Introduction
Macrofagen zijn heterogeen en plastic cellen die kunnen verschillende functionele fenotypes verwerven. In vivo, deze cellen reageren op een grote verscheidenheid aan micro milieu signalssuch microbiële producten, cytokines, etc. 1. In vitro, de pro-inflammatoire fenotype (M1) macrofagen kunnen worden geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) en de anti-inflammatoire fenotype (M2) van bepaalde cytokines zoals interleukine-4 (IL-4). Bovendien kunnen macrofagen schakelen van een geactiveerde M1 M2 fenotype, en omgekeerd, op specifieke signalen 2.
Afhankelijk van het fenotype, zal macrofagen verschillende functies. M1 macrofagen cellen die pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor α (TNF-α) produceren, micro-organismen of tumorcellen 3 doden. Daarentegen M2 macrofagen voorkomen dat deze ontstekingsreactie zoals in wondgenezing en fibrose van die anti-inflammatory factoren zoals TGF-β 3,4.
Humane perifere bloed mononucleaire cellen van gezonde donoren werden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie zoals eerder beschreven 5 met een techniek aangepast van Boyum 6. Macrofagen in cultuur kan worden onderscheiden in M1 of M2 fenotype na 6 dagen van de primaire cultuur 7.
Analyse van eiwitexpressie of eiwit bij de twee subtypes van macrofagen bij verschillende gecontroleerde stimuli, zoals gastheer pathogeniteit of microbiële toxinen, zal nuttig zijn om de functionaliteit van de pro- en anti-inflammatoire macrofagen ontcijferen.
Proteomics zijn unieke instrumenten voor directe controle van eiwitten die specifiek up- of down-gereguleerd in menselijke gekweekte macrofagen onder verschillende stimuli. Fluorescerende kleurstoffen opgelost aantal beperkingen van 2D gel elektroforese, zoals lage gevoeligheid en beeldanalyse 8 < / Sup>. De kleurstoffen reactie met cysteïne residuen de detectiegevoeligheid vergeleken met die reageren met lysineresten 9 verhoogd. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van DIGE verzadiging etikettering van de analyse van schaarse monsters 10 met de klassieke zilvergevlekte 2D electroforese 11. Deze techniek is nuttig bij het snel analyseren eiwitmodificaties tussen de twee subtypes van macrofagen of tussen onbehandelde en behandelde macrofagen uit hetzelfde subtype.
De voordelen van deze techniek zijn proteomische toegang tot de informatie van eiwitgrootte en post-translationele modificaties die door analyse van de 2D gel 12. Er moet rekening mee dat dit geen hoge doorvoer techniek worden gehouden, waardoor het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd. De ontwikkeling van high throughput assays op basis van massaspectrometrie als beoordeeld onlangs 13 kan dit verbeteren.
_content "> Hier presenteren we hoe 2D DIGE analyse van het eiwit extractie van gekweekte macrofagen te voeren door middel van de processen van elektroforese, isoelectrofocusing, en SDS-PAGE, evenals informatie over het nut van adequate 2D software.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van onze instellingen menselijk-ethische toetsingscommissie. Buffy coat van gezonde menselijke donoren werden verkregen uit het Regionaal Bloedtransfusie Center (Lille, Frankrijk). Monsters uit de buffy coats worden gedeclareerd als een Inserm collectie (n ° DC2010-1209).
1. Materiaal en Cultuur Media Voorbereiding
- Verdun 10x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) in steriel gedestilleerd water tot 1x PBS verkrijgen.
- Voeg RPMI 1640 medium aangevuld met gentamicine (40 ug / ml) en L-glutamine (2 mM), met en zonder 10% gepoold humaan serum.
