Introduction
الضامة هي خلايا غير متجانسة والبلاستيك التي تكون قادرة على الحصول على الظواهر وظيفية متميزة. وفي الجسم الحي، وهذه الخلايا تستجيب لمجموعة كبيرة ومتنوعة من signalssuch البيئية الدقيقة عن المنتجات الميكروبية، السيتوكينات، الخ. 1. في المختبر، والنمط الظاهري الموالية للالتهابات (M1) من البلاعم يمكن أن يسببها عديد السكاريد الشحمي (LPS) والنمط الظاهري المضادة للالتهابات (M2) من خلال بعض السيتوكينات مثل انترلوكين 4 (IL-4). وعلاوة على ذلك، يمكن الضامة التبديل من M1 M2 النمط الظاهري لتفعيلها، وعلى العكس، بناء على إشارات معينة 2.
اعتمادا على النمط الظاهري، سوف الضامة لها وظائف مختلفة. الضامة M1 هي الخلايا التي تنتج السيتوكينات الموالية للالتهابات، مثل عامل نخر الورم α (TNF-α)، لقتل الميكروبات أو الخلايا السرطانية 3. في المقابل، M2 الضامة تمنع هذه الاستجابة الالتهابية مثل في التئام الجروح والتليف عن طريق إنتاج مكافحة inflammatorذ العوامل مثل TGF-β 3،4.
تم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى الإنسان من المانحين صحية من خلال التدرج Ficoll الكثافة الطرد المركزي كما هو موضح سابقا 5 باستخدام تقنية مقتبسة من Boyum 6. يمكن التفريق بين الضامة في الثقافة إلى M1 أو M2 النمط الظاهري بعد 6 أيام من الثقافة الابتدائية 7.
تحليل تعبير البروتين أو البروتين تغييرات بين اثنين من الأنواع الفرعية الضامة تحت مؤثرات تسيطر مختلفة، مثل المرضية المضيف أو السموم الميكروبية، وسوف تكون مفيدة فك وظائف المؤيدين والضامة المضادة للالتهابات.
البروتينات هي أدوات فريدة من نوعها لرصد مباشر من البروتينات التي هي حتى- على وجه التحديد أو التنظيم إلى أسفل في الضامة الإنسان المثقف في إطار مختلف المنبهات. وقد حل الأصباغ الفلورية بعض القيود من 2D الكهربائي للهلام، مثل انخفاض الحساسية وتحليل الصور 8 < / سوب>. الأصباغ التفاعل مع بقايا السيستين زادت حساسية الكشف مقارنة مع أولئك التفاعل مع بقايا يسين 9. في دراسة سابقة، أثبتنا فائدة DIGE الوسم تشبع لتحليل العينات النادرة 10 مقارنة الملطخة الفضة الكلاسيكية 2D الكهربائي 11. هذه التقنية مفيدة في تحليل سريع التعديلات البروتين بين اثنين من الأنواع الفرعية الضامة أو بين الضامة غير المعالجة والمعالجة من نفس النوع الفرعي.
مزايا هذه التقنية هي وجود البروتين الحصول على المعلومات من حجم البروتين والتعديلات بعد متعدية من خلال تحليل هلام 2D 12. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن هذه ليست تقنية إنتاجية عالية، مما يحد من عدد العينات التي يمكن تحليلها. تطوير فحوصات إنتاجية عالية تعتمد على الطيف الكتلي كما استعرضت مؤخرا 13 يمكن أن يحسن هذا.
_content "> هنا نقدم كيفية إجراء تحليل 2D DIGE من استخراج البروتين الضامة مثقف من خلال عمليات الكهربائي، isoelectrofocusing، وSDS-PAGE وكذلك معلومات عن فائدة برنامج 2D كاف.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية مؤسساتنا. وقد تم الحصول على معطف الشهباء من المانحين البشرية السليمة من مركز نقل الدم الإقليمي (ليل الفرنسي). وأعلن عينات تم الحصول عليها من المعاطف الشهباء أنها مجموعة INSERM (رقم DC2010-1209).
1. المواد والثقافة تحضير الوسائط
- تمييع 10X الفوسفات عازلة المالحة (PBS) في الماء المقطر المعقم للحصول 1X PBS.
- جعل المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع الجنتاميسين (40 ميكروغرام / مل) ولام الجلوتامين (2 ملم)، مع وبدون 10٪ تجميع المصل البشري.
