Introduction
Makrofager er heterogene og plast celler, der er i stand til at erhverve forskellige funktionelle fænotyper. In vivo, disse celler reagerer på en lang række mikro-miljø signalssuch mikrobielle produkter, cytokiner osv. 1. In vitro, pro-inflammatoriske fænotype (M1) af makrofag kan induceres af lipopolysaccharid (LPS) og anti-inflammatoriske fænotype (M2) af visse cytokiner, såsom interleukin-4 (IL-4). Desuden kan makrofager skifte fra et aktiveret M1 M2 fænotype, og omvendt ved specifikke signaler 2.
Afhængigt af fænotype, vil makrofager har forskellige funktioner. M1 makrofager er celler, der producerer proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor α (TNF-α), til at dræbe mikroorganismer eller tumorceller 3. I modsætning hertil M2 makrofager forebygge disse inflammatoriske respons som i sårheling og fibrose ved at producere anti-inflammatory faktorer, såsom TGF-β 3,4.
Humane perifere blod-mononukleære celler fra raske donorer blev isoleret ved Ficoll densitetsgradientcentrifugering som tidligere beskrevet 5 ved anvendelse af en teknik, tilpasset fra Boyum 6. Makrofager i kultur kan differentieres i M1 eller M2 fænotype efter 6 dages primær kultur 7.
Analyse af protein-ekspression eller protein ændringer mellem de to undertyper af makrofager under forskellige kontrollerede stimuli, såsom vært sygdomsfremkaldende virkninger eller mikrobielle toksiner, vil være nyttigt at dechifrere funktionaliteten af pro- og anti-inflammatoriske makrofager.
Proteomics er unikke værktøjer til direkte overvågning af proteiner, der er specifikt op- eller nedreguleret i humane dyrkede makrofager under forskellige stimuli. Fluorescerende farvestoffer har løst nogle af begrænsningerne ved 2D-gelelektroforese, såsom lav følsomhed og billedanalyse 8 < / Sup>. De farvestoffer, der reagerer med cysteinrester har øget detektionsfølsomheden forhold til dem reagere med lysinrester 9. I en tidligere undersøgelse, vi demonstreret nytten af DIGE mætning mærkning til analyse af knappe prøver 10 i forhold til den klassiske sølvfarvet 2D elektroforese 11. Denne teknologi er nyttigt i hurtigt at analysere protein ændringerne mellem de to undertyper af makrofager eller mellem ubehandlede og behandlede makrofager fra samme subtype.
Fordelene ved denne proteomisk teknik har adgang til information af protein størrelse og post-translationelle modifikationer ved at analysere 2D gel 12. Det bør tages i betragtning, at dette ikke er en high throughput teknik, som begrænser antallet af prøver, der kan analyseres. Udviklingen af high throughput assays baseret på massespektrometri som revideret for nylig 13 kan forbedre denne.
_content "> Her præsenterer vi, hvordan du udfører 2D DIGE analyse fra proteinekstraktion af dyrkede makrofager gennem de processer af elektroforese, isoelektrofokusering, og SDS-PAGE samt oplysninger om nytten af tilstrækkelig 2D software.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne i vores institutioner menneskelig videnskabsetisk komité. Buffy coat fra raske donorer blev opnået fra Regional Blood Transfusion Center (Lille, Frankrig). Prøver fra de buffy coats er erklæret som en Inserm samling (n ° DC2010-1209).
1. Materiale og Kultur Medier Forberedelse
- Fortynd 10x Phosphate Buffer Saline (PBS) i sterilt destilleret vand til opnåelse af 1 x PBS.
- Gøre RPMI 1640-medium suppleret med gentamicin (40 ug / ml) og L-glutamin (2 mM), med og uden 10% poolet humant serum.