2. Primaire culturen van Monocyt afgeleide macrofagen (MDM)
- Verdun buffycoat (25 ml) met 1x PBS. Vul voorzichtig op een Ficoll / Leucosep buis en centrifugeer bij 1600 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Verzamel monocyten aan het grensvlak in een nieuwe buis. 3x wassen met 10 ml 1x PBS dat 0,1% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) door opeenvolgende centrifugeren bij 1000 xg, 370 xg en 160 xg gedurende 10 min elk, en vervolgens eenmaal in 1x PBS alleen bij 160 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml RPMI-1640 medium zonder serum en zaden de cellen in 35 mm schalen bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen per schaal.
- Na sedimentatie gedurende 90 min in de incubator, gooi het supernatant dat de niet-hechtende cellen. Was de hechtende cellen, bestaande uit monocyten, 3x met 1 ml PBS; voeg 1 ml vers medium bevattende 10% (v / v) humaan serum de eerder serumvrije cellen.
- Na 6 dagen kweken alternatieve gedifferentieerde macrofagen (M2) wordt verkregen, voeg recombinant humaan IL-4 (15 ng / ml) en handhaven 6 dagen. Daarna kunt gedifferentieerde macrofagen met lipopolysaccharide (100 ng / ml) op dag 12 gedurende 4 uur tot M1 macrofagen te verkrijgen.
3. Extractie van M1 en M2 Macrophage Eiwitten voor 2D-elektroforese
- Wash macrophleeftijden driemaal met 25 mM Tris, pH 7,4, en afval in buffer die 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS), 2 M thioureum en 7 M ureum.
- Lyse cellen met een geschikte mixer gedurende 1,5 ml microcentrifuge buisjes gedurende 5 min in ijs en bewaar bij -20 ° C.
- Bepaal eiwitconcentratie met een commercieel Bradford reagens. WINKEL 100 ul aliquots van de eiwitten bij -20 ° C tot gebruik.
4. Isoelectrofocusing
OPMERKING: Voer alle procedures etikettering in het donker.
- Verminder 5 pg van elk monster (M1 en M2 macrofagen) ingesteld op 9 ul met lysis buffer met 2 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Cyanine 3 (Cy3) M1 en M2 extract sulfhydryl-reactieve kleurstof extract toe in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit. Cyanine 5 (Cy5) aan M1 en M2 onttrekt in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit en incubeergedurende 30 min bij 37 ° C.
- Stop de reactie met de toevoeging van een gelijk volume van monsterbuffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 130 mM dithiothreitol (DTT) en 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-gelabeld M1 monsters met een Cy5-gelabelde M2 monsters per hand en Cy3-gelabeld M2 monsters met een Cy5-gelabelde M1 bemonsteringen in een andere hand.
- Rehydrateren een geïmmobiliseerde pH-gradiënt (IPG) strip (240 mm, pH 3-10 lineaire gradiënt) met 450 pl gemerkte gemengde monsters in buffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum en 4% CHAPS op een isoelektrisch focusseren (IEF) celsysteem gedurende 24 uur zonder dat enige stroom.
- Voer scherpgesteld bij 300 volt (V) gedurende 3 uur en vervolgens met een gradiënt tot 1000 V gedurende 6 uur, bij een verloop op 8000 V gedurende 3 uur en tenslotte bij 8000 V gedurende 3 uur.
5. Tweede dimensie
OPMERKING: Voer alle elektroforese procedures in het donker.
- Incubeer de IPG strips in equilibratiebuffer bevattening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M ureum, 2% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS) en 30% (v / v) glycerol gedurende 10 min.
- Breng de geëquilibreerde IPG strips voor de tweede dimensie (SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE)) op 12,5% PAGE gels en afdichting met laagsmeltende agarose.
- Voeren elektroforese bij 20 ° C met een Ettan-Daltsix systeem een constante spanning van 70 V overnacht gevolgd door 300 V tot de broomfenolblauw achterkant onderkant van de gel bereikt.
6. Image Acquisition en Bioinformatica analyse
- Scan gels geworpen tussen de twee lage fluorescentie glasplaten met een DIGE Imager scanner bij excitatie / emissie golflengten van 532/580 nm voor Cy3 en 633/670 nm voor Cy5 om beelden te leveren met een pixelgrootte van 100 micrometer.
