Abstract
Murine और मानव esophageal myofibroblasts enzymatic पाचन के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं। नवजात शिशु (8-12 दिन की उम्र) murine घेघा, काटा कीमा बनाया हुआ, धोया, और 25 मिनट के लिए collagenase और dispase साथ enzymatic पाचन के अधीन है। मानव esophageal लकीर नमूनों पेशीय propria और बाह्यकंचुक की छीन रहे हैं और शेष म्यूकोसा कीमा बनाया हुआ है, और ऊपर से छह घंटे के लिए collagenase और dispase साथ enzymatic पाचन के अधीन है। संवर्धित कोशिकाओं α-SMA और vimentin और एक्सप्रेस desmin कमजोर या बिल्कुल नहीं व्यक्त करते हैं। संस्कृति शर्तों उपकला, hematopoietic, या endothelial कोशिकाओं के विकास के लिए अनुकूल नहीं हैं। संस्कृति पवित्रता आगे संभावित contaminating हिमेटोपोयटिक और endothelial कोशिकाओं की कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति के प्रवाह cytometric मूल्यांकन द्वारा की पुष्टि की है। वर्णित तकनीक सरल है और गैर-hematopoieitc, गैर एन्दोथेलिअल stromal कोशिकाओं के अनुरूप पीढ़ी में यह परिणाम है। इस तकनीक की सीमाओं का उपयोग करने के लिए निहित हैंयानी आणविक जीव विज्ञान के अध्ययन में प्राथमिक संस्कृतियों, अपरिहार्य परिवर्तनशीलता विभिन्न चूहों या मनुष्य भर में स्थापित संस्कृतियों के बीच का सामना करना पड़ा। प्राथमिक संस्कृतियों हालांकि सेल लाइनों की तुलना में विवो राज्य के एक अधिक प्रतिनिधि प्रतिबिंब हैं। इन तरीकों में भी जांचकर्ताओं के समूहों के बीच तुलना की इजाजत देने को अलग-थलग करने की क्षमता और विभिन्न नैदानिक और प्रयोगात्मक शर्तों से संस्कृति stromal कोशिकाओं, प्रदान करते हैं। विशेषता esophageal stromal कोशिकाओं भी esophageal विकारों में उपकला-स्ट्रोमल बातचीत की जांच कार्यात्मक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
उपकला-स्ट्रोमल बातचीत श्लैष्मिक उत्थान, मरम्मत, फाइब्रोसिस, और कैंसरजनन 1,2 सहित जठरांत्र पथ कार्यों की एक किस्म के नियमन में शामिल कर रहे हैं। ये बातचीत सबसे अच्छा छोटी आंत और पेट में अध्ययन किया गया है और इसी प्रकार esophageal mucosal विकारों 3 में एक भूमिका निभा सकते हैं। आंतों और colonic stromal कोशिकाओं करार दिया myofibroblasts के एक subpopulation ऊतक चोट, सूजन मध्यस्थता में भाग लेते हैं और 4,5 की मरम्मत के लिए प्रदर्शन किया गया है। बाहर का सैनिक पथ में, इन धुरी के आकार की कोशिकाएं उपकला और लामिना propria के बीच इंटरफेस में तहखाने झिल्ली के निकट स्थित हैं और α-SMA और vimentin के रूप में परिभाषित कर रहे हैं सकारात्मक, अखिल cytokeratin नकारात्मक है, और दुर्बलता से सकारात्मक या desmin 5 नकारात्मक।
esophageal स्ट्रोमा कड़ाई से एक सेलुलर या आणविक स्तर पर होती नहीं किया गया है। Murine घेघा में हमारा कार्य डी गया हैmonstrated α-SMA के स्क्वैमस उपकला से 6 कभी कभी अधोवर्ती esophageal स्ट्रोमा में और vimentin कोशिकाओं,। उपकला-स्ट्रोमल बातचीत ऐसे गैस्ट्रो esophageal मध्यस्थता चोट 6 और इओसिनोफिलिक ग्रासनलीशोथ के रूप में 3 esophageal mucosal विकारों में फंसा दिया गया है। Fibrotic strictures भी जठरांत्र फाइब्रोसिस के रोगजनन में फंसाया गया है esophageal चोट और stromal कोशिकाओं का एक ज्ञात जटिलता हैं। इन कोशिकाओं के अलगाव विक्षिप्त संकेत दे रास्ते की जांच करने के लिए आवश्यक पढ़ाई को पूरा करने में मदद मिलेगी।
इस प्रस्तुत इन मुलाकातों मध्यस्थता संकेत दे रास्ते के बारे में ज्ञान में मौजूदा अंतराल संबोधित किया जा सकता है कि इस तरह α-SMA के सकारात्मक, vimentin सकारात्मक myofibroblasts के प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए आवश्यक तकनीक प्रदान करता है। वर्णित तकनीक को सफलतापूर्वक प्राथमिक murine colonic myofibroblasts 7 और furthe स्थापित करने के लिए लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया गया हैआर murine 6 और मानव myofibroblast तरह esophageal stromal कोशिकाओं की स्थापना के लिए अनुकूलित।
