Introduction
巨噬细胞是异质的，塑料的细胞，能够获得不同的功能表型。 在体内，这些细胞对大量的各种微环境signalssuch作为微生物产物，细胞因子， 等等 。1的响应。 在体外 ，所述促炎性表型（M1）的巨噬细胞可通过脂多糖（LPS）和抗炎表型（M2），通过某些细胞因子，如白介素-4（IL-4）诱导。此外，巨噬细胞可以从一个激活的M1至M2的表型转换，而相反地，在特定的信号2。
根据不同的表型，巨噬细胞将具有不同的功能。 M1巨噬细胞产生促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α），杀灭微生物或肿瘤细胞的3个细胞。与此相反，M2巨噬细胞阻止这些炎性应答状在伤口愈合和纤维化由产生抗inflammatorÝ因子如TGF-β3,4。
从健康供体的人外周血单核细胞通过Ficoll密度梯度离心法如使用适于从Boyum 6的技术先前描述5中分离得到。在培养的巨噬细胞后6天的原代培养7可以分化成M1或M2的表型。
蛋白质表达或根据各种受控刺激，如宿主的致病性或微生物毒素的巨噬细胞的两种亚型之间的蛋白质变化的分析，将是有益的破译亲和抗炎的巨噬细胞的功能。
蛋白质组学是用于直接监控的蛋白质，是具体地上调或下调的下各种刺激培养的人体巨噬细胞的独特工具。荧光染料已解决了某些二维凝胶电泳的局限性，如低灵敏度和图像分析8 < / SUP>。染料与半胱氨酸残基反应而增加的检测灵敏度相比，那些与赖氨酸残基9的反应。在先前的研究中，我们证明了DIGE饱和标记的有用稀少样品10的分析结果相比较，以经典的银染的二维电泳11。这种技术是在快速分析巨噬细胞的两种亚型之间或从同一亚型未处理和处理的巨噬细胞之间的蛋白质修饰很有帮助。
此蛋白质组技术的优点是具有由2D凝胶12分析获得的蛋白质的大小和翻译后修饰的信息。应当考虑到，这不是一个高通量技术，限制了可被分析的样品的数目。基于质谱的高通量测定法评论了发展最近13可以改善这一点。
_content“>这里，我们提出了如何通过电泳，等电聚焦的过程中执行从培养的巨噬细胞的蛋白提取2D DIGE分析和SDS-PAGE，以及对适当的2D软件的有用信息。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
该协议符合我们的机构人类研究伦理委员会的指导方针。从地区输血中心（里尔，法国）获得从健康人供体棕黄色大衣。从淡黄色大衣得到的样品被声明为一个INSERM集合（N°DC2010-1209）。
1.材料和文化传媒准备
- 稀释10倍的磷酸盐缓冲盐水（PBS），在无菌蒸馏水中，得到的1×PBS。
- 作的RPMI 1640培养基补充有庆大霉素（40微克/毫升）和L-谷氨酰胺（2毫摩尔），有和没有10％合并的人血清。
单核细胞 - 巨噬2.原代培养（MDM）
- 稀buffycoat（25毫升）用1×PBS。在Ficoll / leucosep管和离心谨慎地装载在1600×g离心20分钟，在室温下进行。
- 收集单核细胞的界面处进新管中。洗涤3次，用10ml。一次含0.1％乙二胺四PBS中乙酸（EDTA）的通过连续离心以1000×g离心，370×g离心和160×g离心，每次10分钟，然后再一次在1×PBS中单独以160×g离心10分钟。
- 重新悬浮于5ml RPMI-1640培养基将细胞沉淀无血清和种子细胞35毫米培养皿中，每皿1×10 6个细胞的密度。
- 沉降90分钟，在孵化后，弃去含有非贴壁细胞上清。洗涤贴壁细胞，包括单核细胞，3倍，用1ml的PBS;然后加入1毫升含有10％的新鲜培养基（体积/体积）人血清与先前的无血清细胞。
- 培养6天后的，以产生替代性分化的巨噬细胞（M2）中，添加重组人IL-4（15毫微克/毫升），保持6天。然后，治疗分化的巨噬细胞用脂多糖（100毫微克/毫升）在12天4小时，得到M1巨噬细胞。
3.提取M1和M2巨噬细胞蛋白的二维电泳
- 洗macroph年龄三次用25mM的Tris，pH 7.4中和废料中含有30毫摩尔Tris pH为8,4％3缓冲器 - [（3-胆酰胺丙基）二甲氨基] -1-丙磺酸盐（CHAPS），2M硫脲和7M尿素。
- 使用合适的1.5 ml微量离心管5分钟，在冰中并储存在-20℃的混合器裂解细胞。
