. 이러한 식민지 문화가 유지 될 때 주 동안 계속 증가 할 수 있습니다. 도 3a에 도시 된 바와 같이,도 2D-F (8 주령 배양)에 나타내는 바와 같이, 충분한 크기에 도달하면, 이들은 수동으로 절개 할 수있다. 주의 절제 크게 충분히 순수 RPE 문화 (그림 3B-C)의 생성을 촉진 할 것이다 비 망막 색소 상피 세포의 오염을 방지 할 수 있습니다.
그림 1 : 도식 묘사 만능 줄기-RPE 유도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :를 티빈d 개의 IDE-1 만능 줄기-RPE의 수율을 향상시킬 수 있습니다. (A) 작은 색소 식민지 (6 웰 플레이트의 하단에 부착입니다 자발적으로 한 장에 비 망막 색소 상피 세포 사이의 문화 일곱 주 후 일부 나타나기 시작 ) 화살표로 표시되어 있습니다. (B 및 C)보다 색소 식민지의 모양에 IDE-1 또는를 Activin 결과를 보완 (일부는 AC에 화살표가 표시되어 있습니다)를 Activin A 또는 IDE-1 중 하나와 그 보충을 보여주는이 RPE을 향상 차별화. (DF) 팔주 IDE-1 또는를 Activin과 보충의 효과 후 더욱 뚜렷하다. 두 착색 아일렛의 개수 및 크기가 지시 분화 후 크다. 스케일 바 = 5mm
그림 3 : 확장 및 터미널 차별화소비세에 충분히 큰 착색 된 만능 줄기-RPE 식민지의 색소 만능 줄기-RPE. (A) 대표 이미지입니다. 비 RPE 세포를 6 웰 플레이트의 바닥에 콜로니를 둘러싸. 파란색 1 {절제 될 영역을 표시합니다. 첫 번째 확장 단계 이후 문화 후 합류 미성숙 만능 줄기-RPE 세포의 (B) 이미지. (C) 두 개월 된 말기 분화 만능 줄기-RPE 세포를. 고급 차별화를 보여주는 명백한 셀 경계와 색소 침착의 균일 한 수준의 존재를합니다. 스케일 바 = 100 μm의
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Discussion
이 논문에서 우리는 효율적으로 순수 만능 줄기-RPE 문화의 큰 숫자를 생성하는 단계를 설명합니다. 우리는 우리가 강하게 transcriptomics, 단백질 체학, 대사 체학 및 기능에 따라 hRPE 유사 만능 줄기-RPE를 생성 할 수 있습니다를 Activin이 감독 분화 프로토콜을 사용하여 이전에 보여 주었다 및 RCS 쥐 12,31,32를 이식 할 때 그들은 망막 변성을 지연하는 것이 . 만능-RPE를 생성하는 과정은 시간이 많이 소요 아니라 고된 (도 1)이다. 만능 문화 포화 상태에 도달하면 그들은 매일 차별화 매체를 공급해야합니다. 우리를 Activin A 또는 덜 비싼 작은 분자 IDE-1 중 하나와 미디어를 보완하고, 일반적으로 5-7주 (그림 2A-C) 후 나타나는 색소 만능 줄기-RPE 식민지의 문화를 모니터링하면서 2 주 동안 먹이를 계속합니다. 일단 충분한 크기에 도달하기 (도 2D 및 3A-F), coloniES는 수동으로 제거 및 확장을위한 새로운 접시로 전송됩니다. 이것은 대략 후 8주 발생하고 전체 프로토콜의 가장 힘든 공정이다.
가장 도전적인 양태는 실수 또는 착색 된 콜로니 주변에 인접한 원치 않는 세포를 수집하여 확대 배양 비 RPE 세포의 오염을 피할 수있다. 오염의 정도에 따라, 비 RPE 세포의 배양은 섬이 증가 세균성 또는 진균 오염물을 도입하는 추가적인 위험을 처리 할 때마다 있지만, 팽창 중에 수동으로 제거 될 수있다. 이는 우리의 경험에서 만능-RPE 실제로 계대 단계 동안 오염하는 소수의 세포를 "outcompete"수 있다는 주목할 가치가있다. 그러나 우리는 강하게이 단계에 의존하는 것을 피하기 위해 가능한 한 순수 보장하기 위해 식민지를 따기 때 큰주의를 복용하는 것이 좋습니다. 두 번째 또는 세 번째 흐름으로 유도 만능 줄기-RPE 문화는 충분히 순수하고 suffi 있습니다세포의 효율적인 숫자는 특성화 및 이식에 사용할 수 있습니다.
여기에보고 기술은 확실히 줄기 세포 유래 RPE를 도출하기위한 유일한 방법이 아니다. 사실 그것은 어느 쪽도 쉬운이나 빠른 없다. 가장 쉬운 방법은 널리 자발적인 분화를 사용하는 것이다. (단, 2 주 동안 IDE-1 보충 저렴하고 크게 만능 줄기-RPE의 수율을 증가시킨다.) 만능 줄기-RPE는 또한 표면에 부착하도록 강요 할 수 편광 망막 색소 상피 세포의 분야로 분화 배아 체에서 생성 한 문화 판과는 단일 층으로 확장합니다. 망막 색소 상피 세포도 매우 적극적으로 특징 지어 강하게 hRPE (27)과 유사 한이 방법을 사용하여 생성합니다. RPE는 니코틴과 미디어를 보완하여 줄기 세포에서 (단지 14 일) 빠르게 매우 차별화 할 수, IGF1은 소량는 Dkk1 및 bFGF를 다음 나중에 프로 RPE는 니코틴의 요인을 추가, 신경 망막 전구 운명으로 변환차를 Activin (37). RPE는 cMYC, MITF,의 Otx2, RAX, CRX 44 및 전사 인자를 포함한 최소한의 섬유 아세포로 형질 도입하여 약 1 달 섬유 아세포에서 더욱 빠르게 직접 생성 될 수있다. 그러나 이러한 결과는 매우 RPE을 장려하는 동안은이 마지막 두 가지 기술이 아직 엄격하게 생체 내에서 그들을 이식 특징되지 않은 생성. 따라서, 우리는 그들의 연구에서 사용되는 결정할 때 독자가주의 깊게 RPE 파생 옵션을 고려하는 것이 좋습니다.
여기에 설명 된 프로토콜을 사용하는 장점은 단순함과 매우 고품질의 RPE (31)의 일관되게 높은 수율이다. IDE-1보다는를 Activin과 보충 크게 재조합 단백질을 사용과 관련된 위험을 전체 비용을 줄이고 낮 춥니 다. 선택이있을 것이다 분화 다른 방법을 사용하는 경우는 아직 명확하지 않기 때문에최종 생성물에 영향은, 상이한 실험실에서 생성 RPE 간의 직접 비교가 (아마도 특별히 질병 모델의 경우에) 필요하다 특히, 표준화 된 프로토콜을 이용하는 것이 바람직 할 수있다. 약간의 전문 지식과 시약을 필요로하고, 그 만능 줄기-RPE의 높은 수율을 생성 이와 같은 간단한 프로토콜은 이러한 상황에 이상적 일 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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