इस के साथ साथ हम स्थापित करने और माउस या भविष्य कार्यात्मक अध्ययन में उपयोग करने के लिए पहले मानव घेघा से स्थापित इन संस्कृतियों को चिह्नित करने के लिए आवश्यक शर्तों का वर्णन है। संस्कृति बढ़ी है और ऊपर में 15 मार्ग के लिए उपयोग किया जा सकता है। नीचे दिये विधियों के माध्यम से अलगाव और प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना एक myofibroblast phenotype के साथ stromal कोशिकाओं को उत्पन्न करता है; , vimentin सकारात्मक, और दुर्बलता से सकारात्मक या desmin के लिए नकारात्मक है, और cytokeratin नकारात्मक-SMA के α। इस phenotype मुख्य रूप से vimentin सकारात्मक है, जो esophageal तंतुप्रसू के phenotype, नकारात्मक α-SMA के तीन या पेशीय mucosae 6 की α-SMA के सकारात्मक, vimentin नकारात्मक फेनोटाइप से अलग है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रोटोकॉल पशु प्रयोगों, औचित्य और अनुसंधान के उद्देश्यों को प्रदर्शन करने के लिए, दक्षिणी कैलिफोर्निया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा प्रस्तुत की और अनुमोदित किया गया।
de-पहचान मानव esophagectomy नमूनों से प्राथमिक संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल दक्षिणी कैलिफोर्निया संस्थागत समीक्षा बोर्ड के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. माउस या मानव घुटकी प्राप्त
- माउस घुटकी प्राप्त करें:
- ग्रीवा अव्यवस्था के बाद दो isoflurane% inhalant अधिक मात्रा के साथ 8-12 दिन पुराने माउस euthanize।
- ऊपर और नीचे का सामना करना पड़ पेट के साथ पशु पिन और 70% इथेनॉल के साथ उदर सतह गीला। संदंश के साथ, ले लो और संदंश के साथ मूत्रमार्ग खोलने के लिए त्वचा पूर्वकाल उठा। ठोड़ी को मूत्रमार्ग खोलने से उदर midline के साथ कटौती करने के लिए मानक सीधे शल्य कैंची का प्रयोग करें। केवल त्वचा में कटौती करने के लिए सावधान रहें। </ ली>
- "वाई" नीचे एक ऊपर के गठन, पशु के दोनों किनारों पर घुटने के नीचे खोलने मूत्रमार्ग से एक चीरा बनाओ। रिब पिंजरे के साथ पशु के दोनों किनारों पर एक और चीरा बनाओ।
- ध्यान से अंतर्निहित पेरिटोनियम और रिब पिंजरे के बंद, दोनों पक्षों पर त्वचा छील, और पक्षों के लिए रखना। वक्ष गुहा और उदर गुहा overlying पेरिटोनियम overlying रिब पिंजरे जांच करते हैं।
- पेट की सामग्री को नुकसान को रोकने के लिए ऊपर की ओर कैंची ओर इशारा करते हुए, संदंश के साथ पेरिटोनियम लिफ्ट और डायाफ्राम और रिब पिंजरे के लिए इसे माध्यम से कटौती। धीरे, जिगर के बाईं पालि उठा अंतर्निहित पेट, esophageal-गैस्ट्रिक जंक्शन और घेघा के उदर भाग को बेनकाब।
- ग्रीवा करधनी अप करने के midline के साथ उरोस्थि और ribcage के माध्यम से कटौती करने के लिए autoclaved शल्य कैंची का प्रयोग करें। प्वाइंट कैंची ऊपर की ओर वक्ष सामग्री के नुकसान को रोकने के लिए। पूरी तरह की सामग्री का पर्दाफाशपक्षों को रिब पिंजरे खींच कर वक्ष गुहा।
- धीरे दिल और फेफड़ों की दोनों पालियों को हटा दें। क्यू सुझावों के साथ अतिरिक्त रक्त को अवशोषित। वक्ष घेघा वक्ष बांस को श्वासनली और पूर्वकाल के लिए एक संकीर्ण, लचीला ट्यूब झूठ बोल पीछे है।
नोट: घेघा murine नवजात शिशुओं में पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है। Esophageal-गैस्ट्रिक जंक्शन का स्थानीयकरण esophageal पहचान सरल बनाता है। - ध्यान से आसपास के वाहिका संरचना, वसा विदारक, पेट से घेघा का पालन करें और ग्रीवा गुहा में esophageal मूल करने के लिए सभी तरह से ऊपर अन्त्रपेशी। कुंद टिप के साथ शल्य कैंची इस उद्देश्य के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं।
