Introduction
Makrophagen sind heterogen und Kunststoff-Zellen, die in der Lage, verschiedene funktionelle Phänotypen zu erwerben sind. In vivo werden diese Zellen auf eine Vielzahl von Mikroumwelt signalssuch mikrobielle Produkte, Cytokine, etc. 1 In vitro. Die pro-inflammatorischen Phänotyps (M1) von Makrophagen durch Lipopolysaccharid (LPS) und dem anti-inflammatorischen Phänotyps (M2) durch einige Cytokine, wie Interleukin-4 (IL-4) induziert werden. Darüber hinaus können Makrophagen aus einem aktivierten M1 bis M2 Phänotyp zu wechseln, und umgekehrt, auf spezifische Signale 2.
Abhängig von der Phänotyp wird Makrophagen verschiedene Funktionen haben. M1 Makrophagen sind Zellen, die pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNF-α) zu erzeugen, um Mikroorganismen oder Tumorzellen 3 töten. Im Gegensatz dazu M2 Makrophagen verhindern, dass diese Entzündungsreaktion wie bei der Wundheilung und Fibrose durch die Herstellung anti inflammatory Faktoren wie TGF-β 3,4.
Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden Spendern wurden durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie zuvor beschrieben 5 wird eine von Boyum 6 angepaßt isoliert. Makrophagen in Kultur kann nach 6 Tagen Primärkultur 7 in M1 oder M2-Phänotyp unterschieden werden.
Analyse der Proteinexpression oder Proteinveränderungen zwischen den beiden Subtypen von Makrophagen unter verschiedenen gesteuerten Reize, wie Host Pathogenität oder mikrobielle Toxine, hilfreich sein, um die Funktionalität der pro- und anti-inflammatorischen Makrophagen zu entschlüsseln.
Proteomics sind einzigartige Werkzeuge zur direkten Überwachung von Proteinen, die spezifisch nach oben oder in der menschlichen kultivierten Makrophagen unter verschiedenen Stimuli herunterreguliert sind. Fluoreszierende Farbstoffe haben einige der Einschränkungen der 2D-Gelelektrophorese, wie niedrige Empfindlichkeit und Bildanalyse 8 gelöst < / Sup>. Die Farbstoffe reagieren mit Cystein-Reste haben die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu denen der Reaktion mit Lysinresten 9 erhöht. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Nützlichkeit DIGE Sättigungs Markierung für die Analyse von Proben knapp 10 gegenüber dem klassischen silbergefärbten 2D-Elektrophorese 11. Diese Technologie ist hilfreich bei der schnellen Analyse von Proteinmodifikationen zwischen den zwei Subtypen von Makrophagen oder zwischen unbehandelten und behandelten Makrophagen aus dem gleichen Subtyp.
Die Vorteile dieser Technik sind Proteomik, die Zugang zu den Informationen der Proteingröße und post-translationalen Modifikationen durch Analyse der 2D-Gel-12. Es sollte berücksichtigt werden, dass dies nicht ein hoher Durchsatz-Technik entnommen werden, wodurch die Anzahl der Proben, die analysiert werden können. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays, die auf Massenspektrometrie als prüft kürzlich 13 kann dies zu verbessern.
_content "> Hier präsentieren wir, wie man 2D DIGE Analyse aus der Proteinextraktion von kultivierten Makrophagen durch die Prozesse der Elektrophorese Isoelektrofokussierung durchzuführen, und SDS-PAGE sowie Informationen über den Nutzen einer angemessenen 2D-Software.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien unserer Institutionen menschlichen Forschungsethikkommission. Buffy-Coat von gesunden menschlichen Spendern wurden aus dem regionalen Blutspendezentrum (Lille, Frankreich) erhalten. Proben aus den Buffy Coats erhalten werden als Inserm Sammlung (n ° DC2010-1209) erklärt.
1. Material und Kultur Medienvorbereitung
- Verdünnen 10x Phosphatpuffer Saline (PBS) in sterilem destilliertem Wasser, um 1x PBS erhalten.
- Machen RPMI 1640 Medium mit Gentamicin (40 ug / ml) und L-Glutamin (2 mM), mit und ohne 10% gepooltem Humanserum.
2. Primärkulturen von Monozyten abgeleitete Makrophagen (MDM)
- Verdünnte Buffycoat (25 ml) mit 1x PBS. Sorgfältig auf einem Ficoll / Leucosep Rohr und Zentrifuge laden bei 1.600 × g für 20 min bei Raumtemperatur.
