Abstract
يتم إنشاء الفئران والمريء البشري myofibroblasts عن طريق الهضم الأنزيمي. يتم حصاد الوليد (8-12 يوم من العمر) المريء الفئران، مفروم، وغسلها، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة 25 دقيقة. يتم تجريد العينات استئصال المريء الإنسان للالمخصوصة العضلية والبرانية ومفروم الغشاء المخاطي المتبقية، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة تصل إلى 6 ساعات. الخلايا المستزرعة تعبر α-SMA وفيمنتين وdesmin صريح ضعيفة أو لا على الاطلاق. الظروف الثقافة ليست مواتية لنمو طلائي، المكونة للدم، أو الخلايا البطانية. تأكيد ثقافة نقاء مزيدا من تدفق تقييم cytometric من سطح الخلية علامة التعبير من المحتمل المكونة للدم تلويث والخلايا البطانية. تقنية الموضحة واضح ومباشر والنتائج في جيل ثابت من غير hematopoieitc، خلايا انسجة غير البطانية. القيود المفروضة على هذه التقنية هي الملازمة لاستخدامالثقافات الأولية في دراسات البيولوجيا الجزيئية، أي تقلبات لا مفر منه اجه بين الثقافات أنشئت في جميع أنحاء الفئران أو البشر مختلفة. لكن الثقافات الأولية هي انعكاس أكثر تمثيلا للدولة في الجسم الحي بالمقارنة مع خطوط الخلايا. هذه الأساليب أيضا توفير المحققين القدرة على عزل والخلايا الثقافة انسجة من الحالات السريرية والتجريبية المختلفة، ويتيح إجراء مقارنات بين المجموعات. ويمكن أيضا خلايا انسجة المريء تتميز استخدامها في الدراسات وظيفية التحقيق التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المريء.
Introduction
وتشارك التفاعلات الظهارية اللحمية في تنظيم مجموعة متنوعة من الوظائف الجهاز الهضمي بما في ذلك تجديد الغشاء المخاطي، وإصلاح، والتليف، والتسرطن 1،2. وكانت هذه التفاعلات أفضل درس في الأمعاء الدقيقة والقولون وربما تلعب بالمثل دورا في اضطرابات المخاطية للمريء 3. وقد تجلى جزء من السكان من myofibroblasts الخلايا اللحمية المعوية والقولون ووصف للمشاركة في التوسط إصابة الأنسجة، والتهاب وإصلاح 4،5. في الجهاز الهضمي البعيدة، وهذه الخلايا المغزل على شكل يقع بالقرب من الغشاء القاعدي في واجهة بين الظهارة والصفيحة المخصوصة وتعرف بأنها α-SMA وفيمنتين إيجابية، لعموم cytokeratin سلبية، وإيجابية ضعيفة أو desmin سلبي 5.
لم يتميز سدى المريء بصرامة على المستوى الخلوي أو الجزيئي. عملنا في المريء الفئران وديmonstrated α-SMA وفيمنتين الخلايا في سدى المريء، تحتاني في بعض الأحيان إلى ظهارة الحرشفية 6. قد تورطت التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المخاطية للمريء مثل المعدي المريئي بوساطة إصابة 6 والتهاب المريء اليوزيني 3. القيود تليفي هي أيضا من المضاعفات المعروفة للخلايا الإصابة وانسجة المريء قد تورطت في التسبب في التليف الهضمي. سوف عزل هذه الخلايا تساعد في إنجاز الدراسات اللازمة للتحقيق في مسارات الإشارات مختل.
يوفر هذا التقديم التقنيات اللازمة لإنشاء الثقافات الأولية من α-SMA، myofibroblasts إيجابية فيمنتين الايجابية ان هذه الفجوات القائمة في المعرفة بشأن مسارات إشارات تتوسط هذه التفاعلات يمكن معالجتها. تقنية الموضحة وقد استخدم بنجاح من قبل المؤلفين لإنشاء الأولية myofibroblasts القولون الفئران (7) وابعد من ذلكص تكييفها لإنشاء الفئران وخلايا انسجة 6 المريء مثل الأرومة الليفية العضلية الإنسان.