2. الثقافات الأولية من البلاعم المشتقة من الوحيدات (MDM)
- تمييع buffycoat (25 مل) مع 1X PBS. تحميل بعناية على Ficoll / leucosep وأنبوب الطرد المركزي في 1600 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- جمع وحيدات في واجهة في أنبوب جديد. غسل 3X مع 10 مل 1X PBS تحتوي على 0.1٪ ethylenediaminetetraحمض الخليك (EDTA) من خلال centrifugations التوالي في 1000 x ج، 370 x ج و 160 x ج لمدة 10 دقيقة لكل منهما، ثم مرة واحدة في برنامج تلفزيوني 1X وحدها في 160 x ج لمدة 10 دقيقة.
- resuspend الكرية خلية في المتوسط 5 مل RPMI-1640 دون المصل والبذور الخلايا في أطباق 35 مم في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 6 خلايا في طبق.
- بعد الترسيب لمدة 90 دقيقة في الحاضنة، تجاهل طاف تحتوي الخلايا غير ملتصقة. غسل الخلايا الملتصقة، وتتألف من وحيدات، 3X مع 1 مل PBS. ثم يضاف 1 مل من المتوسط الطازجة تحتوي على 10٪ (V / V) في مصل الدم البشري إلى خلايا حرة المصل سابقا.
- بعد 6 أيام من الثقافة، لتسفر الضامة متباينة البديلة (M2)، إضافة المؤتلف الإنسان IL-4 (15 نانوغرام / مل)، والحفاظ على لمدة 6 أيام. ثم، علاج الضامة متباينة مع عديد السكاريد الشحمي (100 نانوغرام / مل) في اليوم 12 لمدة 4 ساعة للحصول الضامة M1.
3. استخراج M1 و M2 بلعم البروتينات ل2D الكهربائي
- غسل macrophالأعمار ثلاث مرات مع 25 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، والخردة في العازلة التي تحتوي على 30 ملي تريس درجة الحموضة 8، 4٪ 3 - [dimethylammonio (3-cholamidopropyl)] -1-propanesulfonate (الفصول)، 2 M ثيوريا و 7 M اليوريا.
- ليز خلايا باستخدام خلاط مناسبة ل1.5 مل أنابيب microcentrifuge لمدة 5 دقائق في الثلج ومخزن في -20 درجة مئوية.
- تحديد تركيز البروتين باستخدام كاشف برادفورد التجاري. تخزين 100 مكل من البروتينات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. Isoelectrofocusing
ملاحظة: تنفيذ جميع إجراءات وضع العلامات في الظلام.
- تخفيض 5 ميكروغرام لكل عينة (M1 و M2 الضامة) تعدل إلى 9 ميكرولتر مع العازلة تحلل مع 2 ملي تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة cyanine 3 (و Cy3) لاستخراج M1 و M2-سلفهيدريل رد الفعل استخراج صبغة بتركيز 0.8 نانومتر البروتين / ميكروغرام. إضافة cyanine 5 (Cy5) إلى M1 و M2 مقتطفات بتركيز 0.8 نانومتر / ميكروغرام من البروتين واحتضانلمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وقف رد الفعل مع إضافة حجم مساو من العازلة العينة تحتوي على 7 M اليوريا و 2 M ثيوريا، CHAPS٪ 4، 130 ملي dithiothreitol (DTT) و 2٪ pharmalytes.
- مزيج و Cy3 المسمى العينات مع عينات M1 M2 Cy5 المسمى في يد واحدة و Cy3 المسمى عينات M2 مع Cy5 المسمى عينات M1 في جهة أخرى.
- ترطيب التدرج الحموضة مشلول (IPG) شريط (240 ملم، ودرجة الحموضة 3-10 الانحدار الخطي) مع 450 ميكرولتر من عينات مختلطة وصفت في العازلة التي تحتوي على 7 M اليوريا و 2 M ثيوريا و 4٪ CHAPS على بأر متساوي التكهرب (منتدى الطاقة الدولي) نظام خلية لمدة 24 ساعة دون تطبيق أي تيار.
- أداء التركيز على 300 فولت (V) لمدة 3 ساعة، وبعد ذلك في الانحدار إلى 1000 V لمدة 6 ساعة، في التدرج إلى 8000 V لمدة 3 ساعة وأخيرا في 8000 V لمدة 3 ساعة.
5. البعد الثاني
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات الكهربائي في الظلام.
- احتضان شرائط IPG العازلة في موازنة تحتوي على0.1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8)، 6 M اليوريا و 2٪ (ث / ت) كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) و 30٪ (V / V) الجلسرين جي لمدة 10 دقيقة.
- نقل شرائط IPG معايرتها عن البعد الثاني (SDS-إس دي إس بايج (PAGE)) على 12.5٪ والمواد الهلامية PAGE وختم مع انخفاض ذوبان الاغاروز.
