Effektiv Derivering av näthinnans pigmentepitel celler från stamceller

Protocol

1. riktad differentiering av stamceller som härrör RPE

NOTERA: Alla inkubationssteg genomförs vid 37 ° C i 5% CO ₂

1. Behåll hES eller höfter linjer (foder dagligen) i underhållsmedier (MM, Tabell 1). När linjerna har nått tillräckliga normer för kvalitetskontroll, underhålla dem på ett lager av mus embryonala matarceller (MEF) såddes vid en densitet av 250.000 / brunn av en sex brunnar. Xeno fria kulturer kan också genereras efter protokollet fastställts av Tucker et al. ^40.
2. Låt stamcellskolonier att växa samman.
3. Växla till differentiering media med Nikotinamid (DM / NIC, Tabell 1); foder dagligen.
4. Efter tre veckor i kultur, byta till differentiering media med nikotinamid och antingen Aktivin-A eller IDE-1 (DM / NIC / AA eller DM / NIC / IDE1, Tabell 1) för att öka RPE differentiering. Efter fem veckor i kultur, växla tillbaka till DM / NIC. Dagliga matning är inte längre nödvändiga när pH-indikatorer i media stopp gulna dagen efter utfodring.
5. Vänta holmar av pigmenterade celler att visas som är stora nog att skäras och avlägsnas (se figur 2D-F och 3A).

2. Infångning Pigmente Islets

1. Coat brunnarna i en 24-brunnar med en matris som efterliknar den naturliga cellmiljön (xeno-fria är att föredra).
   OBS: Cornea blad och skarpa, spetsig pincett är mycket användbara för att plocka. Hela arket av differentierade celler kan lossna samtidigt plocka. Undvik detta genom att arbeta noggrant och initialt plocka kolonier i mitten av skålen.
2. Fyll så många brunnar i 24-brunnar med differentiering media (DM, Tabell 1) som behövs. Beslutet kommer att bero på antalet pigmente kolonieruppsamlades.
3. I en cellkultur huva med en dissekera omfattning, skär manuellt ut pigmente holmar. Chop upp varje ö vid botten av den ursprungliga plattan med användning av en skalpell i ca 2-6 bitar och greppa de pigmente delar med vassa pincett.
4. Överför 1-2 pigmente bitar i varje 24-brunn.
5. Ändra inte media i 3-5 dagar tills cellerna fäster, sedan börja föränderliga medie tre gånger per vecka. (Om de inte fastnar efter denna tid, är sannolikheten bra att de aldrig kommer).
6. Expandera celler i 3-4 veckor i differentieringsmedia (DM, Tabell 1) - En bild av en typisk kultur visas i figur 3B. Celler kan fortfarande inte fylla hela bra men vänta längre verkar inte hjälpa. Feed celler tre gånger per vecka.
7. Efter ca 3 veckor, manuellt ta bort kluster av vita blodkroppar i klumpar om nödvändiga med vassa pincett. Gör inte detta steg om det inte är nödvändigt - det är lätt att införa föroreningar. Den är idealisk förförsöka få renaste populationer av RPE från de ursprungliga pigmente kolonierna i steg 1.6.

3. Passaging Stamcells-derived RPE

1. Drag av celler med 200 | il med en cell dissociationslösning (företrädesvis inte trypsin-ett reagens som kan inaktiveras genom utspädnings är att föredra) för 5-8 minuter vid 37 ° C, och inaktivera den genom utspädning med DM. Använd en 200 l pipett att tvätta bort alla celler och resuspendera dem (Om det valda väl innehåller endast ett fåtal celler, överväga sammanslagning cellerna från två 24-brunnar).
2. Centrifug (800 xg under 5 minuter), kassera supernatanten och återsuspendera i 3 ml DM media.
3. Återplattceller från en (eller två) 24-brunnar i en matris belagd 6 brunnar i 3 ml DM per brunn (1: 5 expansion).
4. Expandera i 1-2 veckor tills cellerna är ~ 90% sammanflytande; en bild av fullt differentierade renkultur visas i figur 3C.
5. Drag av celler med en ml cell dissociation lösning för ca 5-8 minuter vid 37 ° C, inaktivera det genom utspädning med DM, använd 1.000 l pipett att tvätta bort alla celler, och resuspendera dem.
6. Spinn ner (800 xg under 5 min), kassera supernatanten och återsuspendera i 18 ml DM media.
7. Återplatt celler från en 6-väl varje i sex matris belagd 6-brunnar i 3 ml DM per brunn (1: 6 expansion) eller en belagda 75cm ² kolv (1: 7,5 expansion).
8. Upprepa steg 3,4-3,8 vid behov tills tillräckligt många celler erhålls.
   OBS: Försök att samla så många kolonier som möjligt expansions stället planerar att förstärka kulturens via passage eftersom varje passage inducerar RPE dedifferentiering.

Representative Results

De steg som beskrivs i detta manuskript, som visas i figur 1, kan användas för att enkelt generera RPE från stamceller som tidigare rapporterats ^10,12. Efter upprätthålla iPS linjer för flera veckor, pigmente kolonier börja visas i kolonierna efter 5-7 veckor (7 veckor gamla kulturer visas i figur 2A-C). Dessa kolonier kan fortsätta att växa i veckor eftersom kulturerna bibehålls. När når tillräckliga storlekar, såsom visas i figur 2D-F (8 veckor gamla kulturer), kan de manuellt excideras såsom illustreras i figur 3A. Noggrann excision för att undvika kontaminering med icke-RPE-celler kommer att kraftigt underlätta generation tillräckligt rena RPE kulturer (Figur 3B-C).