هنا نحن تصف الشروط اللازمة لإنشاء وتميز هذه الثقافات أنشئت من الماوس أو المريء البشري قبل استخدامها في الدراسات الوظيفية المستقبلية. الثقافات يمكن زراعتها والاستفادة منها لمدة تصل إلى 15 الممرات. العزلة وإنشاء الثقافات الأولية عن طريق الأساليب المذكورة أدناه يولد خلايا انسجة مع النمط الظاهري الأرومة الليفية العضلية. α-SMA، فيمنتين إيجابي، وإيجابي ضعيف أو سلبي لdesmin، وcytokeratin سلبي. هذا النمط الظاهري يختلف عن النمط الظاهري من الخلايا الليفية المريء والتي هي في الغالب إيجابية فيمنتين، α-SMA سلبي 3 أو α-SMA إيجابي، فيمنتين النمط الظاهري السلبي للالعضلية المخاطية 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، والأساس المنطقي وأهداف البحث، وتمت الموافقة عليها من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
وتمت الموافقة على بروتوكول لإنشاء الثقافات الأولية من إلغاء تحديدها-العينات المريء الإنسان من جامعة جنوب كاليفورنيا مجلس المراجعة المؤسسية.
1. الحصول على الماوس أو المريء الإنسان
- الحصول ماوس المرئ:
- الموت ببطء الماوس القديم 8-12 يوم مع 2٪ جرعة زائدة المستنشق الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم.
- دبوس الحيوان أسفل البطن مع مواجهة والرطب السطح البطني مع الايثانول 70٪. بالملقط، والاستيلاء ورفع الأمامي الجلد لفتح مجرى البول بالملقط. استخدام مقص جراحي القياسية على التوالي لقطع على طول خط الوسط بطني من فتح مجرى البول إلى الذقن. كن حذرا لقطع فقط الجلد. </ لى>
- إجراء شق من مجرى البول فتح الأسفل إلى الركبة على جانبي الحيوان، وتشكيل رأسا على عقب "Y". جعل شق آخر على جانبي الحيوان على طول القفص الصدري.
- قشر بعناية الجلد على كلا الجانبين، الخروج من الغشاء البريتوني الكامنة والقفص الصدري، ووضع على الجانبين. دراسة القفص الصدري المغطي التجويف الصدري والصفاق المغطي تجويف البطن.
- رفع الصفاق مع ملقط وقطع طريق ليصل إلى الحجاب الحاجز والقفص الصدري، مشيرا مقص التصاعدي لمنع تلف محتويات البطن. رفع بلطف صعودا الفص الأيسر من الكبد، وفضح المعدة الأساسية، تقاطع-المريء المعدة والجزء البطني من المريء.
- استخدام مقص جراحي تعقيمها لقطع طريق القص والقفص الصدري على طول خط الوسط حتى حزام عنق الرحم. مقص نقطة صعودا لمنع الأضرار التي لحقت محتويات الصدرية. كشف تماما عن محتوياتالتجويف الصدري عن طريق سحب القفص الصدري على الجانبين.
- بلطف إزالة القلب وكل من فصوص الرئة. امتصاص الدم الزائد مع Q-النصائح. المريء الصدري هو ضيق، أنبوب الكذب مرنة الخلفي إلى القصبة الهوائية والأمامي إلى الفقرات الصدرية.
ملاحظة: المريء يمكن أن يكون من الصعب تحديد في حديثي الولادة الفئران. توطين تقاطع-المريء المعدة يجعل تحديد المريء واضحة. - اتبع بعناية المريء من المعدة، تشريح الأوعية الدموية المحيطة بها، والدهون ومساريق على طول الطريق حتى إلى الأصل المريء في تجويف الرحم. مقص جراحي مع تلميح حادة تعمل على أفضل وجه لهذا الغرض.
