Abstract
Murin og human esophageal myofibroblaster genereres via enzymatisk nedbrydning. Nyfødte (8-12 dage gamle) murine spiserøret høstes, hakket, vasket og underkastet enzymatisk fordøjelse med collagenase og dispase for 25 min. Humane esophageal resektion prøver frataget muscularis propria og adventitia og de resterende slimhinde hakkes, og underkastes enzymatisk behandling med collagenase og dispase i op til 6 timer. Dyrkede celler udtrykker α-SMA og vimentin og udtrykkelig desmin svagt eller slet ikke. Dyrkningsbetingelser ikke er befordrende for væksten af epitel, hæmatopoietiske eller endotelceller. Kultur renhed bekræftes yderligere af flowcytometrisk evaluering af celleoverflademarkør udtryk for potentiel kontaminerende hæmatopoietisk og endotelceller. Den beskrevne teknik er ligetil og resulterer i ensartet generation af ikke-hematopoieitc, ikke-endotelceller stromaceller. Begrænsninger af denne teknik er forbundet med brugen afprimære kulturer i molekylærbiologiske undersøgelser, dvs., den uundgåelige variation stødt mellem kulturer, der er etableret på tværs af forskellige mus eller mennesker. Primære kulturer er imidlertid en mere repræsentativ afspejling af in vivo tilstand sammenlignet med cellelinier. Disse metoder giver også undersøgere mulighed for at isolere og kultur stromaceller fra forskellige kliniske og eksperimentelle betingelser, så sammenligninger mellem grupper. Kendetegnet esophageal stromale celler kan også anvendes i funktionelle undersøgelser af epitel-stromale interaktioner i esophageal lidelser.
Introduction
Epitel-stromale interaktioner er involveret i reguleringen af en række mave-tarmkanalen funktioner, herunder mucosal regenerering, reparation, fibrose og carcinogenese 1,2. Disse interaktioner er blevet bedst undersøgte i tyndtarmen og colon, og kan på lignende spille en rolle i esophageal mucosale sygdomme 3. En subpopulation af intestinale og colon stromaceller betegnes myofibroblaster har vist sig at deltage i at mediere vævsskade, inflammation og reparere 4,5. I den distale mave-tarmkanalen, er disse spindel formede celler placeret ved siden af basalmembranen ved grænsefladen mellem epitel og lamina propria og er defineret som α-SMA og vimentin positiv, pan-cytokeratin negativ, og svagt positiv eller desmin negativ 5.
Esophageal stroma er ikke strengt karakteriseret ved en cellulær eller molekylært niveau. Vores arbejde i murine spiserøret har deaktiveresmonstrated α-SMA og vimentin celler i esophageal stroma, lejlighedsvis underliggende til pladeepitelet 6. Epitellignende stromal interaktioner er blevet impliceret i esophageal mucosale lidelser, såsom gastro-øsofageal medieret skade 6 og eosinofil esophagitis 3. Fibrotiske strikturer er også en kendt komplikation af esophageal skade og stromale celler er blevet impliceret i patogenesen af gastrointestinal fibrose. Isolering af disse celler vil bidrage til at opnå de nødvendige undersøgelser for at undersøge gale signalveje.
Dette anbringende indeholder de teknikker, der er nødvendige for at etablere primære kulturer af α-SMA-positive, vimentin positive myofibroblaster sådan at de eksisterende huller i viden om signalveje medierer disse interaktioner kan behandles. Den beskrevne teknik er med succes blevet brugt af forfatterne til at etablere primære murine colon myofibroblaster 7 og further er indrettet til etablering af murine 6 og humane myofibroblastlignende esophageal stromaceller.