Figur 1: Schematisk föreställande iPS-RPE härledning klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Aktivin A end IDE-1 öka utbytet av iPS-RPE. (A) Små pigmente kolonier börja visas efter sju veckor i kultur spontant mellan icke-RPE celler i ett enda ark som är anhängare till botten av en 6-brunnar (vissa är markerade med pilar). (B och C) Tillskott med IDE-1 eller Activin A resulterar i uppkomsten av ännu mer pigmente kolonier (några är markerade med pilar i AC) visar att tillskott med antingen Activin A eller IDE-1 förstärker RPE differentiering. (DF) Efter 8 veckor effekterna av tillskott med IDE-1 eller Activin A är ännu mer uttalad. Både antalet och storleken på de pigmenterade holmar är större efter riktad differentiering. Skalstreck = 5 mm

Figur 3: Expansion och terminal differentiering avpigmente iPS-RPE. (A) representant bild av en pigmenterad iPS-RPE koloni som är tillräckligt stor punkt. Icke-RPE-celler omger kolonin i botten av en 6-brunnars platta. Den blå kontur markerar regionen som skulle skäras. (B) Bild av post-sammanflytande omogna iPS-RPE-celler i odling efter den första expansionssteget. (C) Två månader gamla terminalt differentierade iPS-RPE-celler. Notera förekomsten av uppenbara cellgränser och homogena halter av pigmente visar avancerad differentiering. Skalstrecken = 100 ^ m

Discussion

I detta manuskript redogör vi stegen för att effektivt skapa stora mängder rena iPS-RPE kulturer. Vi har visat tidigare att använda denna riktad differentiering protokoll med Aktivin A som vi kan generera iPS-RPE som starkt påminner hRPE utifrån transkriptomik, proteomik, metabolomik och funktionalitet, och att de fördröja näthinnedegeneration vid implantation på RCS råttor ^12,31,32 . Processen att skapa iPS-RPE är tidskrävande, men inte arbetskrävande (Figur 1). När iPS kulturerna växa samman de måste matas med differentiering medier dagligen. Vi kompletterar media med antingen Activin A eller ett billigare liten molekyl IDE-1, och fortsätt mata i två veckor under övervakning kulturerna för pigmente iPS-RPE kolonier som vanligtvis dyker upp efter 5-7 veckor (Figur 2A-C). När når tillräckliga storlekar (Siffrorna 2D-F och 3A), den colonies manuellt avlägsnas och överförs till nya plattor för expansion. Detta inträffar ungefär efter 8 veckor och är den mest arbetskrävande steg i hela protokollet.

Det mest utmanande aspekten är att undvika kontaminering med icke-RPE celler i de expanderande kulturerna genom oavsiktligt samla oönskade grannceller i eller runt pigmente kolonierna. Beroende på graden av förorening, kan öar av icke-RPE-celler tas bort manuellt under expansion, även om varje gång kulturerna hanteras ytterligare risk för införande av bakteriella eller fungala föroreningar ökar. Det är värt att notera att i vår erfarenhet IPS-RPE kan faktiskt "konkurrera ut" ett litet antal förorenande celler under passagemuffen steg. Men vi rekommenderar att ta stor försiktighet när plocka kolonier för att se till att de är så ren som möjligt för att undvika att behöva ta till dessa steg. Genom den andra eller tredje passagen IPS-RPE kulturer är tillräckligt rena och i tillräckligeffektiva antal celler är tillgängliga för karakterisering och implantation.

Tekniken rapporteras här är verkligen inte den enda metoden för att härleda stamceller härstammar RPE. I själva verket är det varken det enklaste eller snabbaste. Det enklaste och mest allmänt metoden är att använda spontan differentiering. (Dock är tillskott med IDE-1 för två veckor billig och kraftigt ökar utbytet av iPS-RPE.) IPS-RPE har också genererat i embryoidkroppar som skiljer i sfärer av polarise RPE-celler som kan tvingas att ansluta sig till ytan av odlingsplattor och expandera som ett monolager. RPE-celler genererar med denna metod har också mycket kraftigt karaktäriseras och starkt likna hRPE ^27. RPE kan skilja väldigt snabbt (på bara 14 dagar) från stamceller genom att komplettera medierna med nikotinamid, IGF1, Noggin, Dkk1 och bFGF att konvertera dem till neurala retinal gångar öden, sedan senare sätta den pro-RPE faktorer nikotinamid and Activin A ^37. RPE kan också genereras ännu snabbare direkt från fibroblaster i ungefär en månad genom transduktion fibroblaster med en minimal uppsättning av transkriptionsfaktorer, inklusive cMYC, MITF, OTX2, RAX och CRX ^44. Men även om dessa resultat mycket uppmuntrande RPE genererade dessa sista två tekniker har ännu inte rigoröst präglas av implanterar dem in vivo. Därför föreslår vi att läsaren överväga alla RPE härledning alternativ noga när man beslutar vilka anställa i sina studier.

Fördelarna med att använda det protokoll som beskrivs här är dess enkelhet och konsekvent höga utbyten av mycket hög kvalitet RPE ^31. Tillskott med IDE-1 istället för Aktivin A minskar kraftigt den totala kostnaden och minskar riskerna med att använda rekombinanta proteiner. Eftersom det ännu inte är klart om valet att använda olika differentieringsmetoder kommer att haen inverkan på den slutliga produkten, kan det vara fördelaktigt att utnyttja standardiserade protokoll, särskilt om direkta jämförelser mellan RPE genereras i olika labb kommer att bli nödvändigt (kanske särskilt i fallet med sjukdomsmodellering). En enkelt protokoll som denna som kräver lite kunskap och reagenser, och som genererar hög avkastning av iPS-RPE, kan vara perfekt för dessa situationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corneal knife	Surgipro	SPOI-070	knife x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Recombinant Human/Murine/Rat Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Plates	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml	Corning	431475	Case(12) x 1