- بتر كامل طول المريء ومكان في هانكس "محلول ملحي متوازن (HBSS) لمزيد من المعالجة هو موضح أدناه. إزالة جزء من المعدة لأغراض التوجه اذا شئت.
ملاحظة: نظرا لحجم الأنسجة صغير، والفصل بين العضلية المخصوصة من العضلاتهو الغشاء المخاطي ليست قابلة للتحقيق في الفئران حديثي الولادة المريء ويخضع المريء كامل لمعالجة موضح أدناه.
- الحصول على المرئ الإنسان:
- غسل العينات استئصال المريء (عادة 5 سم أو أقل) مع HBSS وإزالة أي تعلق النسيج الضام، والدهون، أو الأوعية الدموية.
- بتر جزء من العينة ووضعها في الفورمالين لفحص نسيجية في المستقبل اذا شئت.
- فصل ما تبقى من الغشاء المخاطي من الأساسي العضلية المخصوصة التي كتبها تشريح حاد.
- قطع الغشاء المخاطي إلى أجزاء سنتيمتر الفرعية وتخضع لبروتوكول موضح أدناه.
ملاحظة: استئصال المريء الإنسان يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 6 ساعات قبل تجهيزها موضح أدناه. سوف مصدر العينات المريء تملي حجم العينة، وسوف يكون المختبر معتمدا.
2. عزل الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا
- عزل خلايا انسجة المريء والفئران مدمج والأنسجة البشرية من خلال مزيج من الهضم الميكانيكي والأنزيمية.
- هضم ميكانيكيا بواسطة تنميق الأنسجة مع مقص ويغسل متعددة مع HBSS. هضم إنزيمي التي يحتضنها الأنسجة مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة (الأنسجة الفئران) أو لمدة تصل إلى 6 ساعات (الأنسجة البشرية). التأكد من أن الأدوات المستخدمة في تنميق تم تعقيمها وتعقيم.
ملاحظة: Collagenases هي الانزيمات التي تفتت الكولاجين، وهو البروتين مصفوفة خارج الخلية مسؤولة عن عقد الأنسجة الحيوانية معا. كولاجيناز الحادي عشر ديه نشاط كولاجيناز عالية وشهدت نجاحا في هذا البروتوكول العزلة. Dispase هو الإنزيم البكتيري معتدلا مع النشاط التفكك بروتين أن يحافظ على خلية نشاط الغشاء ويستخدم في تركيبة مع كولاجيناز كما انزيم الثانوي. - وضع شظايا المخاطية تم الحصول عليها من الماوس أو الأنسجة البشرية في 1.7 مل الصغيرة الطرد المركزي أو 5 مل أنابيب على التوالي، التي تحتوي على HBSS. نسيج اللحم المفروم مزيدإلى 2-3 مم القطع باستخدام مقص مع عرض غيض مفتوحة من شأنها أن تناسب أنابيب منها. يتيح وقتا كافيا للسماح للشظايا الغشاء المخاطي للمريء إلى الرواسب في قاع الأنبوب.
- صب ببطء HBSS، والحرص على عدم تجاهل عن غير قصد الأنسجة. استبدال HBSS الطازجة التالية عن طريق هز لطيف. بدلا من ذلك، إزالة HBSS مع ماصة 1 مل.
- غسل الأنسجة بهذه الطريقة ما مجموعه 8 مرات مع لطيف تهتز في بين يغسل يتيح وقتا لشظايا المريء على الرسوبيات بين كل غسل.
ملاحظة: الأنسجة البشرية سيتطلب أكثر تنميق أن الأنسجة الوليد الماوس.