Heri beskrives betingelser er nødvendige for at etablere og karakterisere disse kulturer, der er etableret fra mus eller human spiserøret inden brug i fremtidige funktionelle studier. Kulturer kan dyrkes og anvendes til op til 15 passager. Isolering og etablering af primære kulturer via metoderne nedenfor genererer stromale celler med en myofibroblastdifferentiering fænotype; α-SMA, vimentin positive og svagt positiv eller negativ for desmin og cytokeratin negativ. Denne fænotype er forskellig fra fænotypen af esophageal fibroblast som er overvejende vimentin positiv, α-SMA negativ 3 eller α-SMA positive, vimentin negativ fænotype af muscularis slimhinden 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen til at udføre dyreforsøg, skal de grundlæggende og mål forskning, blev indsendt og godkendt af University of Southern California Institutional Animal Care og brug Udvalg.
Protokollen for etablering af primære kulturer fra de-identificerede humane esophagectomy prøver blev godkendt af University of Southern California Institutional Review Board.
1. Få mus eller mennesker Spiserøret
- Opnå Mus Spiserøret:
- Aflive 8-12 dage gamle mus med 2% isofluran inhalant overdosis efterfulgt af cervikal dislokation.
- Pin dyret ned med maven opad og fugte ventrale overflade med 70% ethanol. Med pincet, grab og løfte op i huden forreste af urinrørets åbning med pincet. Brug standard lige kirurgiske saks til at klippe langs den ventrale midterlinjen fra urinrørets åbning til hagen. Vær omhyggelig med at skære kun huden. </ Li>
- Lave et snit fra urinrørets åbning nedad til knæet på begge sider af dyret, der danner en omvendt "Y". Foretag en anden indsnit på begge sider af dyret langs brystkassen.
- Træk forsigtigt huden på begge sider, ud af den underliggende bughinde og brystkassen, og lå til siderne. Undersøg brystkassen overliggende brysthulen og peritoneum overliggende bughulen.
- Løft bughinden med pincet og skære gennem det op til membranen og brystkassen, peger saks opad for at forhindre skader på abdominale indhold. Løft forsigtigt op venstre lap af leveren, eksponere den underliggende maven, esophageal-gastrisk krydset og den abdominale del af spiserøret.
- Brug autoklaveres kirurgiske saks til at klippe gennem brystbenet og brystkassen langs midterlinjen op til den cervikale bæltet. Punkt saks opad for at forhindre skader på thorax indhold. Fuldt udsætte indholdet afbrysthulen ved at trække brystkassen til siderne.
- Forsigtigt fjerne hjertet og begge kamre af lungerne. Absorbere overskydende blod med Q-tips. Den thorax spiserøret er en smal, fleksibel slange liggende posteriort for luftrøret og anterior adgang til den thorakale hvirvel.
BEMÆRK: Spiserøret kan være vanskeligt at identificere i murine nyfødte. Lokalisering af esophageal-gastrisk junction gør esophageal identifikation ligetil. - Følg omhyggeligt spiserøret op fra maven, dissekere det omgivende kar, fedt og mesenterium hele vejen op til den esophageal oprindelse i den cervikale hulrum. Kirurgiske sakse med stump spids fungerer bedst til dette formål.
- Resecere hele længden af spiserøret og sted i Hanks 'balancerede saltopløsning (HBSS) for yderligere behandling beskrevet nedenfor. Fjerne en del af maven til orientering formål, hvis det ønskes.
BEMÆRK: På grund af små væv størrelse, adskillelse af muscularis propria fra den muskulæreer slimhinden er ikke opnåelige i murine nyfødte spiserør og hele spiserøret er mere omfattende behandling beskrevet nedenfor.
- Opnå Menneskelig Spiserøret:
- Vask esophageal resektion prøver (typisk 5 cm eller mindre) med HBSS og fjerne eventuelle vedlagte bindevæv, fedt, eller kar.
- Resecere en del af prøven og anbring i formalin til fremtidig histologisk undersøgelse, hvis det ønskes.
- Adskil resterende slimhinde fra underliggende muscularis propria af skarp dissektion.
- Skær slimhinde i undergrupper centimeter fragmenter og underlagt protokollen beskrevet nedenfor.