- Sammeln Monozyten an der Schnittstelle in ein neues Röhrchen. Waschen 3x mit 10 ml 1 × PBS mit 0,1% EthylendiamintetraEssigsäure (EDTA) durch aufeinanderfolgende Zentrifugation bei 1.000 × g, 370 xg und 160 g für 10 min jeweils, und dann einmal in 1 × PBS allein bei 160 × g für 10 min.
- Zellpellet in 5 ml RPMI-1640-Medium ohne Serum und Samen, die Zellen in 35 mm-Schalen in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen pro Schale.
- Nach der Sedimentation für 90 min im Brutschrank, den Überstand verwerfen die nicht-adhärenten Zellen enthält. Die adhärenten Zellen zu waschen, die aus Monozyten, 3 x mit je 1 ml PBS; dann 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% (v / v) Humanserum zu den zuvor serumfreie Zellen.
- Nach 6 Tagen in Kultur, um alternative differenzierten Makrophagen (M2) zu erhalten, fügen rekombinantes humanes IL-4 (15 ng / ml) und für 6 Tage beibehalten. Dann behandeln differenzierten Makrophagen mit Lipopolysaccharid (100 ng / ml) am Tag 12 für 4 h auf M1 Makrophagen zu erhalten.
3. Extraktion von M1 und M2 Makrophagen Proteine für 2D-Elektrophorese
- Wash macrophAlter dreimal mit 25 mM Tris, pH 7,4, und Schrott in Puffer, enthaltend 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M Thioharnstoff und 7 M Harnstoff.
- Lyse-Zellen unter Verwendung eines Mischers für 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 5 min in Eis und bei -20 ° C.
- Bestimmen Proteinkonzentration unter Verwendung eines kommerziellen Bradford-Reagenz. Speichern 100 ul Aliquots der Proteine bei -20 ° C bis zur Verwendung.
4. Isoelektrofokussierung
HINWEIS: Führen Sie alle Markierungsverfahren in der Dunkelheit.
- Verringern 5 ug jeder Probe (M1 und M2 Makrophagen) mit 2 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) für 1 h auf 9 & mgr; l mit Lysepuffer eingestellt auf 37 ° C.
- Hinzufügen Cyanin 3 (Cy3) bis M1 und M2 Extrakt Sulfhydryl-reaktive Farbstoffextrakt in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein. Hinzufügen Cyanin 5 (Cy5) bis M1 und M2 Extrakte in einer Konzentration von 0,8 nM / ug Protein und inkubierenfür 30 min bei 37 ° C.
- Stoppen der Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens von Probenpuffer, 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS, 130 mM Dithiothreitol (DTT) und 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-markierten M1 Proben mit Cy5-markierten M2 Proben in einer Hand und Cy3-markierten M2 Proben mit Cy5-markierten M1 Proben in einer anderen Hand.
- Rehydrieren einen immobilisierten pH-Gradienten (IPG) -Streifen (240 mM, pH 3-10 linearen Gradienten) mit 450 ul der markierten gemischten Proben in Puffer, enthaltend 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% CHAPS auf einer isoelektrischen Fokussierung (IEF) Zellsystem 24 h ohne irgendeine Strom.
- Fokussieren bei 300 Volt (V) für 3 Stunden und dann mit einem Gradienten bis 1000 V für 6 h mit einem Gradienten bis 8000 V für 3 Stunden und schließlich bei 8000 V für 3 Stunden.
5. Zweite Dimension
HINWEIS: Führen Sie alle Elektrophorese Verfahren in der Dunkelheit.
- Inkubieren Sie die IPG-Streifen in Äquilibrierungspuffers enthaltening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M Harnstoff, 2% (w / v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 30% (v / v) Glycerin für 10 min.
- Übertragen die äquilibrierte IPG-Streifen für die zweite Dimension (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)) auf 12,5% PAGE-Gelen und Dichtung mit niedrigschmelzendem Agarose.
- Durchführung der Elektrophorese bei 20 ° C unter Verwendung eines Ettan-Daltsix System bei einer konstanten Spannung von 70 V über Nacht mit 300 V, gefolgt, bis die Bromphenolblau-Front den Boden des Gels erreicht.