- 使用市售的Bradford试剂测定蛋白质浓度。存储该蛋白质的100μl的等分试样在-20℃下直到使用。
4.等电聚焦
注：请在黑暗中的所有标记的程序。
- 减少5微克每一个样品（M1和M2巨噬细胞），2毫摩尔Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）处理1小时，调整为9微升用裂解缓冲液中，在37℃。
- 添加菁3（Cy3标记）与M1提取物和M2的巯基反应性染料提取物为0.8纳米/微克蛋白的浓度。添加花青-5（Cy5标记），以M1和M2中提取在0.8纳米/微克蛋白的浓度和孵育为30分钟，在37℃。
- 停止通过加入含7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，130毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）和2％pharmalytes样品缓冲液等体积的反应。
- 混合Cy3标记M1的样品用Cy5标记M2的样品中的单手和Cy3标记M2的样本与另一个手Cy5标记M1的样品。
- 再水化的固相pH梯度（IPG）条（240毫米，pH值3-10的线性梯度）用450微升标记的混合样品在含7M尿素，在等电2M硫脲，4％CHAPS缓冲聚焦（IEF）电池系统为24小时，不施加任何电流。
- 执行，在300伏（V）聚焦3小时，然后在梯度1,000V，6小时，在梯度的8000 V 3小时，最后在8000 V 3小时。
5.第二维
注：请在黑暗中所有的电泳程序。
- 孵育IPG胶条的平衡缓冲液含有荷兰国际集团为0.1mM的Tris-HCl（pH8）中，6M尿素，2％（重量/体积）十二烷基硫酸钠（SDS）和30％（体积/体积）甘油10分钟。
- 传输平衡的IPG胶条用于第二维（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE））到12.5％PAGE凝胶上，并密封与低熔点琼脂糖。
- 进行电泳，在20℃下使用的Ettan-Daltsix系统，在70伏的恒定电压过夜，然后300伏，直到溴酚蓝前沿到达凝胶的底部。
6.图像采集和生物信息学分析
- 扫描凝胶投两低荧光玻璃板之间具有DIGE成像扫描器在五百八分之五百三十二处为Cy3和六百七十○分之六百三十三激发波长/发射波长为Cy5标记，以具有100微米的像素尺寸得到的图像。
- 用商业软件进行图像分析如先前详述12。
- 计算和规范点卷中的每个图像。分配一个标准化的现货量为道具检测凝胶中的每个点的总价值的钮用来。
- 通过比较这两个基团（M1和M2）之间的归一化点体积值分析对于每种类型的巨噬细胞中的蛋白斑点体积的差异。考虑光斑的卷之间的差异是显著如果变化为1.5倍（p <0.05，单向ANOVA分析）。
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Representative Results
执行适当的差动蛋白质组学分析，待分析样品的处理应加以核实。
在给出的例子中，需要的巨噬细胞的细胞培养物的质量为形态学和分子方面的先前公布的5。单核细胞分化成巨噬细胞和培养物的均一性，随后通过相显微镜。 图1显示的M1和M2巨噬细胞的原代培养物的一个例子。如图所示，我们证实M1（ 图1A，B）和M 2（ 图1C，D） 的巨噬细胞的亚型，在培养的第12天由相显微镜在低（ 图1A，C）和高（ 图1B，D的均匀性）的放大倍率。显然，我们观察到的巨噬细胞M1和M2的一个独特的形态学在12天后原代培养。如先前所发表的，我们通过RT-PCR验证了mRNA的存在编码TNF和IL1和B在M1巨噬细胞和MRC1 CCL18在M2巨噬细胞14（未示出）。
只有结合这些标准培养物用于蛋白质组学分析。
我们确定了巨噬细胞中，M1（促炎）和M2（抗炎）的两个亚型的2D蛋白模式。为此目的，我们提取M1和M2中培养的巨噬细胞的蛋白质中所详述的协议和M1和M2巨噬细胞，或者用Cy3标记或Cy5的饱和染料来分析蛋白质通过2D DIGE电泳图2呈现M1的代表2D凝胶（ 图2A，B）和M2（ 图2C，D）的质量足够好了生物信息学分析巨噬细胞。观察到无论是M1或M2独立使用Cy3标记的花青染料（ 图2A，C）或Cy5的（ 图2B，D）的蛋白质的相同的图案。在这个例子中，一个大的线性Pħ梯度，使用（3-10）以及用于详细说明与酸性或碱性复蛋白质，窄pH梯度可以使用。
