Protocol
1. направленной дифференцировки стволовых клеток, полученных НПП
Примечание: Все стадии инкубации проводили при 37 ° С в 5% СО 2
- Поддержание линии HES или бедер (подача в день) на техническое обслуживание средств массовой информации (мм Таблица 1). После того, как линии достигли достаточных стандарты контроля качества, поддерживать их на слой мышиных эмбриональных клеток-фидеров (MEFs) высевали при плотности 250000 / лунку пластины шесть. Xeno свободной культуры также могут быть получены в соответствии с протоколом, установленном Tucker и соавт. 40.
- Разрешить стволовых клеток колонии, чтобы достичь слияния.
- Переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамид (DM / NIC; Таблица 1); кормить ежедневно.
- После трех недель в культуре, переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамида и либо активин-А или IDE-1 (DM / NIC / AA или DM / NIC / IDE1, в таблице 1) для увеличения НПП дифференциации. После пяти недель в культуре, вернуться к DM / NIC. не Ежедневные кормления больше не надо раз индикаторов рН в СМИ остановки желтеют день после кормления.
- Подождите островков пигментных клеток казаться, что достаточно велики, чтобы быть вырезано и не удалено (рисунки 2D-F и 3А).
2. Разделительные Пигментные Островки
- Шерсть лунки 24-луночного планшета с матрицей, которая имитирует естественное окружающей среды клеток (ксено свободной предпочтительно).
ПРИМЕЧАНИЕ: роговица ножи и острые, остроконечный пинцет являются очень полезными для сбора. Весь лист дифференцированных клеток может снять во время уборки. Избежать этого можно, работая тщательно и первоначально собирание колонии в центре блюда. - Заполните столько лунки 24-луночного планшета с дифференциацией средств массовой информации (DM, в таблице 1) по мере необходимости. Это решение будет зависеть от количества пигментных колонийсобраны.
- В капот культуре клеток с рассекает сферу, вручную вырезать пигментные островки. Крошить каждый островок в нижней части исходной пластины с использованием скальпель примерно 2-6 частей и захватить пигментные части с острыми щипцами.
- Трансфер 1-2 пигментные части в каждом 24-а.
- Не изменяйте СМИ в течение 3-5 дней, пока клетки придерживаться, а затем начать сменить носитель три раза в неделю. (Если они не придерживаются после этого времени, вероятность того, хорошо, что они никогда не будут).
- Развернуть клеток в течение 3-4 недель в среде для дифференцировки (DM, в таблице 1) - образ типичного культуры, показанных на рисунке 3B. Клетки могут еще не полностью заполнять хорошо, но ждать больше не похоже, чтобы помочь. Поток ячеек три раза в неделю.
- Примерно через 3 недели, вручную удалить скопления лейкоцитов в случае необходимости с острыми щипцами сгустки. Не сделать этот шаг, если это не является необходимым - это легко ввести загрязняющих веществ. Это идеально подходит дляпопытаться получить чистые популяции ПЭС от оригинальных пигментных колоний в шаге 1.6.
3. пассажи стволовых клеток, полученных НПП
- Отделить клетки с 200 мкл раствора с клеточной диссоциации (предпочтительно не трипсином-реагент, который может быть инактивирован путем разбавления предпочтительно) в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С, и инактивировать его разбавлением DM. Использование 200 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки и ресуспендируют их (Если выбранный также содержит только несколько клеток, считают объединения клеток из двух 24-луночных).
- Центрифуга (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 3 мл DM сред.
- Re-пластинчатые клетки от одного (или двух) 24-колодцы в одной матрице покрытием 6-а в 3 мл DM на лунку (1: 5 расширения).
- Развернуть течение 1-2 недель, пока клетки не являются ~ 90% сливной; Изображение полностью дифференцированных чистой культуры показано на фиг.3С.
- Отделить клетки с 1 мл клеточной DДиссоциация раствор в течение приблизительно 5-8 мин при 37 ° С, его инактивации путем разбавления DM, использовать 1000 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки, и ресуспендируют их.
- Спин вниз (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 18 мл DM СМИ.
- Повторное пластины клетки один 6-а каждый из шести матрицы с покрытием 6-скважин в 3 мл на лунку DM (1: 6 расширения) или один с покрытием 75см 2 колбу (1: 7,5 расширение).
- Повторите шаги 3.4-3.8 мере необходимости, пока достаточное количество клеток не получают.
Примечание: старайтесь, чтобы собрать как можно больше колоний, как это возможно для расширения, а не планирует усиливать культур с помощью пассирования, так как каждый проход вызывает НПП дедифференцировку.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаги, описанные в этой рукописи, как показано на рисунке 1, может быть использован для генерации легко RPE из стволовых клеток, как сообщалось ранее 10,12. После сохранения линии плюрипотентных в течение нескольких недель, пигментные колонии начинают появляться в колониях после 5-7 недель (7 недельных культуры, показанных на рисунке 2А-С). Эти колонии могут продолжать расти в течение нескольких недель, как Культуры поддерживали. После достижения достаточных размеров, как показано на рисунке 2D-F (8 недельных культуры), они могут быть вырезан вручную, как показано на фиг.3А. Тщательное удаление, чтобы избежать загрязнения с не-РПЭ клеток значительно облегчают создание достаточно чистых ПЭС культур (3В-C).