2. Primære kulturer af monocytafledte makrofager (MDM)
- Fortynd buffycoat (25 ml) med 1x PBS. Omhyggeligt læsse på Ficoll / leucosep rør og centrifugeres ved 1.600 xg i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Saml monocytter ved grænsefladen i et nyt rør. Vask 3 x med 10 ml 1x PBS indeholdende 0,1% ethylendiamintetraeddikesyreeddikesyre (EDTA) ved successive centrifugeringer ved 1000 xg, 370 xg og 160 xg i 10 minutter hver, og derefter en gang i 1 x PBS alene ved 160 xg i 10 min.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml RPMI-1640-medium uden serum og pode celler i 35 mm-skåle ved en densitet på 1 x 10 6 celler pr skålen.
- Efter sedimentering i 90 minutter i inkubatoren, kasseres supernatanten indeholdende det ikke-klæbende celler. Vask de adhærente celler, som består af monocytter, 3x med 1 ml PBS; tilsæt derefter 1 ml frisk medium indeholdende 10% (vol / vol) humant serum til de tidligere serumfrie celler.
- Efter 6 dages dyrkning for at give alternative differentierede makrofager (M2) tilføjes rekombinant human IL-4 (15 ng / ml) og opretholde i 6 dage. Derefter behandle differentierede makrofager med lipopolysaccharid (100 ng / ml) på dag 12 i 4 timer til opnåelse af M1 makrofager.
3. Udvinding af M1 og M2 Makrofager Proteiner for 2D elektroforese
- Vask macrophalderen tre gange med 25 mM Tris, pH 7,4, og skrot i buffer indeholdende 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M thiourinstof og 7 M urinstof.
- Lyserer celler under anvendelse af en blander egnet til 1,5 ml mikrocentrifugerør i 5 minutter i is og opbevares ved -20 ° C.
- Bestemme proteinkoncentration anvendelse af et kommercielt Bradford reagens. Opbevar 100 pi alikvoter af proteinerne ved -20 ° C indtil anvendelse.
4. isoelektrofokusering
BEMÆRK: Udfør alle procedurer for mærkning i mørke.
- Reducer 5 ug af hver prøve (M1 og M2 makrofager) tilpasset til 9 pi med lysepuffer med 2 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) i 1 time ved 37 ° C.
- Tilføj cyanin 3 (Cy3) til M1 ekstrakt og M2 sulfhydryl-reaktivt farvestof ekstrakt ved en koncentration på 0,8 nM / ug protein. Tilføj cyanin 5 (Cy5) til M1 og M2 ekstrakter ved en koncentration på 0,8 nM / ug protein og inkuberesi 30 minutter ved 37 ° C.
- Reaktionen standses ved tilsætning af et lige volumen af prøvebuffer indeholdende 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 130 mM dithiothreitol (DTT) og 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-mærket M1 prøver med Cy5-mærkede M2 prøver i den ene hånd og Cy3-mærket M2 prøver med Cy5-mærkede M1 prøver i en anden hånd.
- Rehydrere en immobiliseret pH-gradient (IPG) strimmel (240 mm, pH 3-10 lineær gradient) med 450 pi af mærkede blandede prøver i buffer indeholdende 7 M urinstof, 2 M thiourinstof og 4% CHAPS på en isoelektrisk fokusering (IEF) cellesystem i 24 timer uden at anvende nogen strøm.
- Udføre fokusering ved 300 volt (V) i 3 timer, og derefter ved en gradient til 1000 V i 6 timer ved en gradient til 8.000 V i 3 timer og endelig ved 8.000 V i 3 timer.
5. Second Dimension
BEMÆRK: Udfør alle elektroforese procedurer i mørke.
- Inkuber IPG strimler i ækvilibreringsbuffer indeholdering 0,1 mM Tris-HCI (pH 8), 6 M urinstof, 2% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 30% (v / v) glycerol i 10 minutter.
- Overfør ækvilibrerede IPG strimler til den anden dimension (SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE)) på 12,5% PAGE-geler og tætne med lavtsmeltende agarose.
- Udføre elektroforese ved 20 ° C under anvendelse af en Ettan-Daltsix systemet ved en konstant spænding på 70 V natten over efterfulgt af 300 V, indtil bromphenolblåt foran når bunden af gelen.
