Introduction
המקרופאגים הם תאים הטרוגנית ופלסטיק כי הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים פונקציונליים שונים. בחי, תאים אלה מגיבים למגוון רחב של signalssuch הסביבתי מיקרו מוצרים של חיידקים, ציטוקינים, וכו '. 1. במבחנה, פנוטיפ פרו-הדלקתי (M1) של מקרופאג יכול להיגרם על ידי lipopolysaccharide (LPS) ואת הפנוטיפ אנטי דלקתי (M2) על ידי כמה ציטוקינים כגון אינטרלוקין 4 (IL-4). יתר על כן, מקרופאגים יכולים לעבור מM1 הופעל לפנוטיפ M2, ולחלופין, על אותות ספציפיים 2.
בהתאם לפנוטיפ, יהיו לי מקרופאגים פונקציות שונות. מקרופאגים M1 הם תאים המייצרים ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון α גורם נמק גידול (TNF-α), להרוג מיקרואורגניזמים או תאי גידול 3. בניגוד לכך, מקרופאגים M2 למנוע תגובה הדלקתית אלה כמו בריפוי פצעים וסיסטיק על ידי ייצור אנטי-inflammatorגורמי y כגון TGF-β 3,4.
תאי הדם היקפיים mononuclear אדם מתורמים בריאים בודדו על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll כפי שתואר לעיל 5 תוך שימוש בטכניקה שהותאמה מBoyum 6. המקרופאגים בתרבות יכולים להיות מובחנים לפנוטיפ M1 או M2 לאחר 6 ימים של התרבות העיקרית 7.
ניתוח של ביטוי חלבון או חלבון שינויים בין שני תת הסוגים של מקרופאגים תחת גירויים מבוקרים שונים, כגון פתוגניות מארח או רעלנים של חיידקים, יהיה מועיל כדי לפענח את הפונקציונליות של פרו ומקרופאגים אנטי דלקתיים.
פרוטאומיקה הן כלים ייחודיים לניטור ישיר של חלבונים כי הם במיוחד למעלה או למטה מוסדרים במקרופאגים התרבותיים האנושיים תחת גירויים שונים. צבעי ניאון פתרו חלק מהמגבלות של ג'ל אלקטרופורזה 2D, כמו רגישות נמוכה וניתוח תמונה 8 < / Sup>. הצבעים מגיבים עם שאריות ציסטאין הגדילו את רגישות זיהוי בהשוואה לאלו מגיבים עם שאריות ליזין 9. במחקר קודם, שהראינו את התועלת של תיוג רוויה DIGE לניתוח דגימות נדירות 10 בהשוואה לאלקטרופורזה מוכתמת הכסף הקלאסי 2D 11. טכנולוגיה זו שימושית במהירות ניתוח שינויי חלבון בין שני תת הסוגים של מקרופאגים או בין מקרופאגים שלא טופלו ומטופל מאותו תת-הסוג.
היתרונות של טכניקת proteomic זה שיש גישה למידע של גודל חלבון ולאחר translational שינויים על ידי ניתוח ג'ל 2D 12. יש לקחת בחשבון שזה לא טכניקת תפוקה גבוהה, המגביל את מספר הדגימות שניתן לנתח. הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהים המבוססים על ספקטרומטר מסה כפי שנסקר לאחרונה 13 יכולים לשפר את זה.
_content "> כאן אנו מציגים כיצד לבצע ניתוח 2D DIGE ממיצוי החלבון של מקרופאגים התרבותיים באמצעות התהליכים של אלקטרופורזה, isoelectrofocusing, וSDS-PAGE וכן מידע על השימושיות של תוכנת 2D נאותה.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות של ועדת האתיקה המחקרית שלנו מוסדות האנושית. מעיל באפי מתורמים אנושיים בריאים התקבל ממרכז עירוי הדם האזורי (Lille, צרפת). דגימות שהתקבלו ממעיילי האפים מוכרזות כאוסף INSERM (N ° DC2010-1209).
1. חומר ותרבות מדיה הכנה
- לדלל 10x פוספט הצפת מלוח (PBS) במים מזוקקים סטריליים כדי להשיג PBS 1x.
- הפוך 1640 בינוני RPMI בתוספת גנטמיצין (40 מיקרוגרם / מיליליטר) ו- L-גלוטמין (2 מ"מ), עם ובלי 10% בסרום אנושי ויקווה.
2. תרבויות עיקריות של המקרופאגים הנגזרים מונוציטים (MDM)
- לדלל buffycoat (25 מיליליטר) עם 1x PBS. לטעון בזהירות על Ficoll / צינור leucosep ו צנטריפוגות ב XG 1,600 במשך 20 דקות, בטמפרטורת חדר.