Рисунок 1: схематическое изображение IPS-НПП вывод Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: активин A А.Н.д IDE-1 увеличить выход IPS-ПЭС. (А) Небольшие пигментированные колонии начинают появляться после семи недель в культуре спонтанно между не-RPE клеток в одном листе, который прилегает к нижней части 6-луночного планшета (в некоторых отмечены стрелками). (В и С) Дополнение с IDE-1 или Activin А приводит к появлению еще более пигментированные колонии (некоторые обозначены стрелками в переменного тока) демонстрирует, что добавки с обеих активин А или IDE-1 повышает НПП дифференциация. (DF) После 8 недель влияние пищевых добавок с IDE-1 или активин А еще более выраженным. Оба числа и размеров пигментных островков больше, после направленной дифференцировки. Шкала бар = 5 мм
Рисунок 3: Расширение и терминальной дифференцировкипигментные IPS-НПП. () Представитель образ пигментированной IPS-НПП колонии, что является достаточно большим, чтобы акциза. Номера окружают клетки ПЭС колонию в нижней части 6-луночный планшет с. Синий контур обозначает область, которая будет удалить. (B) изображение после вырожденных незрелые IPS-RPE клеток в культуре после первой стадии расширения. (С) два месяца терминально дифференцированные клетки IPS-ППД. Обратите внимание на наличие границ очевидных клеток и однородных уровней пигментации, демонстрирующих передовые дифференциации. Масштабные линейки = 100 мкм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы опишем шаги, чтобы эффективно генерировать большое количество чистых культур IPS-РПЭ. Ранее нами было показано с помощью указанного направленного протокол дифференцирование активин А что мы можем генерировать IPS-РПЭ, которые сильно напоминают hRPE на основе транскриптомика, протеомики, метаболомике и функциональности, и что они замедляют дегенерацию сетчатки при имплантации в RCS крыс 12,31,32 , Процесс формирования IPS-РПЭ является трудоемким, но не трудоемкий (Рисунок 1). После того, как культуры плюрипотентных достичь слияния они должны быть поданы с среде для дифференцировки на ежедневной основе. Мы дополнение носитель либо активин А или менее дорогой IDE-1 маленькая молекула, и продолжают кормить в течение двух недель при мониторинге культур для пигментированных колоний IPS-ПЭС, которые обычно возникают после 5-7 недель (Фиг.2А-С). После достижения достаточного размера (рис 2D-F и 3А), колоныES вручную удалены и переносили в новые пластин для расширения. Это происходит примерно через 8 недель и наиболее трудоемким этапом всей протокола.
Наиболее сложным аспектом является избежание загрязнения с не-РПЭ клеток в расширяющейся культур, случайно сбора ненужных соседние клетки в или вокруг пигментных колоний. В зависимости от степени загрязнения, островки без ПЭС клеток можно удалить вручную при расширении, хотя каждый раз культур обрабатываются дополнительные риски введения бактериальных или грибковых загрязняющих веществ увеличиваются. Стоит отметить, что в нашем опыте IPS-НПП самом деле может "вытеснить" небольшое количество загрязняющих клеток во время стадий пересева. Но мы настоятельно рекомендуем большую осторожность при выборе колонии, чтобы они были как можно более чистым, чтобы избежать необходимости прибегать к этим шагам. Ко второй или третий проход культуры IPS-РПЭ достаточно чистый и для недопущения измененияциент число клеток доступны для характеризации и имплантации.
Техника сообщили здесь, конечно, не единственный способ для получения стволовых клеток, полученных НПП. На самом деле это не является ни простой, ни быстрым. Самый простой и наиболее широко метод заключается в использовании спонтанной дифференцировке. (Тем не менее, добавки с IDE-1 в течение двух недель недорого и значительно повышает урожайность IPS-ППД.) IPS-НПП также породили в эмбриональных органов, которые дифференцируются в сферах поляризованных клетках ПЭС, которые могут быть вынуждены придерживаться поверхности культуральные планшеты и расширить в виде монослоя. Клетки ПЭС генерировать с помощью этого метода были также очень энергично характеризуется и настоятельно напоминают hRPE 27. НПП могут дифференцироваться чрезвычайно быстро (всего за 14 дней) из стволовых клеток, дополняя СМИ с никотинамида, IGF1, Noggin, Dkk1 и bFGF преобразовать их в нейронных сетчатки судьбы предшественников, а потом добавив про-РПЭ факторы никотинамид Ай Activin 37. НПП также могут быть получены даже быстрее, непосредственно из фибробластов в течение приблизительно одного месяца по трансдукции фибробластов с минимальным набором факторов транскрипции, в том числе CMYC, MITF, Otx2, RAX, и CRX 44. Тем не менее, в то время как эти результаты являются весьма обнадеживающими ПЭС генерируется эти последние две методики еще не были тщательно характеризуется имплантации их в естественных условиях. Таким образом, мы предполагаем, что читатель рассмотреть все варианты НПП деривационных тщательно при выборе использовать в своих исследованиях.
Преимущества использования протокола изложенной здесь являются его простота и стабильно высокие урожаи очень высокого качества ПЭС 31. Дополнение с IDE-1, а не активин А значительно снижает общую стоимость и снижает риски, связанные с использованием рекомбинантных белков. Так как еще не ясно, если выбор использовать различные методы дифференциации будетвоздействие на конечный продукт, это может быть выгодно использовать стандартные протоколы, особенно если прямое сравнение между ПЭС, генерируемого в различных лабораторий необходимо (возможно, в частности, в случае моделирования болезни). Простой протокол как этот, который требует большого опыта и реагенты, и что порождает высокий выход IPS-ПЭС, может быть идеальным для таких ситуаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
- Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
- Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
- Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
- Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
- Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
- Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
- Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).
