Introduction
मैक्रोफेज विशिष्ट कार्यात्मक फेनोटाइप हासिल करने में सक्षम हैं कि विषम और प्लास्टिक कोशिकाओं रहे हैं. में विवो, इन कोशिकाओं माइक्रोबियल उत्पादों, साइटोकिन्स, आदि. 1 के रूप में सूक्ष्म पर्यावरण signalssuch की एक विशाल विविधता का जवाब. इन विट्रो, समर्थक भड़काऊ फेनोटाइप (एम 1) मैक्रोफेज की lipopolysaccharide (LPS) और इस तरह के इंटरल्यूकिन -4 (आईएल 4) के रूप में कुछ साइटोकिन्स से विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप (M2) के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इसके अलावा, मैक्रोफेज विशिष्ट संकेत 2 पर, इसके विपरीत M2 के phenotype के लिए एक सक्रिय एम 1 से स्विच, और कर सकते हैं.
फेनोटाइप पर निर्भर करता है, मैक्रोफेज अलग कार्य किया जाएगा. एम 1 मैक्रोफेज सूक्ष्मजीवों या ट्यूमर कोशिकाओं 3 को मारने के लिए, इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α) के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, उत्पादन कि कोशिकाओं रहे हैं. इसके विपरीत, M2 मैक्रोफेज विरोधी inflammator उत्पादन से घाव भरने और फाइब्रोसिस में तरह इन भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने केऐसे 3,4 TGF-β रूप Y कारकों.
पहले से Boyum 6 से अनुकूलित एक तकनीक का उपयोग कर 5 में वर्णित के रूप में स्वस्थ दाताओं से मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear Ficoll घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अलग थे. संस्कृति में मैक्रोफेज प्राथमिक संस्कृति 7 के 6 दिन बाद एम 1 या M2 फेनोटाइप में भेदभाव किया जा सकता.
प्रोटीन अभिव्यक्ति या ऐसे मेजबान pathogenicity या माइक्रोबियल विषाक्त पदार्थों के रूप में विभिन्न नियंत्रित उत्तेजनाओं, के तहत मैक्रोफेज की दो उपप्रकार के बीच प्रोटीन परिवर्तन का विश्लेषण, समर्थक और विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज की कार्यक्षमता को समझने के लिए मददगार होगा.
प्रोटिओमिक्स विशेष रूप से ऊपर या विभिन्न उत्तेजनाओं के तहत मानव सुसंस्कृत मैक्रोफेज में नीचे विनियमित हैं कि प्रोटीन की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए अद्वितीय उपकरण हैं. फ्लोरोसेंट रंजक इतनी कम संवेदनशीलता और छवि विश्लेषण के रूप में 8 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन की सीमाओं में से कुछ को हल है < / समर्थन>. सिस्टीन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया रंगों लाइसिन अवशेषों 9 के साथ प्रतिक्रिया उन लोगों की तुलना का पता लगाने संवेदनशीलता बढ़ गई है. पिछले एक अध्ययन में, हम शास्त्रीय चांदी से सना हुआ 2 डी वैद्युतकणसंचलन 11 की तुलना में दुर्लभ नमूने 10 के विश्लेषण के लिए DIGE संतृप्ति लेबलिंग की उपयोगिता का प्रदर्शन किया. इस प्रौद्योगिकी के तेजी से मैक्रोफेज की दो उपप्रकार के बीच या एक ही उप प्रकार से इलाज और इलाज मैक्रोफेज के बीच प्रोटीन संशोधनों का विश्लेषण करने में सहायक है.
इस प्रोटिओमिक तकनीक के फायदे 2 डी जेल 12 विश्लेषण करके प्रोटीन आकार और बाद translational संशोधनों की जानकारी के लिए उपयोग कर रहे हैं. यह विश्लेषण किया जा सकता है कि नमूनों की संख्या सीमित है, यह एक उच्च throughput तकनीक नहीं है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित उच्च throughput assays के विकास की समीक्षा की के रूप में हाल ही में 13 इस सुधार कर सकते हैं.