- नीचे वर्णित आगे की प्रक्रिया के लिए हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HbSS) में घेघा और जगह की पूरी लंबाई बांटना। अगर वांछित अभिविन्यास प्रयोजनों के लिए पेट के एक हिस्से को हटा दें।
नोट: छोटे ऊतक आकार की वजह से, पेशी से पेशीय propria की जुदाईम्यूकोसा murine नवजात शिशु घेघा में प्राप्त नहीं है और पूरे घेघा नीचे वर्णित प्रसंस्करण के अधीन है।
- मानव घुटकी प्राप्त करें:
- HBSS के साथ esophageal लकीर नमूनों (आमतौर पर 5 सेमी या कम) धो लें और किसी भी संलग्न संयोजी ऊतक, वसा, या वाहिका संरचना को हटा दें।
- नमूना के एक हिस्से को बांटना और अगर वांछित भविष्य histologic परीक्षा के लिए formalin में जगह है।
- तेज विच्छेदन द्वारा अंतर्निहित पेशीय propria से शेष म्यूकोसा अलग करें।
- नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के उप सेंटीमीटर टुकड़ों में म्यूकोसा और विषय काटें।
नोट: मानव घेघा resections नीचे वर्णित पूर्व प्रसंस्करण के लिए अप करने के लिए छह घंटे के लिए पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है। Esophagectomy नमूनों के स्रोत नमूना आकार हुक्म चलाना होगा और प्रयोगशाला निर्भर हो जाएगा।
2. पृथक Murine और मानव इसोफेजियल stromal कोशिकाओं
- एफ esophageal stromal कोशिकाओं को अलग-थलगयांत्रिक और enzymatic पाचन के संयोजन के द्वारा ROM murine और मानव ऊतक।
- यंत्रवत् HBSS के साथ कैंची और कई washes के साथ ऊतक क़ीमा से पचाने। Enzymatically मिलीलीटर 300 यू / collagenase इलेवन और 0.1 मिलीग्राम / 25 मिनट (murine ऊतक) के लिए मिलीलीटर dispase के साथ या अप करने के लिए 6 घंटा (मानव ऊतक) के लिए ऊतक incubating द्वारा पचाने। क़ीमा बनाने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों autoclaved और निष्फल कर दिया गया है कि सुनिश्चित करें।
नोट: Collagenases कोलेजन, एक साथ पशु ऊतक के आयोजन के लिए जिम्मेदार एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन टूट कि एंजाइमों हैं। Collagenase इलेवन उच्च collagenase गतिविधि है और इस अलगाव प्रोटोकॉल में सफलता देखा है। Dispase कोशिका झिल्ली गतिविधि को बरकरार रखता है और एक माध्यमिक एंजाइम के रूप में Collagenase के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है कि हल्के प्रोटियोलिटिक हदबंदी गतिविधि के साथ एक जीवाणु एंजाइम है। - HBSS युक्त क्रमश: 1.7 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र या 5 मिलीलीटर ट्यूब में माउस या मानव ऊतक से प्राप्त श्लैष्मिक टुकड़े रखें। कीमा ऊतक आगेसंबंधित ट्यूबों में फिट होगा कि एक खुला टिप चौड़ाई के साथ कैंची का उपयोग 2-3 मिमी टुकड़ों में। Esophageal mucosal टुकड़े ट्यूब के नीचे तलछट करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें।
- धीरे-अनजाने ऊतक त्यागने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है, HBSS के छानना। ताजा HBSS के कोमल झटकों से निम्नलिखित के साथ बदलें। वैकल्पिक रूप से, 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ HBSS हटा दें।
- कोमल esophageal टुकड़े प्रत्येक धोने के बीच तलछट करने के लिए समय की अनुमति washes के बीच में झटकों के साथ इस तरह से आठ बार की कुल ऊतक धो लें।
नोट: मानव ऊतक कि नवजात शिशु माउस ऊतक नख़रेबाज़ अधिक की आवश्यकता होगी।
- यंत्रवत् HBSS के साथ कैंची और कई washes के साथ ऊतक क़ीमा से पचाने। Enzymatically मिलीलीटर 300 यू / collagenase इलेवन और 0.1 मिलीग्राम / 25 मिनट (murine ऊतक) के लिए मिलीलीटर dispase के साथ या अप करने के लिए 6 घंटा (मानव ऊतक) के लिए ऊतक incubating द्वारा पचाने। क़ीमा बनाने के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों autoclaved और निष्फल कर दिया गया है कि सुनिश्चित करें।