6. Image Acquisition und bioinformatische Analyse
- Scan Gele zwischen den beiden Niederfluoreszenzglasplatten gegossen mit einem DIGE Imager Scanner Anregungs- / Emissionswellenlängen von 532/580 nm und 633/670 nm Cy3 für Cy5, um Bilder mit einer Pixelgröße von 100 & mgr; m zu ergeben.
- Führen Sie die Bildanalyse mit kommerzieller Software wie vorher beschrieben 12.
- Berechnen und normalisieren Spotvolumina in jedem Bild. Vergeben Sie einen normalisierten Spotvolumen als Requisitortion des Gesamtwerts jedes Spots detektiert im Gel.
- Analysieren der Unterschiede im Proteinspotvolumen für jede Art von Makrophagen durch Vergleichen der normalisierten Punktvolumenwert zwischen den beiden Gruppen (M1 und M2). Betrachten Sie den Unterschied zwischen den Spotvolumina signifikant zu sein, wenn die Änderung 1,5 fache (p <0,05, one-way ANOVA-Analyse).
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Representative Results
Um entsprechende Differenz Proteomanalyse durchzuführen, sollte die Verarbeitung von zu analysierenden Proben überprüft werden.
Im dargestellten Beispiel ist die Zellkulturqualität von Makrophagen für die morphologische und molekulare Aspekte erforderlich, wie zuvor veröffentlicht 5. Die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und die Homogenität der Kultur wurde durch Phasenmikroskopie verfolgt. Figur 1 zeigt ein Beispiel von primären Kulturen von M1 und M2 Makrophagen. Wie gezeigt, überprüften wir die Homogenität der M1 (1A, B) und M2 (1C, D) Subtypen von Makrophagen an Tag 12 der Kultur durch Phasenmikroskopie bei niedrigen (1A, C) und hoher (1B, D ) Vergrößerung. Klar, beobachteten wir eine deutliche Morphologie der Makrophagen M1 und M2 nach 12 Tagen Primärkultur. Wie zuvor veröffentlichten wir mittels RT-PCR überprüft die Anwesenheit von mRNA für TNF und IL1 CodierungsB in Makrophagen und M1 für MRC1 und CCL18 in M2 Makrophagen 14 (nicht gezeigt).
Nur Kulturen Kombination dieser Kriterien wurden für die Proteomanalyse verwendet.
Wir bestimmten die 2D-Proteinmuster der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (entzündungshemmend). Zu diesem Zweck extrahiert man Proteine aus M1 und M2 kultivierten Makrophagen wie in dem Protokoll beschrieben und M1 und M2 Makrophagen wurden entweder mit Cy3 oder Cy5 Farbstoffen Sättigung, um die Proteine durch 2D-Elektrophorese analysiert DIGE markiert. Figur 2 zeigt repräsentative 2D-Gele von M1 ( 2A, B) und M2 (2C, D) Makrophagen von ausreichender Qualität für Bioinformatik-Analyse. Das gleiche Muster von Proteinen wurde entweder M1 oder M2 unabhängig von den verwendeten Cyaninfarbstoffe Cy3 (2A, C) oder Cy5 (2B, D) beobachtet. In diesem Beispiel wurde eine große lineare pH Gradient wurde verwendet (3-10) und für die Detaillierung Proteine mit einem sauren oder basischen pl können schmale pH-Gradienten verwendet werden.
Interessanterweise ist die Bioinformatik-Analyse der 2D-Gel ergab 20 Bereiche, die Punkte, die analysiert und verglichen unter Verwendung der 2D-Software werden kann, Fig. 3 ist ein Beispiel für numerised 2D-Gel, in dem die 20 Bereiche der Flecken entfernt. Die 2D-Software ist in der Lage, zu quantifizieren und vergleichen Sie die Lautstärke jedes Spots zwischen mehreren 2D-Gelen aus verschiedenen Proben. Die Software kann die Zunahme oder Abnahme der Spotvolumen quantifizieren und dies kann durch Farbe sichtbar gemacht, wie in Abbildung 3 angegeben werden. Spots werden als signifikante differentielle Expression haben, wenn die fold change von normierten Spotvolumina wie in Ziffer 6 der Protokollabschnitt angegeben war größer als 1,5 mit einem p-Wert <0.05. Die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteins oder Polypeptids Stelle zwischen den beiden Gruppen von Makrophagen kann von der Software erkannt werden.