BEMÆRK: Humane spiserøret resektioner kan opbevares i PBS i op til 6 timer før behandling beskrives nedenfor. Kilde til esophagectomy prøver vil diktere prøven størrelse og vil være laboratorium afhængige.
2. Isoler murine og humane Esophageal stromacellers
- Isoler esophageal stromaceller from murine og humane væv ved en kombination af mekanisk og enzymatisk fordøjelse.
- Mekanisk fordøje ved hakning vævet med en saks og flere vaske med HBSS. Enzymatisk fordøje ved at inkubere vævet med 300 U / ml collagenase XI og 0,1 mg / ml dispase i 25 minutter (murine væv) eller i op til 6 timer (humant væv). Sørg for, at instrumenter, der anvendes til hakning er blevet autoklaveret og steriliseret.
BEMÆRK: Kollagenaser er enzymer der nedbryder collagen, et ekstracellulært matrixprotein ansvarlig for opretholdelsen af dyrevæv sammen. Collagenase XI har høj collagenase aktivitet og har set succes i denne isolation protokol. Dispase er et bakterielt enzym med mild proteolytisk dissociation aktivitet, der bevarer cellemembranen aktivitet og anvendes i kombination med collagenase som et sekundært enzym. - Placer slimhinder fragmenter opnået fra mus eller humant væv i 1,7 ml mikro-centrifuge eller 5 ml rør, og som rummer HBSS. Hakkekød væv yderligerei 2-3 mm stykker med en saks med en åben spids bredde, der vil passe ind i de respektive rør. Tillad tilstrækkelig tid til at give mulighed for esophageal mucosale fragmenter at sedimentere til bunden af røret.
- Langsomt dekanteres HBSS, og pas på ikke at uforvarende skille vævet. Erstat med frisk HBSS efter ved forsigtig rystning. Eller fjern HBSS med en 1 ml pipette.
- Vask væv på denne måde i alt 8 gange med forsigtig omrystning i mellem vaskene giver tid til esophageal fragmenter at sedimentere mellem hver vask.
BEMÆRK: Humant væv vil kræve mere hakning at nyfødte mus væv.
- Mekanisk fordøje ved hakning vævet med en saks og flere vaske med HBSS. Enzymatisk fordøje ved at inkubere vævet med 300 U / ml collagenase XI og 0,1 mg / ml dispase i 25 minutter (murine væv) eller i op til 6 timer (humant væv). Sørg for, at instrumenter, der anvendes til hakning er blevet autoklaveret og steriliseret.
- Inkuber murine væv med 300 U / ml collagenase XI og 0,1 mg / ml dispase i 25 min på en vippende shaker sat til en langsom hastighed ved stuetemperatur.
- Inkuber humant væv med 300 U / ml XI collagenase og 0,1 mg / ml dispase op til 6 timer, ved en vippende shaker sat til en langsom hastighed ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Tilgængeligheden af menneskelig esophagus er variabel. Humant esophageal mucosa inkuberet med enzymer i op til 6 timer resulterer i vellykket generering af primære kulturer.
- Inkuber humant væv med 300 U / ml XI collagenase og 0,1 mg / ml dispase op til 6 timer, ved en vippende shaker sat til en langsom hastighed ved stuetemperatur.
- Efter enzymatisk nedbrydning, hakkekød væv videre med en saks og centrifugeres ved 200 xg i 10 min.
- Supernatanten fjernes. Overfør pellet, der består af en blandet cellesuspension til et 5 ml rør og vaskes 5 gange i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 2% sorbitol for at fjerne ikke-levedygtige celler og debris.
- Seed celler i 6-brønds plader og kultur i DMEM med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 mg / ml insulin, 10 pg / ml transferrin, 10 ug / ml gentamicin og 2 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF) . Vacuum filter (0,22 pm) alle komponenter undtagen EGF, der kan tilføjes efter filtrering. Fordel celler opnået fra humane resektion prøver blandt flere plader med 6 brønde, afhængigt af resektion størrelse.