- मिलीलीटर 300 यू / collagenase इलेवन और कमरे के तापमान पर एक धीमी गति से सेट एक कमाल प्रकार के बरतन पर 25 मिनट के लिए 0.1 मिलीग्राम / एमएल dispase साथ murine ऊतक सेते हैं।
- कमरे के तापमान पर एक धीमी गति से सेट एक कमाल प्रकार के बरतन पर, अप करने के लिए छह घंटे के लिए 300 यू / एमएल इलेवन कोलैजिनेज और 0.1 मिलीग्राम / एमएल dispase के साथ मानव ऊतक सेते हैं।
नोट: मानव esopha की उपलब्धतागस चर रहा है। मानव esophageal म्यूकोसा प्राथमिक संस्कृतियों के सफल पीढ़ी में 6 घंटा परिणामों के लिए एंजाइमों के साथ incubated।
- कमरे के तापमान पर एक धीमी गति से सेट एक कमाल प्रकार के बरतन पर, अप करने के लिए छह घंटे के लिए 300 यू / एमएल इलेवन कोलैजिनेज और 0.1 मिलीग्राम / एमएल dispase के साथ मानव ऊतक सेते हैं।
- Enzymatic पाचन के बाद, 10 मिनट के लिए 200 XG पर कैंची और सेंट्रीफ्यूज के साथ आगे कीमा ऊतक।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें। Nonviable कोशिकाओं और मलबे को खत्म करने के लिए 2% सोर्बिटोल के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 5 बार एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए एक मिश्रित सेल निलंबन से मिलकर गोली स्थानांतरण और धो लें।
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ DMEM में 6 अच्छी तरह प्लेटें और संस्कृति (एफ बी एस), 10 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन, 10 माइक्रोग्राम प्रति में बीज कोशिकाओं / एमएल transferrin, 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / जेंटामाइसिन, और 2 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) । वैक्यूम फिल्टर (0.22) छानने के बाद जोड़ा जा सकता है जो EGF को छोड़कर सभी घटकों। लकीर आकार पर निर्भर करता है, कई 6 अच्छी तरह प्लेटें के बीच मानव लकीर नमूनों से प्राप्त कोशिकाओं को वितरित करें।
- कुओं में 80% मिला हुआ हैं एक बार, T25 के लिए पारित होने के पक्षपाती कोशिकाओं हमें बोतलआईएनजी 0.05% / trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA)। 400 x जी पर मीडिया और स्पिन के साथ बेअसर।
- एक T25 कुप्पी के लिए एक 6 अच्छी तरह से पारित होने के लिए, एक एक पर पारित होने कोशिकाओं: 1 अनुपात। 2 या 1: 3 के अनुपात में मिला हुआ T25 बोतल एक एक पर passaged किया जा सकता है। : 1 के अनुपात एक T75 फ्लास्क करने के लिए एक T25 कुप्पी से पारित होने के लिए, एक एक का उपयोग करें। हर 2-3 दिनों की परवाह किए बिना पोत के बदले मीडिया।
- ऊपर वर्णित myofibroblast मीडिया में एक humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर और संस्कृति में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित।
नोट: उपकला कोशिकाओं इन संस्कृति या पारित होने की शर्तों के तहत जीवित नहीं है। लक्षण वर्णन के लिए और नीचे वर्णित अध्ययन में इस्तेमाल किया कोशिकाओं मार्ग 5 और 15 के बीच हैं। - Myofibroblast मीडिया के लिए 10% डाइमिथाइल sulfoxide जोड़कर तरल एन 2 में कोशिकाओं क्रायो-रक्षा करता है।
3. विशेषताएँ Murine और मानव इसोफेजियल stromal कोशिकाओं
- एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की जाँच करें। धुरी के आकार को ध्यान से देखेंपक्षपाती कोशिकाओं की आकारिकी (चित्रा 1)।
- Α-SMA, vimentin, desmin, और cytokeratin: निम्न cytoskeletal मार्करों के मूल्यांकन के द्वारा संवर्धित कोशिकाओं की विशेषताएँ। एक myofibroblast तरह phenotype के साथ stromal कोशिकाओं α-SMA और vimentin (चित्रा 2) cytoskeletal myofibroblast मार्करों व्यक्त करते हैं।