_content "> यहाँ हम वैद्युतकणसंचलन, isoelectrofocusing की प्रक्रियाओं के माध्यम से सुसंस्कृत मैक्रोफेज के प्रोटीन निष्कर्षण से 2 डी DIGE विश्लेषण करने के लिए कैसे मौजूद है, और पर्याप्त 2 डी सॉफ्टवेयर की उपयोगिता पर एसडीएस पृष्ठ के साथ ही जानकारी.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
प्रोटोकॉल हमारे संस्थानों मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशा निर्देशों के बाद. स्वस्थ मानव दाताओं से बफी कोट क्षेत्रीय रक्ताधान केंद्र (लिले, फ्रांस) से प्राप्त किया गया. बफी कोट से प्राप्त नमूनों एक Inserm संग्रह (एन ° DC2010-1209) के रूप में घोषित कर रहे हैं.
1. सामग्री और संस्कृति मीडिया की तैयारी
- 1x पीबीएस प्राप्त करने के लिए बाँझ आसुत जल में 10x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पतला.
- साथ और 10% जमा मानव सीरम बिना जेंटामाइसिन (40 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और एल glutamine (2 मिमी), के साथ पूरक 1640 RPMI मध्यम बनाओ.
Monocyte व्युत्पन्न मैक्रोफेज 2. प्राथमिक संस्कृतियों (एमडीएम)
- 1x पीबीएस के साथ buffycoat (25 एमएल) पतला. ध्यान से कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1600 XG पर एक Ficoll / leucosep ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर लोड.
- एक नया ट्यूब में इंटरफेस में monocytes लीजिए. 10 एमएल के साथ धो 3x पीबीएस 0.1% ethylenediaminetetra युक्त 1x1000 XG, 370 XG और 10 मिनट प्रत्येक के लिए 160 XG, और फिर एक बार 1x पीबीएस में अकेले 160 XG पर 10 मिनट के लिए कम से लगातार centrifugations द्वारा एसिटिक एसिड (EDTA).
- सीरम के बिना 5 एमएल RPMI-1640 मध्यम में सेल गोली Resuspend और पकवान प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं की एक घनत्व में 35 मिमी बर्तन में कोशिकाओं बीज.
- इनक्यूबेटर में 90 मिनट के लिए अवसादन के बाद, गैर-पक्षपाती कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ, monocytes के 3x मिलकर, पक्षपाती कोशिकाओं को धो लें; तो पहले से सीरम मुक्त कोशिकाओं को 10% से युक्त ताजा मध्यम (वी / वी) मानव सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
- संस्कृति के 6 दिन बाद, वैकल्पिक विभेदित मैक्रोफेज (M2) के उपज पुनः संयोजक मानव आईएल -4 (15 एनजी / एमएल) जोड़ने और 6 दिनों के लिए बनाए रखने के लिए. फिर, एम 1 मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए 4 घंटे के लिए 12 दिन में lipopolysaccharide (100 एनजी / एमएल) के साथ भेदभाव मैक्रोफेज का इलाज.
2 डी वैद्युतकणसंचलन के लिए एम 1 और M2 बृहतभक्षककोशिका प्रोटीन 3. निकालना
- धो macrophउम्र 25 मिमी Tris, 30 मिमी Tris पीएच 8, 4% 3 युक्त बफर में 7.4 पीएच, और स्क्रैप के साथ तीन बार - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 2 एम Thiourea और 7 एम यूरिया.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ और दुकान में 5 मिनट के लिए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए उपयुक्त एक मिक्सर का उपयोग Lyse कोशिकाओं.
- एक वाणिज्यिक ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण. उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन की 100 μl aliquots स्टोर.
4. Isoelectrofocusing
नोट: अंधेरे में सभी लेबलिंग प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2 मिमी Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP) के साथ lysis बफर के साथ 9 μl को समायोजित प्रत्येक नमूना (एम 1 और M2 मैक्रोफेज) की 5 माइक्रोग्राम प्रति कम करें.