- هضم ميكانيكيا بواسطة تنميق الأنسجة مع مقص ويغسل متعددة مع HBSS. هضم إنزيمي التي يحتضنها الأنسجة مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة (الأنسجة الفئران) أو لمدة تصل إلى 6 ساعات (الأنسجة البشرية). التأكد من أن الأدوات المستخدمة في تنميق تم تعقيمها وتعقيم.
- احتضان الأنسجة الفئران مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الأنسجة البشرية مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة تصل إلى 6 ساعات، على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: توفر esopha البشريجوس هو متغير. الغشاء المخاطي المريء البشري حضنت مع الانزيمات لمدة تصل إلى 6 النتائج ساعة في جيل ناجح من الثقافات الأولية.
- احتضان الأنسجة البشرية مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة تصل إلى 6 ساعات، على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الهضم الأنزيمي، اللحم المفروم الأنسجة أكثر مع مقص والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة.
- تجاهل طاف. نقل بيليه، ويتكون من تعليق الخلية المختلطة إلى أنبوب 5 مل ويغسل 5 مرات في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 2٪ السوربيتول للقضاء على خلايا غير قابل للحياة والحطام.
- خلايا البذور في 6 لوحات جيدة والثقافة في DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 10 ملغ / مل الأنسولين، و 10 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و2 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) . مرشح فراغ (0.22 ميكرون) جميع المكونات باستثناء EGF التي يمكن أن تضاف بعد الترشيح. توزيع الخلايا التي تم الحصول عليها من العينات استئصال الإنسان بين متعددة 6 لوحات جيدا، وهذا يتوقف على حجم الاستئصال الجزئي.
- مرة واحدة الآبار هي 80٪ متموجة، مرور الخلايا الملتصقة إلى T25 قارورة لناجي 0.05٪ التربسين / حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA). تحييد مع وسائل الإعلام وتدور في 400 ز س.
- لمرور 6 جيدا لقارورة T25، وخلايا مرور في نسبة 1: 1. يمكن passaged قوارير متكدسة T25 في 1: 2 أو 1: 3 نسبة. إلى الانتقال من قارورة T25 إلى قارورة T75، استخدم نسبة 1: 1. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام بغض النظر عن السفينة.
- زراعة خلايا في 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة والثقافة في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية المذكورة أعلاه.
ملاحظة: الخلايا الظهارية لا البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف ثقافة أو المرور. الخلايا المستخدمة لتوصيف والدراسات المبينة أدناه هي بين الممرات 5 و 15. - البرد الحفاظ على الخلايا في السائل N 2 وذلك بإضافة 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية.
3. تميز الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا
- دراسة مورفولوجيا الخلايا مع مجهر مقلوب. مراقبة على شكل المغزلمورفولوجيا الخلايا الملتصقة (الشكل 1).
- تميز الخلايا المستزرعة التي كتبها تقييم علامات هيكل الخلية التالية: α-SMA، فيمنتين، desmin، وcytokeratin. خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية تعبر عن علامات الأرومة الليفية العضلية هيكل الخلية α-SMA وفيمنتين (الشكل 2).
- الاستمرار في تمييز الخلايا اللحمية مثقف من خلايا العضلات، immunostain لdesmin. لأداء المناعية على خلايا مثقف، لوحة 1.5 × 10 4 خلايا في الشرائح غرفة 4-جيدا وتنمو في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية لمدة 24 ساعة. سوف خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية يكون ضعيفا أو غائبا التعبير desmin. خلايا انسجة تفتقر التعبير عن علامة الظهارية عموم cytokeratin (لا تظهر البيانات).