6. Image Acquisition og Bioinformatik Analysis
- Scan geler afgivne mellem de to lave fluorescens glasplader med en DIGE Imager scanner ved excitation / emission bølgelængder 532/580 nm for Cy3 og 633/670 nm for Cy5 at give billeder med en pixelstørrelse på 100 um.
- Udføre billedanalyse med kommerciel software som tidligere beskrevet 12.
- Beregn og normalisere spot mængder i hvert billede. Tildele en normaliseret spot volumen som en proportion af den samlede værdi af hver plet påvist i gelen.
- Analyser forskellene i protein spot mængder for hver type af makrofager ved at sammenligne den normaliserede stedet volumen værdi mellem de to grupper (M1 og M2). Overvej forskellen mellem stedet mængder for at være signifikant, hvis ændringen er 1,5 fold (p <0,05, envejs-ANOVA-analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at udføre passende differential proteomanalyse, bør behandling af prøver der skal analyseres verificeres.
I de præsenterede eksempel er kvaliteten af makrofager cellekultur kræves for morfologiske og molekylære aspekter som tidligere offentliggjort 5. Differentieringen af monocytter til makrofager og homogeniteten af kulturen blev efterfulgt af fase-mikroskopi. Figur 1 viste et eksempel på primære kulturer af M1 og M2 makrofager. Som vist, vi bekræftet homogeniteten af M1 (figur 1A, B) og M2 (figur 1C, D) undertyper af makrofager på dag 12 kulturområdet ved fase-mikroskopi ved lave (figur 1A, C) og høj (figur 1B, D ) forstørrelse. Klart, observerede vi en særskilt morfologi af makrofager M1 og M2 efter 12 dages primær kultur. Som tidligere offentliggjort vi bekræftet ved RT-PCR for tilstedeværelsen af mRNA, der koder for TNF og IL1B i M1 makrofager og for MRC1 og CCL18 i M2 makrofager 14 (ikke vist).
Kun kulturer kombinerer disse kriterier blev anvendt til proteomanalyse.
Vi bestemt 2D proteinmønstre af de to undertyper af makrofager, M1 (pro-inflammatorisk) og M2 (anti-inflammatorisk). Til det formål har vi ekstraheret proteiner fra M1 og M2 dyrkede makrofager som beskrevet i protokollen, og M1 og M2 makrofager blev enten mærket med Cy3 eller Cy5 mætning farvestoffer til at analysere proteiner ved 2D DIGE elektroforese. Figur 2 viser repræsentative 2D-geler af M1 ( figur 2A, B) og M2 (figur 2C, D) makrofager af tilstrækkelig kvalitet til bio-analyse. Det samme mønster af proteiner blev observeret for hverken M1 eller M2 uafhængigt af cyaninfarverne anvendte Cy3 (figur 2A, C) eller Cy5 (figur 2B, D). I dette eksempel en stor lineær pH gradient blev anvendt (3-10), og for en nærmere proteiner med en sur eller basisk pl kan snævert pH-gradient anvendes.
Interessant bioinformatik analyse af 2D-gel afslørede 20 områder med pletter, der kan analyseres og sammenlignes ved hjælp af 2D-software. Figur 3 er et eksempel på numerised 2D gel, i hvilken de 20 områder af pletter er placeret. 2D software er i stand til at kvantificere og sammenligne mængden af hver plet mellem flere 2D-geler fra forskellige prøver. Softwaren kan kvantificere stigning eller fald af spot volumen og dette kan visualiseres ved farve som vist i figur 3. Steder anses for at have væsentlig forskel udtrykket, hvis fold-ændring af normaliserede spot mængder som anført i punkt 6 i protokol sektion var større end 1,5 med en p-værdi <0,05. Tilstedeværelsen eller fraværet af et protein eller polypeptid stedet mellem de to grupper af makrofager kan detekteres af softwaren.