- आगे desmin के लिए immunostain मांसपेशियों की कोशिकाओं से सुसंस्कृत stromal कोशिकाओं भेद। संवर्धित कोशिकाओं पर immunostaining प्रदर्शन करने के लिए, 4 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में 1.5 एक्स 10 4 कोशिकाओं की थाली और 24 घंटे के लिए myofibroblast मीडिया में हो जाना। एक myofibroblast तरह phenotype के साथ stromal कोशिकाओं कमजोर या अनुपस्थित desmin अभिव्यक्ति होगा। Stromal कोशिकाओं उपकला मार्कर अखिल cytokeratin की अभिव्यक्ति कमी (डेटा) नहीं दिखाया।
नोट: संस्कृतियों का आकलन फ्लो द्वारा immunocytochemistry और कोशिका की सतह मार्कर द्वारा cytoskeletal मार्कर का मूल्यांकन भी शामिल है। Immunocytochemistry पूर्व के रूप में लक्षण वर्णन के प्राथमिक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता हैcytoskeletal प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल तंतुप्रसू, myofibroblast या पेशी सेल के लिए अद्वितीय है। फ्लो उपकला, एन्दोथेलिअल, और hematopoietic कोशिकाओं मार्कर की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का मूल्यांकन द्वारा संस्कृति पवित्रता स्थापित करता है। CD90 यह मानव fibroblasts और myofibroblasts दोनों पर व्यक्त की है के रूप में मानव stromal कोशिकाओं की पहचान करने का एक adjunctive पद्धति के रूप में उपयोगी है। यह भी murine टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त रूप CD90 murine stromal कोशिकाओं के लक्षण वर्णन में मददगार नहीं है।
- आगे desmin के लिए immunostain मांसपेशियों की कोशिकाओं से सुसंस्कृत stromal कोशिकाओं भेद। संवर्धित कोशिकाओं पर immunostaining प्रदर्शन करने के लिए, 4 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स में 1.5 एक्स 10 4 कोशिकाओं की थाली और 24 घंटे के लिए myofibroblast मीडिया में हो जाना। एक myofibroblast तरह phenotype के साथ stromal कोशिकाओं कमजोर या अनुपस्थित desmin अभिव्यक्ति होगा। Stromal कोशिकाओं उपकला मार्कर अखिल cytokeratin की अभिव्यक्ति कमी (डेटा) नहीं दिखाया।
- कोशिकाओं 60% संगम तक पहुँचने के बाद, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ स्लाइड्स कुल्ला और मेथनॉल के साथ तय कर लो। -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल में कोशिकाओं को सेते हैं, तो उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में दुकान।
- मानक immunostaining के प्रोटोकॉल का पालन करें।
- संक्षेप में, प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करने से पहले, पीबीएस में 5% goatserum के साथ तय की कोशिकाओं को ब्लॉक। के रूप में अच्छी तरह से 5% बकरी सीरम में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी पतला।
- Α-SMA और vimentin का पता लगाने के लिए, का उपयोग करेंनिम्नलिखित एंटीबॉडी और सांद्रता: माउस एमएबी α-SMA के लिए 1 पर: 500 कमजोर पड़ने: 1 पर vimentin 250 कमजोर पड़ने और खरगोश PAB।
- रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला और एक के कमजोर पड़ने पर Rhodamine संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें: 1 घंटे के लिए 1000: 1 के कमजोर पड़ने पर 200 और Cy2 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश कमरे के तापमान पर।
- Counterstain नाभिक 4 के साथ ', एक मिनट के लिए एक माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में छह-diamidino-2Phenylindole (DAPI) और फिर पीबीएस से धो लें। एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड का विश्लेषण करें।
- हिमेटोपोयटिक के लिए murine और मानव esophageal कोशिकाओं की परीक्षा (CD45) और फ्लो द्वारा एन्दोथेलिअल (CD31) कोशिका की सतह मार्कर (चित्रा 3) द्वारा संस्कृतियों की पवित्रता स्थापित करना। स्ट्रोमल कोशिका की सतह मार्कर CD90 की अभिव्यक्ति से आगे मानव कोशिकाओं की विशेषताएँ।