ملاحظة: يتضمن تقييم الثقافات تقييم علامات هيكل الخلية التي كتبها مناعية وسطح الخلية علامات التدفق الخلوي. يستخدم مناعية كطريقة الرئيسي لتوصيف مثل السابقالملف الشخصي PRESSION من البروتينات هيكل الخلية هي فريدة من نوعها لالليفية، الأرومة الليفية العضلية أو الخلايا العضلية. يؤسس التدفق الخلوي ثقافة النقاء من خلال تقييم خلية التعبير سطح الظهارية، البطانية، والخلايا المكونة للدم علامات. CD90 مفيد كطريقة مرافقة من تحديد خلايا انسجة الإنسان كما يعبر عنه على كل من الخلايا الليفية الإنسان وmyofibroblasts. CD90 ليست مفيدة في توصيف خلايا انسجة الفئران كما أعرب أيضا عن طريق خلايا T الفئران.
- الاستمرار في تمييز الخلايا اللحمية مثقف من خلايا العضلات، immunostain لdesmin. لأداء المناعية على خلايا مثقف، لوحة 1.5 × 10 4 خلايا في الشرائح غرفة 4-جيدا وتنمو في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية لمدة 24 ساعة. سوف خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية يكون ضعيفا أو غائبا التعبير desmin. خلايا انسجة تفتقر التعبير عن علامة الظهارية عموم cytokeratin (لا تظهر البيانات).
- بعد خلايا تصل إلى 60٪ التقاء، وشطف الشرائح مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإصلاح مع الميثانول. احتضان الخلايا في الميثانول لمدة 10 دقيقة في -20 ° C، ثم تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- اتبع بروتوكول المناعية القياسية.
- لفترة وجيزة، قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية، منع خلايا ثابتة مع 5٪ goatserum في برنامج تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 5٪ مصل الماعز أيضا.
- للكشف عن α-SMA وفيمنتين، استخدمالأجسام المضادة التالية وتركيزات: الفأر MAB إلى α-SMA في 1: 250 التخفيف والأرنب PAB إلى فيمنتين في 1: 500 التخفيف.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية رودامين مترافق الماعز المضادة الماوس في التخفيف من 1: 200 وCy2 الماعز مترافق مكافحة الأرنب في التخفيف من 1: 1،000 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- نوى مباين مع 4 "، 6-Diamidino-2Phenylindole (دابي) بتركيز 1 ميكروغرام / مل لمدة 1 دقيقة ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني. تحليل الشرائح مع مجهر مقلوب.
- إنشاء نقاء الثقافات عن طريق الفحص من خلايا المريء الفئران والإنسان للدم (CD45) والبطانية (CD31) علامات سطح الخلية عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 3). تميز الخلايا البشرية مزيدا من التعبير عن الخلية انسجة علامة السطحية CD90.
ملاحظة: CD90 لا يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا اللحمية الفئران كما الفئران T سلليرة سورية أيضا التعبير عن CD90.- فصل خلايا فأر المريء انسجة مثقف من قوارير الثقافة عن طريق العلاج مع خلية غير الأنزيمية التفكك الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وغسلها مع العازلة FACS مرتين، عد وملطخة FITC-CD45 وAPC-CD31 مع الضوابط نمط إسوي ذات الصلة، وفقا لتلطيخ الاجراءات القياسية.
- جمع الخلايا باستخدام FACS بنات كوول وتحليل البيانات مع برنامج FlowJo. قبل خلايا تلطيخ، وتحسين الأجسام المضادة ويعاير تركيزات باستخدام عناصر تحكم نمط إسوي والطحال الماوس العادي، وخلايا نخاع العظام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا انسجة المريء معزولة باستخدام الهضم الميكانيكي والأنزيمية ومطلي في البداية ومثقف في 6 لوحات جيدة. فحص الخلايا مع مجهر مقلوب في غضون ساعات من الطلاء يوضح تعليق خلية مختلطة ملتصقة فضفاضة لوحة أسفل (الشكل 1A). على مدى ساعة 24 المقبلة، ويلاحظ خلايا على شكل مغزل ملتصقة بقوة إلى أسفل لوحة اطلاق النار من تعليق الخلية المختلطة (الشكل 1B) .هذه تغطي الخلايا تنتشر في المنطقة بأكملها من بئر تقع ضمن نطاق 5 أيام ويمكن passaged بنجاح، والإبقاء على التشكل لا يقل عن 15 الممرات. لوحظ الخلايا الملتصقة المغزل على شكل في منخفض الكثافة (الشكل 1C) وعندما شبه متموجة (1D الشكل).