- Når brønde er 80% sammenflydende, passage adhærente celler til T25 kolber osing 0,05% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). Neutraliser med medier og spin ved 400 x g.
- For en 6 og passage til en T25 kolbe, passage-celler i en 1: 1-forhold. Sammenflydende T25 kolber kan passeres ved et 1: 2 eller 1: 3 ratio. Til passage fra en T25 kolbe til en T75 kolbe, bruge en 1: 1-forhold. Skift medier hver 2-3 dage uanset fartøjet.
- Grow celler ved 37 ºC i en befugtet 5% CO2 inkubator og kultur i myofibroblastlignende medier beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Epitelceller ikke overlever under disse kultur eller passage forhold. Celler til karakterisering og i undersøgelserne, der er beskrevet nedenfor, er mellem passagerne 5 og 15. - Cryo-bevare celler i flydende N2 ved tilsætning af 10% dimethylsulfoxid til myofibroblastdifferentiering medier.
3. karakterisere murine og humane Esophageal stromacellers
- Undersøg morfologi af celler med et inverteret mikroskop. Overhold spindel-formetmorfologi af adhærente celler (figur 1).
- Karakterisere dyrkede celler ved evaluering af de følgende cytoskeletale markører: α-SMA, vimentin, desmin og cytokeratin. Stromaceller med myofibroblastlignende fænotype udtrykke cytoskeletale myofibroblastlignende markører α-SMA og vimentin (figur 2).
- For yderligere at skelne dyrkede stromaceller fra muskelceller, immunofarvningsprocedure for desmin. For at udføre immunfarvning på dyrkede celler, plade 1,5 x 10 4 celler i 4-brønds kammer slides og vokse i myofibroblastdifferentiering medier i 24 timer. Stromale celler med en myofibroblastlignende fænotype vil have svag eller fraværende desmin udtryk. Stromaceller mangler ekspression af epitel markør pan-cytokeratin (data ikke vist).
BEMÆRK: Vurdering af kulturer indbefatter evaluering af cytoskeletale markører med immuncytokemi og celleoverflademarkører ved flowcytometri. Immuncytokemi bruges som den primære metode til karakterisering som expression profil cytoskeletproteiner er unik for fibroblast, myofibroblastdifferentiering eller muskelcelle. Flowcytometri etablerer kultur renhed ved at evaluere celleoverfladeekspression af epitel-, endotel- og hæmatopoietiske celler markører. CD90 er nyttigt som et hjælpemiddel til at identificere humane stromale celler som det er udtrykt på både humane fibroblaster og myofibroblaster. CD90 er ikke nyttigt i karakterisering af murine stromale celler som det også udtrykkes af murine T-celler.
- For yderligere at skelne dyrkede stromaceller fra muskelceller, immunofarvningsprocedure for desmin. For at udføre immunfarvning på dyrkede celler, plade 1,5 x 10 4 celler i 4-brønds kammer slides og vokse i myofibroblastdifferentiering medier i 24 timer. Stromale celler med en myofibroblastlignende fænotype vil have svag eller fraværende desmin udtryk. Stromaceller mangler ekspression af epitel markør pan-cytokeratin (data ikke vist).
- Efter cellerne når 60% konfluens, skylles objektglas med phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseres med methanol. Cellerne inkuberes i methanol i 10 min ved -20 ° C, og derefter opbevares i PBS ved 4 ° C indtil anvendelse.
- Følg standard immunfarvning protokol.
- Kort fortalt, før påføring af primære antistof, blokere de fikserede celler med 5% goatserum i PBS. Fortynd primære og sekundære antistoffer i 5% ged serum samt.
- Til påvisning af α-SMA og vimentin, skal du brugeFølgende antistoffer og koncentrationer: Mouse mAB at α-SMA ved 1: 250 fortynding og kanin PAB til vimentin ved 1: 500 fortynding.
- Inkuber med primært antistof ved stuetemperatur natten over ved 4 ° C, skylles 3 gange med PBS og tilføje sekundære antistoffer rhodamin-konjugeret gede-anti-mus ved en fortynding på 1: 200 og Cy2-konjugeret gede anti-kanin ved en fortynding på 1: 1.000 i 1 time ved stuetemperatur.