- לאסוף מונוציטים בממשק שלתוך צינור חדש. 3x לשטוף עם 10 מיליליטר 1x PBS המכיל ethylenediaminetetra 0.1%חומצה אצטית (EDTA) על ידי centrifugations רצוף XG ב 1000, 370 XG ו -160 XG במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן פעם ב1x PBS לבד ב160 XG במשך 10 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר בינוני RPMI-1640 ללא סרום וזרע התאים ב -35 מנות מ"מ בצפיפות של 1 x 10 6 תאים לכל תבשיל.
- לאחר שקיעה למשך 90 דקות בחממה, לבטל את supernatant המכיל את התאים שאינם חסיד. לשטוף את התאים חסיד, הכולל מונוציטים, 3x עם 1 מיליליטר PBS; לאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של מדיום חדש המכיל 10% (v / v) בסרום אנושי לתאי הסרום ללא עבר.
- לאחר 6 ימים של תרבות, כדי להניב מקרופאגים חלופיים הבדיל (M2), להוסיף IL-4 אנושיים רקומביננטי (15 ng / ml) ולשמור במשך 6 ימים. ואז, טיפול במקרופאגים הבדיל עם lipopolysaccharide (100 ng / ml) ביום 12 במשך 4 שעות כדי להשיג מקרופאגים M1.
3. הפקה של החלבונים מקרופאג M1 ו- M2 ל2D אלקטרופורזה
- macroph לשטוףגילאי שלוש פעמים עם 25 מ"מ טריס, pH 7.4, וגרוטאות במאגר המכיל 30 מ"מ טריס pH 8, 4% - 3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (בחורים), 2 M thiourea ו -7 M אוריאה.
- תאי lyse בעזרת מערבל מתאים לצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge למשך 5 דקות בקרח ולאחסן ב -20 ° C.
- קביעת ריכוז חלבון באמצעות מגיב ברדפורד מסחרי. אחסן 100 aliquots μl של החלבונים ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
4. Isoelectrofocusing
הערה: בצע את כל הליכי התיוג בחושך.
- להפחית 5 מיקרוגרם של כל דגימה (מקרופאגים M1 ו- M2) מותאמת ל9 μl עם חיץ תמוגה עם 2 מ"מ טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- להוסיף cyanine 3 (Cy3) לתמצית M1 ותמצית צבע sulfhydryl-reactive M2 בריכוז של 0.8 חלבון / מיקרוגרם ננומטר. להוסיף cyanine 5 (Cy5) לM1 ו- M2 תמציות בריכוז של 0.8 NM / חלבון מיקרוגרם דגירהבמשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לעצור את התגובה בתוספת נפח שווה של חיץ מדגם המכיל 7 M אוריאה, 2 M thiourea, 4 בחורים%, pharmalytes 130 dithiothreitol מ"מ (DTT) ו- 2%.
- מיקס Cy3 שכותרתו דגימות M1 עם דגימות M2 שכותרתו Cy5 ביד אחת וCy3 שכותרתו דגימות M2 עם דגימות M1 שכותרתו Cy5 ביד אחרת.
- רצועת רעננות שיפוע pH ללא יכולת לזוז (IPG) (מ"מ 240, pH 3-10 שיפוע ליניארית) עם 450 μl דגימות מעורבות שכותרתו במאגר המכיל 7 M אוריאה, 2 M בחורים thiourea ו -4% על isoelectric התמקדות מערכת תא (IEF) למשך 24 שעות מבלי להחיל נוכחי.
- בצע התמקדות ב 300 וולט (V) במשך 3 שעות, ולאחר מכן בשיפוע 1,000 V עבור 6 שעות, בשיפוע 8,000 V עבור 3 שעות ובסופו ב 8000 V למשך 3 שעות.
5. ממד שני
הערה: בצע את כל נהלי אלקטרופורזה בחושך.
- דגירה רצועות IPG במאגר איזון לכלולing 0.1 מ"מ טריס HCl (pH 8), 6 M אוריאה, 2% (w / v) סולפט dodecyl נתרן (SDS) ו -30% (V / V) גליצרול עבור 10 דקות.
- העבר את רצועות IPG equilibrated לממד השני (ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide (עמוד)) על גבי ג'לי עמוד 12.5% וחותם עם ההתכה נמוכה agarose.
- לבצע אלקטרופורזה על 20 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת Ettan-Daltsix במתח קבוע של 70 V לילה ואחריו 300 V עד החזית הכחולה bromophenol מגיעה לתחתית הג'ל.