नोट: CD90 murine टी सेल के रूप में murine stromal कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकतारास भी CD90 व्यक्त करते हैं।- , दो बार, FACS बफर के साथ धोया गिना और प्रासंगिक निर्धारण नियंत्रण के साथ FITC-CD45 और एपीसी-CD31 के साथ दाग, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गैर एंजाइमी सेल हदबंदी समाधान के साथ इलाज के द्वारा संस्कृति बोतल से सुसंस्कृत माउस esophageal stromal कोशिकाओं को अलग अनुसार मानक धुंधला प्रक्रियाओं के लिए।
- FACS Calibur का उपयोग कोशिकाओं को इकट्ठा करने और FlowJo सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण। धुंधला कोशिकाओं से पहले, एंटीबॉडी का अनुकूलन और निर्धारण नियंत्रण, सामान्य माउस तिल्ली, और अस्थि मज्जा कोशिकाओं का उपयोग सांद्रता टाइट्रेट।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यांत्रिक और enzymatic पाचन का उपयोग कर अलग इसोफेजियल stromal कोशिकाओं शुरू में चढ़ाया और 6 अच्छी तरह प्लेटें में सुसंस्कृत हैं। चढ़ाना के घंटे के भीतर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की परीक्षा प्लेट नीचे (चित्रा 1 ए) के लिए शिथिल पक्षपाती एक मिश्रित सेल निलंबन को दर्शाता है। अगले 24 घंटे के दौरान, प्लेट नीचे करने के लिए दृढ़ता से पक्षपाती धुरी के आकार की कोशिकाओं मिश्रित सेल निलंबन अंकुरण कोशिकाओं में अच्छी तरह से 5 दिनों के भीतर एक के पूरे क्षेत्र को कवर किया और आकृति विज्ञान को बनाए रखना है, सफलतापूर्वक passaged किया जा सकता है ये (चित्रा 1 बी) से शूटिंग कर रहे हैं मनाया कम से कम 15 मार्ग के लिए। धुरी के आकार पक्षपाती कोशिकाओं कम घनत्व (चित्रा 1C) और जब पास-मिला हुआ (चित्रा -1) पर मनाया जाता है।
चैम्बर स्लाइड्स में उगाया जाता है esophageal stromal कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों के immunostaining (छवि α-SMA और vimentin myofibroblast cytoskeletal मार्करों के प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति दर्शाताure 2), desmin के कमजोर अभिव्यक्ति, और अनुपस्थित cytokeratin।
Esophageal myofibroblasts के प्राथमिक संस्कृतियों आगे हिमेटोपोयटिक और endothelial सेल सतह मार्कर की परीक्षा द्वारा सेल शुद्धता के लिए जांच की जा सकती है। आगे और पक्ष बिखराव gating और कोशिका की सतह प्रोटीन के लिए जीवित कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के विश्लेषण के बाद प्राथमिक murine esophageal stromal कोशिकाओं के लिए स्थापित कर रहे हैं। प्राथमिक murine esophageal stromal कोशिकाओं hematopoietic CD45 (चित्रा 3 बी) और endothelial सेल CD31 (चित्रा -3 सी) कोशिका की सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की कमी है।
चित्रा 1:। अलगाव और चढ़ाना के घंटे के भीतर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ murine stromal कोशिकाओं के विभिन्न मार्ग पर murine esophageal stromal कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों परीक्षा मिश्रित सीई के एक समूह को दर्शाता हैप्लेट नीचे (ए) को शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं LLS। संस्कृति में 24-48 घंटे के बाद, धुरी के आकार की कोशिकाओं को अब पक्षपाती क्लस्टर (बी) से अंकुरित। पक्षपाती कोशिकाओं की धुरी के आकार आकृति विज्ञान कम (सी) और उच्च (डी) घनत्व पर बनी हुई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। (शेखर एट अल। 6 से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया आंकड़े)।