- Kontrastfarve kerner med 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) i en koncentration på 1 ug / ml i 1 min og derefter vaske med PBS. Analyser dias med et omvendt mikroskop.
- Sikre renheden af kulturer ved undersøgelse af murine og humane esophageal celler til hæmatopoietisk (CD45) og endotel (CD31) celleoverflademarkører ved flowcytometri (figur 3). Karakterisere humane celler yderligere ved ekspression af stromal celleoverflademarkør CD90.
BEMÆRK: CD90 ikke kan anvendes til at identificere murine stromale celler som murine T cells også udtrykker CD90.- Frigør dyrkede muse esophageal stromaceller fra dyrkningskolberne ved behandling med ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning ved 37 ° C i 10 minutter, vasket med FACS buffer to gange, talt og farvet med FITC-CD45 og APC-CD31 med relevante isotypekontroller ifølge standardprocedurer farvningsprocedurer.
- Saml celler under anvendelse af FACS Calibur og analysere data med FlowJo software. Forud for farvning af celler, optimere antistoffer og titreres koncentrationer hjælp isotypekontroller, normalt muse milt og knoglemarv celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esophageal stromale celler isoleret ved hjælp af mekanisk og enzymatisk fordøjelse indledningsvis udpladet og dyrket i plader med 6 brønde. Undersøgelse af celler med et omvendt mikroskop inden timer udpladning viser et blandet cellesuspension løst vedhæftende til pladen bunden (figur 1A). Over de næste 24 timer, er spindelformede celler fast klæbende til pladen bunden observeret skyde fra blandet cellesuspension (figur 1B) .Disse spirende celler dækker hele området af en brønd inden for 5 dage og kan passeres succes, bevarer morfologi mindst 15 passager. Tenformede adhærente celler observeres ved lav densitet (figur 1C), og når næsten sammenflydende (figur 1D).
Immunfarvning af primære kulturer af esophageal stromale celler dyrket i kammer dias demonstrerer rigelige udtryk for myofibroblastdifferentiering cytoskeletale markører α-SMA og vimentin (Figure 2), svag udtryk for desmin, og fraværende cytokeratin.
Primære kulturer af esophageal myofibroblaster kan undersøges yderligere for celle renhed ved undersøgelse af hæmatopoietisk og endotelcelleoverfladen markører. Forward og sidespredning er etableret for primære murine esophageal stromale celler efterfulgt af gating og analyse af levende celler til celleoverfladeproteiner (figur 3A). Primære murine esophageal stromale celler mangler ekspression af hæmatopoietisk CD45 (figur 3B) og endotelcelle CD31 (figur 3C) celleoverflademarkører.
Figur 1:. Primære kulturer af murine esophageal stromaceller ved forskellige passager Undersøgelse af murine stromale celler med et omvendt mikroskop få timer isolation og plating viser en klynge af blandet ceLLS løst adhærerende celler til pladen bunden (A). Efter 24-48 timer i kultur, spindel-formet celler spire fra den nu klæbende klynge (B). Spindel-formet morfologi adhærente celler fortsætter ved lav (C) og høj (D) tæthed. Klik her for at se en større udgave af dette tal. (tal, der anvendes med tilladelse fra Shaker et al. 6).