有趣的是，2D凝胶的生物信息学分析揭示了含有可以被分析和使用2D软件相比点20的区域。 图3是numerised 2D凝胶，其中斑点的20区域位于的一个例子。在2D软件是能够量化和比较来自不同样品的几个2D凝胶之间的每一个点的体积。该软件可以量化的增加或减少斑点体积的，这可以通过颜色， 如图3所示的可视化。斑点被认为有显著差异表达，如果归一化的斑点体积的倍数变化如在协议部分第6段表示为大于1.5的p值<0.05以上。两组的巨噬细胞之间的蛋白质或多肽斑点的存在或不存在可通过软件来检测。
图1：巨噬细胞的原代培养物的相差显微照片的 M1的形态的实施例。 （A，B）和M2（C，D），巨噬细胞。 M1巨噬细胞被脂多糖处理得到为4小时，在12天的M2巨噬细胞中由IL-4治疗从第6天开始，直至12天相衬显微镜得到允许明确识别的巨噬细胞的两个亚型。照片在低温（10X）（A，C）和高（40X）（B，D）的放大倍率均在培养12天进行。比例尺：50微米，请点击这里查看该图的放大版本。
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图2：对M1和M2巨噬细胞培养代表的2D DIGE凝胶蛋白质（5微克）的标记或者Cy3标记（A，B）或Cy5的（C，D），从M1（A，B）和M2（C，D）巨噬细胞中培养12天。所使用的标记的花青的独立地得到二维凝胶为M1或M2巨噬细胞中的相同的图案。分子量的位置（先生）标准，显示在左边，等电点标注在凝胶底部。 请点击这里查看该图的放大版本。
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图3：来自巨噬细胞的蛋白质与Progenesis SameSpots软件的代表性2D DIGE凝胶的生物信息学分析中检测到第二十方面来执行M1和M2巨噬细胞之间的差异分析。该图的底部显示的容量点的倍数变化的颜色代码。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
本文所描述的协议详细说明了分析巨噬细胞中，M1（促炎）和M2（抗炎）的两个亚型的各种刺激的影响的方法。的M1和M2巨噬细胞的原代培养物是从单核细胞分化得到的先前公布的7。
的2D DIGE凝胶电泳的方法需要特殊的材料和设备，如等电聚焦，以扫描在对Cy3和Cy5，一个扫描器，用于荧光激发/发射波长下的凝胶两次细胞对于等电聚焦，低荧光板用于SDS-PAGE上和2D软件。这种方法需要一些练习和手巧。
有成功的2D凝胶电泳几个关键步骤：1）蛋白质的提取是在没有任何污染物，如白蛋白或角蛋白的环境中关键的，和2）执行在黑暗中的标记和电泳。避免使用的DTT在裂解缓冲液中的蛋白质的技术减少需要使用的TCEP用于减少肽硫醚键在蛋白质与花青活性染料标记之前。
这个敏感2D DIGE技术允许蛋白质点的差异表达的各种环境条件下的巨噬细胞进行评估，在存在或不存在依赖于子类型的蛋白质。
一个这样的2D DIGE技术的局限性是需要标记的蛋白质上的半胱氨酸残基，其不存在于所述蛋白的14％。另一限制是相对小的数目，可以在相同类型的相比，高通量技术，如定量质谱分析的样品，虽然2D DIGE是成本较低。
微生物刺激，诸如LPS以及Th1型细胞因子，激活巨噬细胞到M1的炎症状态，而Th2细胞因子，如IL-4，第olarize细胞对M2的表型与免疫调节，修复和抗炎作用3。表型M1和M2培养的巨噬细胞中具有或不具有通过蛋白质组学方法宿主的致病性将提供个体亚型的复杂的功能性作用的更详细的图像。在2D DIGE电泳可用于多肽/蛋白质或这些蛋白不同修饰在一种亚型或根据特定的刺激或环境的巨噬细胞的两种亚型之间的翻译后修饰的鉴定有用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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