चित्रा 2: प्राथमिक संस्कृति में उगाया Murine esophageal stromal कोशिकाओं α-SMA और vimentin myofibroblast मार्करों व्यक्त प्राथमिक murine esophageal stromal कोशिकाओं उदारवादी (एसी) में चैम्बर स्लाइड्स पर वृद्धि हुई है और α-SMA और vimentin के लिए immunostained थे और कम घनत्व (लोमो)।। Esophageaएल stromal कोशिकाओं बहुतायत से α-एसएमए (ए, डी) और vimentin (बी, ई) व्यक्त करते हैं। Murine esophageal stromal कोशिकाओं इन myofibroblast मार्कर (सी, एफ) के सह-व्यक्त करते हैं। (शेखर एट अल। 6 से अनुमति के साथ इस्तेमाल किया आंकड़े)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: murine esophageal myofibroblasts कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों हिमेटोपोयटिक और endothelial सेल सतह मार्कर की कमी murine esophageal stromal कोशिकाओं की डॉट साजिश, FSC और कोशिकाओं की इस आबादी की एसएससी विशेषताओं को दर्शाता है।। घटनाओं की 32.4% की कुल, hematopoietic की अभिव्यक्ति (CD45) और endothelial (CD31) कोशिका की सतह मार्कर एक भी मैं द्वारा मूल्यांकन किया गया (ए) gated गयामानक धुंधला प्रोटोकॉल के अनुसार mmunostain। Nonspecific धुंधला निर्धारण नियंत्रण का उपयोग करते हुए प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया गया था। Murine esophageal stromal कोशिकाओं के प्राथमिक संस्कृतियों CD45 (बी) या CD31 (सी) को व्यक्त नहीं करते। FSC: आगे तितर बितर; एसएससी: पक्ष तितर बितर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊतक आकार के लिए अनुकूलित नख़रेबाज़ और पाचन समय के साथ murine या मानव ऊतक का उपयोग करते समय प्राथमिक संस्कृति पीढ़ी के लिए तकनीक को आम तौर पर इसी तरह के हैं। Murine ऊतक के साथ हमारा अनुभव ऊपर वर्णित तरीकों का उपयोग कर लगातार प्राथमिक संस्कृतियों के सफल स्थापना में परिणाम है कि पता चलता है। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम सर्जिकल उपकरणों की नसबंदी और टिशू कल्चर के मानक बाँझ तकनीक में निम्न शामिल हैं। चूहों की उम्र में भी एक महत्वपूर्ण कदम है। 8-12 दिन पुराने नवजात शिशुओं लगातार सफल प्राथमिक संस्कृतियों निकलेगा। युवा नवजात शिशुओं से अलग stromal कोशिकाओं को सफलतापूर्वक उत्पन्न नहीं किया गया है नहीं किया गया है। बड़े चूहों से myofibroblast तरह stromal कोशिकाओं की स्थापना के लिए प्रयास चल रहे हैं। दूसरों को चार से आठ सप्ताह पुरानी चूहों 8 से esophageal fibroblasts की सफल पीढ़ी की सूचना है।
Colonic myofibroblasts की स्थापना के विपरीत, संदूषण ई में एक निराला मुद्दा हैmurine myofibroblasts की संस्कृतियों के stablishment एंटीबायोटिक दवाओं संस्कृति के माध्यम में शामिल कर रहे हैं। संस्कृतियों नवजात शिशु चूहों से स्थापित कर रहे हैं, क्योंकि एक सीमित कारक छोटे ऊतक आकार और पेशीय propria के स्ट्रिपिंग आसानी से संभव नहीं है। दूसरी ओर, मानव घेघा में, पेशीय propria आसानी से अलग पहचाना और पेशीय म्यूकोसा से अलग कर दिया है। enzymatic पाचन और संस्कृति की स्थिति माउस या मानव घेघा से स्थापित संस्कृतियों में प्रतिरक्षा या उपकला कोशिकाओं के विकास के लिए अनुकूल नहीं हैं। मानव लकीर नमूनों शायद क्योंकि ऊतक के दौर से गुजर प्रसंस्करण के बड़े यों की, संस्कृति माध्यम में उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं के बावजूद जीवाणु संक्रमण की चपेट में रहते हैं। मानक टिशू कल्चर तकनीकों के बाद और कड़ाई से सर्जिकल उपकरणों स्टरलाइज़ संदूषण का जोखिम mitigates।
प्राथमिक संस्कृति का लाभ इन कोशिकाओं अपेक्षाकृत unmanipulated हैं और बेहतर वें प्रतिबिंबित हो सकता हैअमर सेल लाइनों 9 की तुलना में ई vivo वातावरण।