- 0.8 एनएम / माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन की एकाग्रता में एम 1 निकालने और M2 sulfhydryl प्रतिक्रियाशील डाई निकालने के लिए cyanine 3 (Cy3) जोड़ें. एम 1 को cyanine 5 (Cy5) जोड़ें और M2 0.8 एनएम / माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन की एकाग्रता में अर्क और सेते37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए.
- 7 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 4% CHAPS, 130 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) और 2% pharmalytes युक्त नमूना बफर के एक बराबर मात्रा के अलावा के साथ प्रतिक्रिया बंद करो.
- मिक्स एक हाथ में Cy5 लेबल M2 के नमूनों के साथ एम 1 नमूने Cy3 लेबल और दूसरे हाथ में Cy5 लेबल एम 1 नमूनों के साथ M2 के नमूने Cy3 लेबल.
- एक Immobilized पीएच ढाल rehydrate (IPG) पट्टी (240 मिमी, पीएच 3-10 रैखिक ढाल) 7 एम यूरिया, एक समविद्युतविभव पर 2 एम Thiourea और 4% CHAPS ध्यान केंद्रित युक्त बफर में लेबल मिश्रित नमूने के 450 μl के साथ (IEF) सेल प्रणाली किसी भी मौजूदा लागू किए बिना 24 घंटे के लिए.
- 3 घंटा और 3 घंटे के लिए अंत में 8000 V के लिए 8,000 वी करने के लिए एक ढाल पर, 6 घंटे के लिए 1,000 वी करने के लिए एक ढाल में तो 3 घंटे के लिए 300 वोल्ट (वी) पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और.
5. दूसरा आयाम
नोट: अंधेरे में सभी वैद्युतकणसंचलन प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.
- संतुलन बफर में IPG स्ट्रिप्स होते सेते10 मिनट के लिए 0.1 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 8), 6 एम यूरिया, 2% सोडियम dodecyl सल्फेट (w / v) (एसडीएस) और 30% (v / v) ग्लिसरॉल आईएनजी.
- 12.5% पृष्ठ जैल पर दूसरा आयाम (एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज)) के लिए equilibrated IPG स्ट्रिप्स हस्तांतरण और agarose कम पिघलने के साथ सील.
- Bromophenol नीले सामने जेल के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक रातोंरात 300 वी द्वारा पीछा 70 वी की एक निरंतर वोल्टेज में एक Ettan-Daltsix प्रणाली का उपयोग कर 20 डिग्री सेल्सियस पर वैद्युतकणसंचलन बाहर ले.
6. छवि के अधिग्रहण और पहले से पंजीकृत विश्लेषण
- Cy5 100 माइक्रोन का एक पिक्सेल आकार के साथ छवियों उपज के लिए Cy3 के लिए 532/580 एनएम और 633/670 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में एक DIGE इमेजर स्कैनर के साथ दो कम प्रतिदीप्ति गिलास प्लेट के बीच डाली स्कैन जैल.
- पहले 12 विस्तृत रूप में वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ छवि विश्लेषण करते हैं.
- गणना और प्रत्येक छवि में हाजिर संस्करणों मानक के अनुसार. सहारा के रूप में एक सामान्यीकृत मौके मात्रा निरुपितहर जगह के कुल मूल्य का ortion जेल में पता चला.
- दो समूहों (एम 1 और M2) के बीच सामान्यीकृत मौके मात्रा मूल्य की तुलना द्वारा मैक्रोफेज के प्रत्येक प्रकार के प्रोटीन मौके संस्करणों में अंतर का विश्लेषण करें. परिवर्तन 1.5 गुना (पी <0.05, एक तरह से एनोवा विश्लेषण) अगर महत्वपूर्ण होने के लिए स्थान संस्करणों के बीच अंतर पर विचार करें.
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Representative Results
उचित अंतर प्रोटिओमिक विश्लेषण करने, विश्लेषण करने के लिए नमूने के प्रसंस्करण सत्यापित किया जाना चाहिए.