- تنفيذ الكهربي عند 20 درجة مئوية باستخدام نظام Ettan-Daltsix في الجهد المستمر 70 فولت تبع بين عشية وضحاها بنسبة 300 V حتى تصل الجبهة الزرقاء برموفينول الجزء السفلي من هلام.
6. الحصول على الصور وتحليل بيوينفورمتيك
- المواد الهلامية مسح يلقي بين اثنين من لوحات الزجاج المنخفض مضان مع ماسح ضوئي DIGE تصوير في موجات الإثارة / انبعاث 532/580 نانومتر لو Cy3 633/670 نانومتر لCy5 لانتاج صور ذات حجم بكسل 100 ميكرون.
- إجراء تحليل الصور مع البرمجيات التجارية كما هو موضح سابقا (12).
- حساب وتطبيع حجم البقعة في كل صورة. تعيين حجم البقعة تطبيع كدعامةortion من القيمة الإجمالية لكل بقعة اكتشفت في هلام.
- تحليل الاختلافات في حجم البقعة البروتين لكل نوع من أنواع الضامة بمقارنة قيمة حجم بقعة طبيعية بين المجموعتين (M1 و M2). النظر في الفرق بين حجم البقعة لتكون كبيرة إذا كان التغيير هو 1.5 أضعاف (P <0.05، في اتجاه واحد تحليل أنوفا).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لأداء التفاضلية تحليل البروتين الملائم، يجب التأكد من صحتها تجهيز عينات ليتم تحليلها.
في المثال المقدمة، مطلوب نوعية زراعة الخلايا الضامة للجوانب الشكلية والجزيئية كما نشرت سابقا 5. وأعقب تمايز حيدات في الضامة وتجانس الثقافة من خلال مراحل المجهر الشكل 1 أظهر مثال على الثقافات الأولية من M1 و M2 الضامة. كما هو مبين، نحن التحقق من تجانس M1 (الشكل 1A، B) و M2 (الشكل 1C، D) فرعية الضامة في يوم 12 من الثقافة من خلال مراحل الفحص المجهري في أدنى مستوى (الشكل 1A، C) وعالية (الشكل 1B، D ) التكبير. بوضوح، لاحظنا مورفولوجيا متميزة الضامة M1 و M2 بعد 12 يوما من ثقافة الأولية. كما نشرت سابقا، نحن التحقق من RT-PCR وجود مرنا الترميز لTNF وIL1(ب) في الضامة M1 وMRC1 وCCL18 في 14 M2 الضامة (لا يظهر).
استخدمت الوحيدة الثقافات يجمع بين هذه المعايير لتحليل البروتين.
نحن مصممون على أنماط البروتين 2D اثنين من الأنواع الفرعية الضامة، M1 (الموالية للالتهابات) و M2 (المضادة للالتهابات). لهذا الغرض، لاستخراج البروتينات من M1 و M2 الضامة مثقف كما هو مفصل في البروتوكول وصفت M1 و M2 الضامة إما مع الأصباغ التشبع CY3 أو Cy5 لتحليل البروتينات التي كتبها 2D DIGE الكهربائي الشكل 2 يعرض المواد الهلامية 2D تمثيلية من M1 ( الشكل 2A، B) و M2 (الشكل 2C، D) الضامة من نوعية كافية لتحليل بيوينفورمتيك. وقد لوحظ نفس النمط من البروتينات إما M1 أو M2 بشكل مستقل عن cyanine الأصباغ المستخدمة و Cy3 (الشكل 2A، C) أو Cy5 (الشكل 2B، D). في هذا المثال، ص الخطي كبيرواستخدمت H التدرج (3-10) ويفصل البروتينات مع رر الحمضية أو الأساسية، يمكن استخدام الرقم الهيدروجيني الضيق التدرج.
ومن المثير للاهتمام، كشف تحليل بيوينفورمتيك من هلام 2D 20 منطقة تحتوي على البقع التي يمكن تحليلها ومقارنتها باستخدام برنامج 2D الشكل 3 مثال numerised هلام 2D فيها مناطق 20 من البقع تقع. برنامج 2D قادر على قياس ومقارنة حجم كل بقعة بين عدة الهلام 2D من عينات مختلفة. البرنامج يمكن تحديد كمية الزيادة أو النقصان في حجم البقعة وهذا يمكن تصور من قبل اللون كما هو مبين في الشكل (3). وتعتبر البقع أن يكون التعبير فارق كبير إذا كان أضعاف تغيير حجم بقعة طبيعية كما هو مبين في الفقرة 6 من قسم البروتوكول و أكبر من 1.5 مع ف قيمة <0.05. ويمكن الكشف عن وجود أو عدم وجود بروتين أو ببتيد بقعة بين المجموعتين الضامة قبل البرنامج.