المناعية الثقافات الأولية للخلايا انسجة المريء تزرع في الشرائح غرفة يوضح التعبير وفيرة من علامات الأرومة الليفية العضلية هيكل الخلية α-SMA وفيمنتين (الشكللدى عودتهم 2)، والتعبير ضعف desmin، وcytokeratin غائبا.
الثقافات الأولية من myofibroblasts المريء يمكن فحص كذلك على نقاء الخلية عن طريق فحص للدم وعلامات سطح الخلية البطانية. وأنشئت إلى الأمام والجانب مبعثر لخلايا المريء الفئران الأولية انسجة تليها النابضة وتحليل الخلايا الحية للبروتينات سطح الخلية (الشكل 3A). خلايا انسجة المريء الفئران الأولية تفتقر التعبير عن CD45 المكونة للدم (الشكل 3B) والخلايا البطانية CD31 (الشكل 3C) علامات سطح الخلية.
الشكل 1: الثقافات الأولية من خلايا انسجة المريء الفئران في ممرات مختلفة فحص خلايا انسجة الفئران مع مجهر مقلوب في غضون ساعات من العزلة والطلاء يدل على مجموعة من م مختلطةLLS الخلايا الملتصقة فضفاضة إلى أسفل لوحة (A). بعد 24-48 ساعة في الثقافة، والخلايا على شكل مغزل تنبت من الكتلة الآن ملتصقة (B). استمر مورفولوجيا المغزل على شكل خلايا ملتصقة في انخفاض (C) وعالية (D) الكثافة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. (الأرقام المستخدمة بإذن من شاكر وآخرون 6).
الشكل 2: خلايا انسجة المريء الفئران التي تزرع في الثقافة الابتدائية تعبر عن علامات الأرومة الليفية العضلية α-SMA وفيمنتين كانت تزرع خلايا انسجة المريء الفئران الأولية على الشرائح غرفة وimmunostained لα-SMA وفيمنتين في معتدلة (AC) ومنخفض الكثافة (DF). Esophageaخلايا انسجة ل تعبر عن بوفرة α-SMA (A، D) وفيمنتين (B، E). خلايا انسجة المريء الفئران شارك في التعبير عن هذه العلامات الأرومة الليفية العضلية (C، F). (الأرقام المستخدمة بإذن من شاكر وآخرون 6). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الثقافات الأولية للخلايا myofibroblasts المريء الفئران تفتقر المكونة للدم وعلامات سطح الخلية البطانية المؤامرة نقطة من خلايا انسجة المريء الفئران، يدل على FSC وخصائص التعاون بين بلدان الجنوب من هذه الفئة من السكان من الخلايا.. تم بوابات ما مجموعه 32.4٪ من أحداث (A)، وجرى تقييم التعبير عن المكونة للدم (CD45) والبطانية (CD31) علامات سطح الخلية من قبل أنا واحدmmunostain وفقا لبروتوكولات تلطيخ القياسية. تم تحديد تلطيخ غير محدد لكل الأجسام المضادة باستخدام عناصر تحكم نمط إسوي. الثقافات الأولية للخلايا انسجة المريء الفئران لا تعبر عن CD45 (B) أو CD31 (C). FSC: مبعثر إلى الأمام. SSC: الجانب مبعثر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنيات لتوليد ثقافة الأساسي متشابهة عموما عند استخدام أنسجة الفئران أو الإنسان مع تنميق والهضم مرات تكييفها لحجم الأنسجة. تجربتنا مع الأنسجة الفئران تشير إلى أن استخدام الأساليب المذكورة أعلاه يؤدي باستمرار في إنشاء الناجح للثقافات الأولية. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول تعقيم المعدات الجراحية والتقنيات التالية معقمة القياسية للزراعة الأنسجة. عمر الفئران هو أيضا خطوة حاسمة. 8 - حديثي الولادة القديمة 12 يوما تسفر باستمرار الثقافات الأولية الناجحة. لم لم يتم إنشاء خلايا انسجة معزولة عن حديثي الولادة الأصغر سنا بنجاح. محاولات لإقامة خلايا انسجة شبيهة الأرومة الليفية العضلية من الفئران الأكبر سنا ما زالت جارية. وأفادت الآخرين جيل ناجح من الخلايا الليفية المريء من أربع إلى ثماني الأسبوع الفئران من العمر 8.