पहले 5 प्रकाशित के रूप में प्रस्तुत उदाहरण में, मैक्रोफेज की सेल संस्कृति गुणवत्ता रूपात्मक और आणविक पहलुओं के लिए आवश्यक है. मैक्रोफेज में monocytes के भेदभाव और संस्कृति की एकरूपता चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया गया था. 1 चित्रा एम 1 और M2 मैक्रोफेज की प्राथमिक संस्कृतियों का एक उदाहरण दिखाया. दिखाया गया है, हम एम 1 (चित्रा 1 ए, बी) और M2 (चित्रा 1C, डी) कम से कम चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति के दिन 12 पर मैक्रोफेज के उपप्रकार (चित्रा 1 ए, सी) और उच्च (चित्रा 1 बी, डी की एकरूपता सत्यापित ) बढ़ाई. जाहिर है, हम प्राथमिक संस्कृति के 12 दिनों के बाद मैक्रोफेज एम 1 और M2 के एक विशिष्ट आकृति विज्ञान मनाया. पहले प्रकाशित रूप में, हम आरटी-पीसीआर द्वारा टीएनएफ और IL1 के लिए कोडिंग mRNA की उपस्थिति सत्यापितM2 में MRC1 एम 1 मैक्रोफेज में और के लिए बी और CCL18 14 मैक्रोफेज () नहीं दिखाया.
उन मानदंडों के संयोजन केवल संस्कृतियों प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया.
हम मैक्रोफेज, एम 1 (समर्थक भड़काऊ) और M2 (विरोधी भड़काऊ) के दो उपप्रकार के 2 डी प्रोटीन पैटर्न निर्धारित की. प्रोटोकॉल में विस्तृत और एम 1 और M2 मैक्रोफेज या तो 2 डी DIGE वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए Cy3 या Cy5 संतृप्ति रंगों के साथ लेबल रहे थे के रूप में उस प्रयोजन के लिए, हम एम 1 और M2 सुसंस्कृत मैक्रोफेज से प्रोटीन निकाला. (2 एम 1 के प्रतिनिधि 2 डी जैल प्रस्तुत चित्रा चित्रा 2A, बी) और M2 (चित्रा -2 सी, डी) पहले से पंजीकृत विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की मैक्रोफेज. प्रोटीन का एक ही पैटर्न एम 1 या M2 स्वतंत्र रूप Cy3 इस्तेमाल किया cyanine रंगों के (2A चित्रा, सी) या Cy5 (चित्रा 2 बी, डी) के लिए या तो मनाया गया. इस उदाहरण में, एक बड़े रैखिक पीएच ढाल इस्तेमाल किया गया था (3-10) और एक अम्लीय या बुनियादी पी एल के साथ प्रोटीन का ब्यौरा के लिए, संकीर्ण पीएच ढाल इस्तेमाल किया जा सकता है.
दिलचस्प है, 2 डी जेल की पहले से पंजीकृत विश्लेषण का विश्लेषण किया और 2 डी सॉफ्टवेयर का उपयोग तुलना की जा सकती है कि स्पॉट युक्त 20 क्षेत्रों का पता चला. 3 स्थानों में से 20 क्षेत्रों में स्थित हैं numerised 2 डी जेल का एक उदाहरण है चित्रा. 2 डी सॉफ्टवेयर यों और विभिन्न नमूनों से कई 2D जैल के बीच प्रत्येक स्थान की मात्रा की तुलना में सक्षम है. सॉफ्टवेयर वृद्धि या स्थान की मात्रा की कमी यों कर सकते हैं और चित्रा 3 में संकेत के रूप में इस रंग से देखे जा सकते हैं. बिताने के स्थान महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति है माना जाता सामान्यीकृत स्थान संस्करणों के गुना-परिवर्तन प्रोटोकॉल खंड के पैरा 6 में संकेत के रूप में अगर था एक पी मूल्य <0.05 से 1.5 से अधिक. मैक्रोफेज के दो समूहों के बीच एक प्रोटीन या पॉलीपेप्टाइड स्थान की उपस्थिति या अनुपस्थिति सॉफ्टवेयर से पता लगाया जा सकता है.