वर्णित तकनीक सीधे आगे है और सबसे प्रयोगशालाओं का मतलब के भीतर है। सेल लाइनों बनाम प्राथमिक संस्कृतियों का नुकसान पारित होने के 15 से परे कोशिकाओं आनुवंशिक उत्परिवर्तन और अंतिम वार्धक्य के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसके अलावा, चूहों या मनुष्य से प्राप्त प्राथमिक संस्कृतियों निहित परिवर्तनशीलता सेल लाइनों में नहीं मनाया है। Esophageal तंतुप्रसू अलगाव के लिए वैकल्पिक तरीकों 10 में वर्णित किया गया है। संस्कृति में इन कोशिकाओं की विशेषता हालांकि vimentin अभिव्यक्ति के लिए सीमित कर दिया गया है या vimentin व्यक्त करने और कमजोर α-SMA के 10 सकारात्मक ही कर रहे हैं कि कोशिकाओं का प्रदर्शन किया है।
इस तकनीक में महारत हासिल किया गया है, प्राथमिक संस्कृतियों रोगग्रस्त मानव घेघा की लकीर नमूनों से स्थापित किया जा सकता है। इन विधियों जांचकर्ताओं विभिन्न नैदानिक एक से अलग-थलग करने की क्षमता और संस्कृति stromal कोशिकाओं को प्रदानएन डी प्रयोगात्मक शर्तों, समूहों के बीच तुलना की इजाजत दी। संवर्धित myofibroblast तरह stromal कोशिकाओं भी संभावित ऐसे इयोस्नोफिल्स 3 के रूप में या organotypic संस्कृति 8 में अन्य कोशिकाओं के साथ organotypic या सह संस्कृति मॉडल में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
इस काम के आंत फिजियोलॉजी और स्वास्थ्य (एएस) और एक राइट फाउंडेशन पायलट पुरस्कार (एएस) में एनआईएच / NCI K08CA153036-01A1 (एएस), स्वास्थ्य के आगा-जनरल मिल्स बेल संस्थान और पोषण रिसर्च स्कॉलर अवार्ड द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture reagents | |||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F42442 | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202-001 | |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl | |
| Epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Reagents for immunostaining | |||
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 | |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 | |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | eBioscience | 48-0319-41 | |
| CD90 conjugated to APC | eBioscience | 17-0909-41 | |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 | |
| Mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 | |
| Equipment | |||
| 5 ml tube | Eppendorf | 30108310 | |
| Inverted microscope | Motic | AE31 | |
| Biosafety cabinet and incubators | Nuaire | http://www.nuaire.com/products/ | |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse TE300 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| T25 Flasks | TRP | 90026 | |
| T75 Flasks | Corning | 43064 | |
| Dissection scissors | |||
| Dissection forceps | |||
| Single tipped Q-Tips | Kendall | 540500 | |
| Software | |||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | ||
| FACSCAlibur | BD Bioscience | ||
| FACSVerse | BD Bioscience | ||
References
- Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair. Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Rieder, F., et al. T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis. Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).
- Powell, D. W., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts. The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).
- Shaker, A., et al. Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).
- Shaker, A., et al. Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion. The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Rieder, F., et al. Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities. Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).