- Voer beeldanalyse met commerciële software zoals eerder beschreven 12.
- Bereken en normaliseren spot volumes in elk beeld. Wijs een genormaliseerde spot volume als stutortion van de totale waarde van elke vlek waargenomen in de gel.
- Analyse van de verschillen in eiwitpunt volumes elk van macrofagen door de genormaliseerde plaatse volumewaarde tussen de twee groepen (M1 en M2) vergelijken. Beschouw het verschil tussen de vlekvolumes significant beschouwd als de verandering 1,5- (p <0,05, eenzijdige ANOVA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om passende differentiële proteomics analyses uit te voeren, moet de verwerking van de te analyseren monsters worden geverifieerd.
In de gepresenteerde voorbeeld, wordt de celkweek kwaliteit van macrofagen die voor morfologische en moleculaire aspecten eerder gepubliceerd 5. De differentiatie van monocyten in macrofagen en de homogeniteit van de kweek werd gevolgd door fase-microscopie. Figuur 1 vertoonde een voorbeeld van primaire, M1 en M2 macrofagen. Zoals getoond, werd nagegaan de homogeniteit van M1 (figuur 1A, B) en M2 (Figuur 1C, D) subtypes van macrofagen op dag 12 van kweek door fase-microscopie bij lage (Figuur 1A, C) en hoog (Figuur 1B, D ) vergroting. Het is duidelijk, we zagen een duidelijke morfologie van macrofagen M1 en M2 na 12 dagen van de primaire cultuur. Zoals eerder gepubliceerd, hebben we geverifieerd door RT-PCR op de aanwezigheid van mRNA dat codeert voor TNF en IL1B in M1 macrofagen en MRC1 en CCL18 in M2 macrofagen 14 (niet getoond).
Alleen culturen combineren die criteria werden gebruikt voor proteomics analyse.
We bepaalden de 2D eiwitpatronen van de twee subtypes van macrofagen, M1 (pro-inflammatoire) en M2 (anti-inflammatoire). Daartoe we geëxtraheerde eiwitten van M1 en M2 macrofagen zoals beschreven in het protocol en M1 en M2 macrofagen werden ofwel gemerkt met Cy3 of Cy5 kleurstoffen verzadiging aan de eiwitten door 2D DIGE elektroforese geanalyseerd. Figuur 2 toont representatieve 2D gels M1 ( figuur 2A, B) en M2 (figuur 2C, D) macrofagen van voldoende kwaliteit voor bio analyse. Hetzelfde patroon van eiwitten werd waargenomen voor M1 en M2 onafhankelijk van de cyanine kleurstoffen Cy3 (Figuur 2A, C) of Cy5 (Figuur 2B, D). In dit voorbeeld, een grote lineaire pH gradiënt werd gebruikt (3-10) en detaillering eiwitten met een zure of basische pl, kan smal pH-gradiënt te gebruiken.
Interessant is dat de bioinformatica analyse van de 2D gel onthulde 20 gebieden die plekken die kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met de 2D software. Figuur 3 is een voorbeeld van numerised 2D gel waarin de 20 gebieden plekken bevinden. De 2D software kan kwantificeren en vergelijken het volume van elke plek tussen verschillende 2D gels van verschillende monsters. De software kan de stijging of daling van spot volume te kwantificeren en dit kan worden gevisualiseerd door kleur, zoals aangegeven in figuur 3. Spots worden beschouwd als significant differentiële expressie hebben als de vouw-verandering van de genormaliseerde spot volumes, zoals aangegeven in paragraaf 6 van protocol gedeelte was groter dan 1,5 met een p-waarde <0,05. De aanwezigheid of afwezigheid van een eiwit of polypeptide plek tussen de twee groepen macrofagen kunnen worden gedetecteerd door de software.