ניתוח רכישה וbioinformatic 6. תמונה
- ג'לי סריקה יצוק בין שני לוחות הזכוכית נמוכה הקרינה עם סורק DIGE Imager באורכי גל עירור / פליטה של 532/580 ננומטר עבור Cy3 ו633/670 ננומטר עבור Cy5 להניב לתמונות בגודל פיקסל של 100 מיקרומטר.
- ביצוע ניתוח תמונה עם תוכנה מסחרית, כמפורט 12 בעבר.
- לחשב ולנרמל את כרכי מקום בכל תמונה. הקצאה מנורמלת נקודת נפח כאבזרortion של הערך הכולל של כל נקודה שהתגלתה בג'ל.
- נתח את ההבדלים בכמויות חלבון מקום לכל סוג של מקרופאגים על ידי השוואה בין ערך נקודת נפח המנורמל בין שתי הקבוצות (M1 ו- M2). קח לדוגמה את ההבדל בין כרכי המקום להיות משמעותי אם השינוי הוא 1.5 פי (p <0.05, ניתוח ANOVA חד-כיווני).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבצע ניתוח proteomic ההפרש מתאים, העיבוד של דגימות כדי להיות מנותחות צריך להיות מאומת.
בדוגמא המוצגת, איכות תרבית תאים של מקרופאגים נדרש להיבטים מורפולוגיים ומולקולריים כפי שפורסמה בעבר 5. הבידול של מונוציטים למקרופאגים ואת ההומוגניות של התרבות בעקבות שלב מיקרוסקופ. איור 1 הראה דוגמא של תרבויות העיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2. כפי שניתן לראות, אנו מאמתים את ההומוגניות של M1 (איור 1 א, ב) ו- M2 (איור 1 ג ', ד') תת-סוגים של מקרופאגים ביום 12 של תרבות על ידי שלב מיקרוסקופ בנמוך (איור 1 א, ג) וגבוה (איור 1 ב ', ד' הגדלה). ברור, אנחנו נצפו מורפולוגיה ייחודית של מקרופאגים M1 ו- M2 לאחר 12 ימים של תרבות העיקרית. כפי שפורסם בעבר, אנו מאומתים על ידי RT-PCR הנוכחות של mRNA קידוד לTNF וIL1ב 'במקרופאגים M1 ולMRC1 וCCL18 בM2 מקרופאגים 14 (לא מוצג).
תרבויות רק שילוב קריטריונים אלה שמשו לניתוח proteomic.
אנחנו נקבע את דפוסי חלבון 2D של שני תת סוגים של מקרופאגים, M1 (פרו-דלקתי) ו- M2 (אנטי דלקתי). לשם כך, אנו חילוץ חלבונים ממקרופאגים התרבותיים M1 ו- M2 כמפורט בפרוטוקול ומקרופאגים M1 ו- M2 תויגו גם עם צבעים רווי Cy3 או Cy5 לנתח את החלבונים על ידי אלקטרופורזה 2D DIGE. תרשים 2 מציג ג'לי 2D נציג של M1 ( איור 2 א, ב) ו- M2 (איור 2 ג, ד) מקרופאגים באיכות מספקת לניתוח bioinformatic. אותו הדפוס של חלבונים נצפה גם עבור M1 או M2 באופן עצמאי של צבעי cyanine משמשים Cy3 (איור 2 א, ג) או Cy5 (איור 2 ב, ד). בדוגמא זו, עמ 'יניארי גדולשיפוע H שימש (3-10) ולמפרט חלבונים עם pl חומצי או הבסיסי, ניתן להשתמש בשיפוע pH צר.
מעניין לציין, ניתוח bioinformatic של ג'ל 2D גילה 20 אזורים המכילים נקודות שניתן לנתח ולהשוות באמצעות תוכנת 2D. איור 3 היא דוגמא לג'ל 2D numerised בי 20 האזורים של כתמים נמצאים. תוכנת 2D היא מסוגלת לכמת ולהשוות את עוצמת הקול של כל נקודה בין מספר ג'לי 2D ממדגמים שונים. התוכנה יכולה לכמת את העלייה או ירידה של מקום נפח וזה יכול להיות דמיין בצבע כפי שמצוין באיור 3. כתמים נחשבים לבעלי ביטוי ההפרש משמעותי אם מתקפל שינוי כרכי נקודה מנורמלים כמפורט בסעיף 6 של סעיף פרוטוקול היה גדול מ -1.5 עם p-value <0.05. נוכחותו או היעדריו של מקום חלבון או פוליפפטיד בין שתי הקבוצות של מקרופאגים יכולה להיות מזוהה על ידי התוכנה.