Figur 2: Murine esophageal stromale celler dyrket i primær kultur udtrykker myofibroblastlignende markører α-SMA og vimentin Primære murine esophageal stromaceller blev dyrket på kammerobjektglas og immunfarvet for α-SMA og vimentin ved moderat (AC) og lav densitet (DF).. Esophageal stromaceller rigeligt udtrykker α-SMA (A, D) og vimentin (B, E). Murine esophageal stromaceller co-udtrykke disse myofibroblastlignende markører (C, F). (Tal, der anvendes med tilladelse fra Shaker et al. 6). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Primære kulturer af murine esophageal myofibroblaster celler mangler hæmatopoietisk og endotel celleoverflademarkører Den punktdiagram over murine esophageal stromalceller, viser FSC og SSC karakteristika ved denne population af celler.. I alt 32,4% af hændelser blev gated (A) blev Ekspression af hæmatopoietisk (CD45) og endotheliale (CD31) celleoverflademarkører evalueret af en enkelt Immunostain ifølge standard farvningsprotokoller. Uspecifik farvning blev bestemt for hvert antistof ved hjælp isotypekontroller. Primære kulturer af murine esophageal stromaceller udtrykker ikke CD45 (B) eller CD31 (C). FSC: fremad scatter; SSC: sidespredning. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De teknikker til primær generation kultur ligner generelt ved brug af murine eller humant væv med hakning og fordøjelse gange tilpasset til væv størrelse. Vores erfaring med murine væv tyder på, at anvendelse af de ovenfor beskrevne metoder konsekvent føre til en vellykket etablering af primære kulturer. Kritiske trin i protokollen omfatter sterilisering af kirurgisk udstyr og følge standard sterile teknikker til vævskultur. Alderen af musene er også et kritisk trin. 8-12 dage gamle nyfødte konsekvent opnåelse succesfulde primære kulturer. Stromale celler isoleret fra yngre nyfødte ikke er ikke blevet genereret. Forsøg på at etablere myofibroblastlignende stromaceller fra ældre mus er i gang. Andre har rapporteret en vellykket generering af esophageal fibroblaster fire til otte uger gamle mus 8.
I modsætning til etablering af colon myofibroblaster, forurening er en sjælden problem i establishment af kulturer af murine myofibroblaster når antibiotika er inkluderet i dyrkningsmediet. Fordi kulturer etableret fra nyfødte mus, en begrænsende faktor er lille væv størrelse og stripning af muscularis propria er ikke let gennemførlig. På den anden side, i det menneskelige spiserøret, muscularis propria er let skelnes og separeres fra muscularis mucosa. De enzymatiske fordøjelse og dyrkningsbetingelser ikke er befordrende for væksten af immune eller epitelceller i kulturer, der er etableret fra mus eller human spiserøret. Menneskelige resektion prøver fortsat sårbare over for bakteriel forurening trods anvendelse antibiotika i dyrkningsmediet, måske på grund af den større Fastlæg af væv til genstand for behandling. Efter standard vævsdyrkningsteknikker og stringent sterilisere kirurgiske instrumenter afbøder risikoen for forurening.
Fordelen ved primær kultur er, at disse celler er relativt umanipulerede og kan bedre afspejler the in vivo miljø sammenlignet med immortaliserede cellelinjer 9.
Den beskrevne teknik er ligetil og er inden hjælp af de fleste laboratorier. Ulempen ved primære kulturer versus cellelinjer er, at celler uden passage 15 er modtagelige for genetisk mutation og eventuel ældning. Derudover kan primære kulturer opnået fra mus eller mennesker har iboende variabilitet ikke observeret i cellelinier. Alternative metoder til esophageal fibroblast isolation er blevet beskrevet 10. Karakterisering af disse celler i kultur er imidlertid blevet begrænset til vimentin ekspression eller har vist celler, der udtrykker vimentin og er kun svagt α-SMA positive 10.
Når denne teknik er styr, kan etableres primære kulturer fra resektion prøver af sygt menneske spiserøret. Disse metoder giver forskere mulighed for at isolere og kultur stromaceller fra forskellige kliniske ennd forsøgsbetingelser, tillader sammenligninger mellem grupper. Dyrkede myofibroblastlignende stromale celler kan også potentielt tilpasset til anvendelse i organotypiske eller co-kultur modeller med andre celler, såsom eosinofiler 3 eller i organotypisk kultur 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde er støttet af NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Bell Institute of Health and Nutrition Research Scholar Award i Gut Fysiologi og sundhed (AS) og en Wright Foundation Pilot Award (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