Figuur 1: Foto's van fase-contrast microscopie van de primaire cultuur van macrofagen Voorbeeld van de morfologie van de M1. (A, B) en M2 (C, D) macrofagen. M1 macrofagen werden verkregen door lipopolysacharide behandeling gedurende 4 uur op dag 12. M2 macrofagen werden verkregen door IL-4 behandeling vanaf dag 6 tot en met dag 12. Fase-contrast microscopie laat een duidelijke identificatie van beide subtypes van macrofagen. Foto's bij lage (10x) (A, C) en hoge (40X) (B, D) vergroting werden uitgevoerd op dag 12 van de cultuur. Schaal bar:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
EEP-together.within-page = "always"> 
Figuur 2:. Representatieve 2D DIGE gel van M1 en M2 macrofagen Proteins (5 ug) werden gemerkt met Cy3 of (A, B) of Cy5 (C, D) M1 (A, B) en M2 (C, D) macrofagen gekweekt gedurende 12 dagen. Hetzelfde patroon van 2D gel M1 of M2 macrofagen werd onafhankelijk van de gebruikte gelabelde cyanine verkregen. De posities van moleculair gewicht (Mr) normen worden aangegeven aan de linkerkant, en de Pi is aangegeven op de onderkant van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
"/>
Figuur 3:. Bioinformatica analyse van een representatieve 2D DIGE gel van macrofaag-eiwitten met Progenesis SameSpots software Twintig gebieden werden ontdekt aan de differentiële analyse tussen M1 en M2 macrofagen voeren. De onderkant van de figuur geeft de kleurcode voor de vouw-verandering van het volume plekken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven protocol Gegevens methode om de invloed van verschillende stimuli van de twee subtypes van macrofagen, M1 (pro-inflammatoire) en M2 (anti-inflammatoire) geanalyseerd. Primaire, M1 en M2 macrofagen werden verkregen van de differentiatie van monocyten als eerder gepubliceerd 7.
De procedure van 2D DIGE gelelektroforese speciale materialen en uitrusting, zoals IEF cel isoelectrofocusing lage fluorescentie platen voor de SDS-PAGE om tweemaal de gel bij excitatie / emissie golflengte voor Cy3 en Cy5, een scanner voor fluorescentie scan vereist en 2D software. Deze methode vereist enige oefening en handvaardigheid.
Er zijn verschillende kritische stappen voor succesvolle 2D gelelektroforese: 1) de winning van eiwitten is essentieel in een omgeving zonder verontreinigingen zoals albumine of keratine, en 2) het uitvoeren van de etikettering en elektroforese in het donker. Vermijd degebruik van DTT tot verlaging eiwit in de lysis buffer als de techniek vereist het gebruik van TCEP ter vermindering peptide sulfide bindingen in proteïnen voor etikettering met cyanine reactieve kleurstoffen.
Deze gevoelige 2D DIGE techniek worden nagegaan of de differentiële expressie van eiwit spots door macrofagen onder verschillende omgevingsomstandigheden, in aanwezigheid of afwezigheid van eiwitten afhankelijk van het subtype.
Eén van de beperkingen van deze 2D DIGE techniek is de noodzaak om de eiwitten te labelen op de cysteïnerest, die afwezig is in 14% van het eiwit. De andere beperking is het relatief kleine aantal monsters dat kan worden geanalyseerd hetzelfde type in vergelijking met high throughput technologie zoals kwantitatieve massaspectrometrie, hoewel 2D DIGE minder kostbaar.
Microbiële stimuli zoals LPS en Th1 cytokines, macrofagen activeren in een M1 inflammatoire toestand, terwijl Th2 cytokinen, zoals IL-4, polarize cellen aan een M2 fenotype met immunoregulerende, herstellen en anti-inflammatoire functies 3. Fenotypering M1 en M2 macrofagen met of zonder gastheer pathogeniteit door proteomics aanpak zal een meer gedetailleerd beeld van de complexe functionele rol van individuele subtypen bieden. De 2D DIGE elektroforese kunnen nuttig zijn voor de identificatie van polypeptiden / eiwitten of post-translationele modificaties van eiwitten die differentieel gemodificeerd één subtype of tussen de twee subtypes van macrofagen onder bepaalde stimuli of milieu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