Figur 1: Fotografier af fasekontrastmikroskopi af primær kultur af makrofager Eksempel på morfologi M1. (A, B) og M2 (C, D) makrofager. M1 makrofager blev opnået ved lipopolysaccharide behandling i 4 timer på dag 12. M2 makrofager blev opnået ved IL-4 behandling startende fra dag 6 til dag 12. Fasekontrastmikroskopi muliggør klar identifikation af de to undertyper af makrofager. Fotografier ved lav (10x) (A, C) og høj (40X) (B, D) forstørrelse blev udført på dag 12 af kulturen. Scale bar:. 50 um Klik her for at se en større udgave af dette tal.
EEP-together.within-page = "altid"> 
Figur 2:. Repræsentant 2D DIGE gel af M1 og M2 dyrkede makrofager Proteiner (5 ug) blev mærket med enten Cy3 (A, B) eller Cy5 (C, D) fra M1 (A, B) og M2 (C, D) makrofager dyrket i 12 dage. Det samme mønster af 2D-gel for M1 eller M2 makrofager blev opnået uafhængigt af det mærkede cyanin anvendes. Positionerne af molekylvægt (Mr) standarder er angivet til venstre, og pi er angivet på bunden af gelen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
"/>
Figur 3:. Bioinformatik analyse af en repræsentativ 2D DIGE gel fra makrofag proteiner med Progenesis SameSpots software Tyve områder blev påvist at udføre differential analyse mellem M1 og M2 makrofager. Bunden af figuren viser farvekoden for fold-ændring af volumen pletter. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne protokol detaljer en metode til at analysere effekten af forskellige stimuli af de to undertyper af makrofager, M1 (pro-inflammatorisk) og M2 (anti-inflammatorisk). Primære kulturer af M1 og M2 makrofager blev opnået fra differentieringen af monocytter som tidligere publiceret 7..
Fremgangsmåden i 2D DIGE gelelektroforese kræver specialiserede materialer og udstyr, såsom IEF celle til isoelektrofokusering med lav fluorescens plader til SDS-PAGE for at scanne to gange gelen ved excitation / emission bølgelængden til Cy3 og Cy5, en scanner til fluorescens og 2D software. Denne metode kræver lidt øvelse og håndelag.
Der er flere kritiske trin for vellykket 2D-gelelektroforese: 1) ekstraktion af proteiner er afgørende i et miljø uden kontaminanter, såsom albumin eller keratin, og 2) at udføre mærkning og elektroforese i mørke. Undgåanvendelse af DTT for protein reduktion i lysisbuffer som en teknik kræver anvendelse af TCEP til reduktion peptid sulfid bindinger i proteiner før mærkning med cyanin reaktivfarvestoffer.
Dette følsomme 2D DIGE teknik muliggør vurderingen af differentiel ekspression af protein spots af makrofager under forskellige miljøforhold, i nærvær eller fravær af proteiner, afhængig af undertype.
En af begrænsningerne ved denne 2D DIGE teknik er behovet for at mærke proteinerne på cysteinresten, der er til stede i 14% af proteinet. Den anden begrænsning er den relativt lille antal prøver, der kan analyseres på samme type i forhold til high throughput teknologi som kvantitativ massespektrometri, selvom 2D DIGE er mindre omkostningskrævende.
Mikrobielle stimuli, såsom LPS samt Th1 cytokiner, aktivere makrofager i en M1 inflammatorisk tilstand, mens Th2-cytokiner, såsom IL-4, polarize celler til en M2 fænotype med immunregulatoriske, reparation og anti-inflammatoriske funktioner 3. Fænotype M1 og M2 dyrkede makrofager med eller uden vært patogenicitet gennem proteomikdatabanker tilgange vil give et mere detaljeret billede af den komplekse funktionelle rolle af individuelle undertyper. 2D DIGE elektroforese kan være nyttige til identifikation af polypeptider / proteiner eller post-translationelle modifikationer af disse proteiner forskelligt modificerede i én subtype eller mellem de to undertyper af makrofager under særlige stimuli eller miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