Abbildung 1: Fotografien von Phasenkontrastmikroskopie der Primärkultur von Makrophagen Beispiel Morphologie M1. (A, B) und M2 (C, D) Makrophagen. M1 Makrophagen wurden durch Lipopolysaccharid Behandlung für 4 Stunden am Tag 12. M2 Makrophagen wurden mit IL-4-Behandlung ab Tag 6 bis Tag 12. Die Phasenkontrastmikroskopie erhaltenen ermöglicht eine klare Identifizierung der beiden Subtypen von Makrophagen. Fotografien bei niedrigen (10x) (A, C) und hoher (40X) (B, D) Vergrößerung wurden am Tag 12 der Kultur durchgeführt. Maßstab:. 50 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Fig. 2: Repräsentative 2D DIGE Gel von M1 und M2 kultivierten Makrophagen-Proteine (5 & mgr; g) wurden mit markierten entweder Cy3 (A, B) oder Cy5 (C, D) von M1 (A, B) und M2 (C, D) Makrophagen kultiviert für 12 Tage. Das gleiche Muster von 2D-Gel für M1 oder M2 Makrophagen wurde unabhängig von der markierten Cyaninfarbstoffe verwendet wird, erhalten. Die Positionen der Molekulargewicht (Mr) Standards sind auf der linken Seite angezeigt, und der pI ist auf der Unterseite des Gels angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3:. Bioinformatische Analyse einer repräsentativen 2D DIGE Gel aus Makrophagen Proteine mit Progenesis SameSpots Software wurden Zwanzig Bereiche erfasst, um die Differenzanalyse zwischen M1 und M2 Makrophagen durchzuführen. Die Unterseite der Figur zeigt den Farbcode für die ausklappbaren Volumenänderung Flecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll Details eines Verfahrens, um die Auswirkungen verschiedener Stimuli der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (anti-inflammatorische) analysieren. Primärkulturen von M1 und M2 Makrophagen wurden aus der Differenzierung der Monozyten, erhalten wie zuvor veröffentlichten 7.
Das Verfahren von 2D DIGE Gelelektrophorese erfordert spezielle Materialien und Ausrüstung, wie IEF-Zelle für Isoelektrofokussierung, low-Fluoreszenzplatten für die SDS-PAGE, um die doppelte Gel bei Anregungs- / Emissionswellenlänge für Cy3 und Cy5, einen Scanner zum Scannen Fluoreszenz und 2D-Software. Diese Methode erfordert etwas Übung und Fingerfertigkeit.
Es gibt mehrere wichtige Schritte zur erfolgreichen 2D-Gelelektrophorese: 1) die Extraktion von Proteinen ist entscheidend in einer Umgebung ohne irgendwelche Verunreinigungen, wie Albumin oder Keratin, und 2) Durchführen der Markierung und Elektrophorese in der Dunkelheit. Vermeiden Sie dieVerwendung von DTT Proteinreduktion im Lysepuffer als Technik erfordert die Verwendung TCEP zur Verringerung Peptid Sulfidbindungen in Proteinen vor der Markierung mit Cyanin-Reaktivfarbstoffe.
Dieser empfindliche 2D DIGE Technik erlaubt die Beurteilung der differentiellen Expression der Proteinspots durch Makrophagen unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteinen in Abhängigkeit vom Subtyp.
Eine der Beschränkungen dieses 2D DIGE Technik ist die Notwendigkeit, die Proteine auf der Cysteinrest, der in 14% des Proteins fehlt beschriften. Die andere Begrenzung ist die relativ kleine Anzahl von Proben, die in der gleichen Art im Vergleich zum Hochdurchsatz-Technologie wie quantitative Massenspektrometrie analysiert werden kann, wenn 2D DIGE weniger kostspielig.
Mikrobielle Stimuli wie LPS sowie Th1 Zytokinen aktiviert Makrophagen in einem M1 entzündlichen Zustand, während Th2-Zytokine, wie IL-4, polarize Zellen einem Phänotyp mit immun M2, Reparieren und anti-inflammatorische Funktionen 3. Phänotypisierung M1 und M2 kultivierten Makrophagen mit oder ohne Host Pathogenität durch Proteomik Ansätze liefert ein genaueres Bild von der komplexen funktionellen Rolle der einzelnen Subtypen. Die 2D-Elektrophorese DIGE kann hilfreich sein für die Identifizierung von Polypeptiden / Proteinen oder post-translationale Modifikationen der Proteine differentiell in einen Subtyp oder zwischen den beiden Subtypen von Makrophagen unter bestimmten Umweltreize oder modifiziert werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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