الشكل 1: صور من المجهر على النقيض من المرحلة الابتدائية للثقافة الضامة مثال على مورفولوجية M1. (A، B) و M2 (C، D) الضامة. تم الحصول عليها عن طريق العلاج الضامة M1 عديد السكاريد الشحمي لمدة 4 ساعة في اليوم 12. الضامة M2 تم الحصول عليها بواسطة IL-4 العلاج بدءا من يوم 6 حتى يوم 12. على النقيض من المرحلة المجهري يسمح بتحديد واضح لكلا فرعية الضامة. أجريت في الصور منخفضة (10X) (A، C) وعالية (40X) (B، D) التكبير في يوم 12 من الثقافة. شريط النطاق: 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
EEP-together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 2: هلام الممثل 2D DIGE من M1 و M2 الضامة مثقف البروتينات (5 ميكروغرام) وصفت مع أي و Cy3 (A، B) أو Cy5 (C، D) من M1 (A، B) و M2 (C، D) مثقف الضامة لمدة 12 يوما. تم الحصول على نفس نمط هلام 2D لM1 أو M2 الضامة بشكل مستقل عن cyanine المسمى المستخدمة. مواقف الوزن الجزيئي يشار إلى (السيد) المعايير على اليسار، وأشارت المعهد البترولي على الجزء السفلي من هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
"/>
الرقم 3: تحليل بيوينفورمتيك الممثل هلام 2D DIGE من البروتينات بلعم مع برنامج تكاثر مبكر SameSpots تم الكشف عن عشرين المناطق لإجراء تحليل الفارق بين M1 و M2 الضامة. أسفل هذا الرقم يدل على رمز اللون لأضعاف تغيير حجم البقع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا تفاصيل طريقة لتحليل تأثير محفزات مختلفة من اثنين من الأنواع الفرعية الضامة، M1 (الموالية للالتهابات) و M2 (المضادة للالتهابات). وقد تم الحصول على الثقافات الأولية من M1 و M2 الضامة من التفريق بين حيدات كما نشرت سابقا 7.
إجراءات 2D DIGE الكهربائي للهلام يتطلب مواد ومعدات متخصصة، مثل منتدى الطاقة الدولي خلية لوحات isoelectrofocusing، وانخفاض ومضان لSDS-PAGE من أجل مسح مرتين جل في الإثارة / الانبعاثات الطول الموجي للو Cy3 Cy5، ماسح ضوئي لمضان و2D البرمجيات. هذا الأسلوب يتطلب بعض الممارسة، والبراعة اليدوية.
هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح هلام 2D الكهربائي: 1) استخراج البروتينات أمر بالغ الأهمية في بيئة دون أي ملوثات مثل الزلال أو الكيراتين، و2) القيام بوضع العلامات والكهربائي في الظلام. تجنباستخدام DTT للحد من البروتين في المخزن المؤقت تحلل مثل هذه التقنية يتطلب استخدام TCEP للحد من السندات الببتيد كبريتيد في البروتينات قبل صفها مع cyanine الأصباغ على رد الفعل.
هذه التقنية 2D DIGE الحساسة تسمح بتقييم التعبير التفاضلية من البقع البروتين الضامة تحت الظروف البيئية المختلفة، في وجود أو غياب البروتينات اعتمادا على نوع فرعي.
واحد من أوجه القصور في هذا الأسلوب 2D DIGE هو الحاجة لتسمية البروتينات على بقايا السيستين، والتي هي غائبة في 14٪ من البروتين. والحد الآخر هو عدد صغير نسبيا من العينات التي يمكن تحليلها في نفس نوع بالمقارنة مع تكنولوجيا عالية الإنتاجية مثل الكمي مطياف الكتلة، على الرغم من 2D DIGE هو أقل تكلفة.
المحفزات الميكروبية، مثل LPS وكذلك السيتوكينات TH1، تنشيط البلاعم في حالة التهابات M1، بينما السيتوكينات TH2، مثل IL-4، صolarize الخلايا إلى النمط الظاهري M2 مع immunoregulatory، وإصلاح، وظائف مضادة للالتهابات 3. سوف Phenotyping M1 و M2 الضامة مثقف مع أو بدون المرضية المضيف من خلال نهج البروتينات تقديم صورة أكثر تفصيلا لدور وظيفي معقد من أنواع فرعية فردية. والكهربائي 2D DIGE قد تكون مفيدة لتحديد البروتينية / البروتينات أو تعديلات ما بعد متعدية لهذه البروتينات المعدلة تفاضلي في سلالة واحدة أو بين اثنين من الأنواع الفرعية الضامة تحت مؤثرات أو بيئة محددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