איור 1: תצלומים של מיקרוסקופיה שלב בניגוד לתרבות העיקרית של מקרופאגים דוגמא למורפולוגיה של M1. (A, B) ו- M2 מקרופאגים (C, D). מקרופאגים M1 התקבלו על ידי טיפול lipopolysaccharide במשך 4 שעות ביום 12. מקרופאגים M2 התקבלו על ידי IL-4 טיפול החל מיום 6 במיקרוסקופ יום 12. שלב בניגוד עד מאפשר זיהוי ברור של שני תת-הסוגים של מקרופאגים. תמונות בהגדלה נמוכה (10X) (A, C) וגבוהה (40X) (B, D) בוצעו ביום 12 של התרבות. סרגל קנה מידה:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
יפ-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2:. ג'ל נציג 2D DIGE של מקרופאגים התרבותיים M1 ו- M2 חלבונים (מיקרוגרם 5) תויגו גם עם Cy3 (A, B) או Cy5 (C, D) מM1 (A, B) ו- M2 (C, D) מקרופאגים תרבית למשך 12 ימים. אותו הדפוס של ג'ל 2D למקרופאגים M1 או M2 הושג באופן בלתי תלוי cyanine שכותרתו משמש. העמדות של משקל מולקולרי סטנדרטים (מר) מצוינות בצד השמאל, ופי מצויינים בתחתית הג'ל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"/>
איור 3:. ניתוח bioinformatic של ג'ל 2D DIGE נציג מחלבונים מקרופאג עם תוכנת Progenesis SameSpots עשרים אזורים התגלו לבצע ניתוח ההפרש בין מקרופאגים M1 ו- M2. החלק התחתון של הדמות מציין את קוד הצבע למתקפל השינוי של כתמי נפח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט שיטות כדי לנתח את ההשפעה של גירויים שונים משני תת הסוגים של מקרופאגים, M1 (פרו-דלקתי) ו- M2 (אנטי דלקתי). תרבויות עיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2 התקבלו מההתמיינות של מונוציטים כפי שפורסמו בעבר 7.
ההליך של ג'ל אלקטרופורזה 2D DIGE דורש חומרים מיוחדים וציוד, כגון תא IEF לצלחות isoelectrofocusing, נמוכה הקרינה לSDS-PAGE כדי לסרוק פעמיים את הג'ל על עירור / אורך גל פליטה לCy3 ו Cy5, סורק לקרינה ותוכנת 2D. שיטה זו דורשת קצת תרגול ומיומנות ידנית.
ישנם מספר צעדים קריטיים לג'ל אלקטרופורזה 2D מוצלח: 1) החילוץ של חלבונים הוא קריטי בסביבה ללא כל מזהמים כגון אלבומין או קרטין, ו- 2) ביצוע התיוג ואלקטרופורזה בחושך. הימנע משימוש בDTT להפחתת חלבון במאגר תמוגה כטכניקה זו דורש שימוש בTCEP לצמצום קשרים פפטידיים גופרתי בחלבונים לפני התיוג עם צבעים תגובתי cyanine.
טכניקת 2D DIGE רגישה זה מאפשרת ההערכה של ביטוי ההפרש של כתמי חלבון על ידי מקרופאגים תחת תנאים סביבתיים שונים, בנוכחות או עדר של חלבונים בהתאם לתת הסוג.
אחת המגבלות של טכניקת 2D DIGE זה הוא הצורך לתייג את החלבונים על שאריות ציסטאין, אשר נעדר ב -14% מהחלבון. המגבלה אחרת היא המספר הקטן יחסית של דגימות שניתן לנתח באותו הסוג בהשוואה לטכנולוגית תפוקה גבוהה כמו ספקטרומטר מסה כמותית, אם כי 2D DIGE הוא פחות יקר.
גירויי חיידקים, כגון LPS כמו גם ציטוקינים Th1, להפעיל מקרופאגים למצב דלקתי M1, בעוד ציטוקינים Th2, כגון IL-4, עמ 'olarize תאים לפנוטיפ M2 עם immunoregulatory, תיקון, ופונקציות אנטי דלקתיות 3. מקרופאגים התרבותיים phenotyping M1 ו- M2 עם או בלי פתוגניות מארח באמצעות גישות פרוטאומיקה יספק תמונה מפורטת יותר של התפקיד הפונקציונלי המורכב של תת אדם. אלקטרופורזה 2D DIGE עשויה להיות מועילה לזיהוי פוליפפטידים / חלבונים או שלאחר translational שינויים של חלבונים אלה שונה באופן דיפרנציאלי בתת-סוג אחד או בין שני תת הסוגים של מקרופאגים תחת גירויים או בסביבה מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