وخلافا للإنشاء myofibroblasts القولون، وتلوث مسألة نادرة في البريدstablishment من ثقافات myofibroblasts الفئران عندما يتم إدراج المضادات الحيوية في مستنبت. لأنه يتم تأسيس الثقافات من الفئران حديثي الولادة، عاملا مقيدا هو حجم الأنسجة الصغيرة وتعرية العضلية المخصوصة ليس ممكنا بسهولة. من ناحية أخرى، في المريء البشري، العضلية المخصوصة هو تمييزها بسهولة وفصلها عن الغشاء المخاطي العضلية. عملية الهضم والثقافة الشروط الأنزيمية ليست مواتية لنمو الخلايا المناعية أو الظهارية في الثقافات أنشئت من الماوس أو المريء البشري. لا تزال العينات استئصال الإنسان عرضة للتلوث البكتيري على الرغم من المضادات الحيوية المستخدمة في مستنبت، ربما بسبب كميا أكبر من الأنسجة المعالجة تمر. التالية تقنيات زراعة الأنسجة القياسية وبدقة تعقيم الأدوات الجراحية يخفف خطر التلوث.
والاستفادة من الثقافة الأولية هي أن هذه الخلايا هي unmanipulated نسبيا ويمكن أن تعكس بشكل أفضل عشره في الجسم الحي بيئة مقارنة مع خطوط الخلايا خلد 9.
تقنية الموضحة مستقيم الى الامام وهي ضمن وسائل معظم المختبرات. العيب من الثقافات الأولية مقابل خطوط الخلايا هو أن الخلايا خارج مرور 15 عرضة للطفرة جينية والشيخوخة في نهاية المطاف. وبالإضافة إلى ذلك، والثقافات الأولية التي تم الحصول عليها من الفئران أو البشر قد تقلب المتأصل يكن لوحظ في خطوط الخلايا. طرق بديلة لالمريء العزلة الخلايا الليفية وقد وصفت 10. توصيف هذه الخلايا في الثقافة ولكن تم تقتصر على التعبير فيمنتين أو أثبتت الخلايا التي تعبر عن فيمنتين وهي ضعيفة فقط α-SMA إيجابية 10.
بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن أن تنشأ الثقافات الأولية من عينات استئصال المريء البشري المريضة. هذه الطرق توفر المحققين القدرة على عزل وخلايا انسجة من ثقافة مختلفة السريريالثانية الظروف التجريبية، ويتيح إجراء مقارنات بين المجموعات. خلايا انسجة شبيهة الأرومة الليفية العضلية مثقف يمكن أيضا أن يحتمل تكييفها للاستخدام في عضوي النمط أو شارك في ثقافة النماذج مع خلايا أخرى مثل الحمضات 3 أو في الثقافة عضوي النمط 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI K08CA153036-01A1 (AS)، AGA-جنرال ميلز معهد بيل الصحة والتغذية جائزة بحوث الباحث في علم وظائف الأعضاء الوتر وجائزة الطيار مؤسسة رايت (AS) الصحة (AS) و.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al.
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