चित्रा 1: मैक्रोफेज की प्राथमिक संस्कृति के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के फोटो एम 1 की आकृति विज्ञान का उदाहरण. (ए, बी) और M2 (सी, डी) मैक्रोफेज. एम 1 मैक्रोफेज दिन 12. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी जब तक दिन में 6 से शुरू आईएल -4 उपचार द्वारा प्राप्त किया गया दिन 12. M2 मैक्रोफेज में 4 घंटे के लिए lipopolysaccharide उपचार द्वारा प्राप्त किया गया मैक्रोफेज के दोनों उपप्रकार की स्पष्ट पहचान की अनुमति देता. कम (10X) (ए, सी) और उच्च (40x) (बी, डी) बढ़ाई फोटो संस्कृति के दिन 12 पर प्रदर्शन किया गया. स्केल बार:. 50 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 2:. एम 1 और M2 सुसंस्कृत मैक्रोफेज के प्रतिनिधि 2D DIGE जेल प्रोटीन (5 माइक्रोग्राम प्रति) के साथ लेबल रहे थे या तो Cy3 (ए, बी) एम 1 से या Cy5 (सी, डी) (ए, बी) और M2 (सी, डी) मैक्रोफेज 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत. एम 1 या M2 मैक्रोफेज के लिए 2 डी जेल की एक ही पैटर्न का इस्तेमाल किया लेबल cyanine की स्वतंत्र रूप से प्राप्त हुई थी. आणविक वजन के पदों (श्री) मानकों बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं, और पीआई जेल के तल पर संकेत दिया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 3:. Progenesis SameSpots सॉफ्टवेयर के साथ बृहतभक्षककोशिका प्रोटीन से एक प्रतिनिधि 2D DIGE जेल की पहले से पंजीकृत विश्लेषण बीस क्षेत्रों एम 1 और M2 मैक्रोफेज के बीच अंतर विश्लेषण करने के लिए पाया गया. आंकड़े के नीचे मात्रा स्पॉट के गुना-परिवर्तन के लिए रंग कोड इंगित करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मैक्रोफेज, एम 1 (समर्थक भड़काऊ) और M2 (विरोधी भड़काऊ) के दो उपप्रकार के विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का विवरण. पहले 7 प्रकाशित के रूप में एम 1 और M2 मैक्रोफेज की प्राथमिक संस्कृतियों monocytes के भेदभाव से प्राप्त किया गया.
2 डी DIGE जेल वैद्युतकणसंचलन की प्रक्रिया ऐसी Cy3 और Cy5, प्रतिदीप्ति के लिए एक स्कैनर के लिए उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में दो बार जेल स्कैन करने के क्रम में एसडीएस पृष्ठ के लिए isoelectrofocusing, कम प्रतिदीप्ति प्लेटों के लिए IEF सेल के रूप में विशेष सामग्री और उपकरणों की आवश्यकता है और 2 डी सॉफ्टवेयर. इस विधि को कुछ अभ्यास और मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है.
1) प्रोटीन की निकासी के इस तरह के एल्बुमिन या केरातिन के रूप में किसी भी contaminants के बिना एक वातावरण में महत्वपूर्ण है, और 2) अंधेरे में लेबलिंग और वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन: सफल 2D जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. बचेंतकनीक के रूप में lysis बफर में प्रोटीन कमी के लिए डीटीटी का उपयोग cyanine प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ लेबलिंग से पहले प्रोटीन में पेप्टाइड सल्फाइड बांड को कम करने के लिए TCEP के उपयोग की आवश्यकता है.
इस संवेदनशील 2 डी DIGE तकनीक उपस्थिति या उप-प्रकार पर निर्भर करता है प्रोटीन के अभाव में, विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में मैक्रोफेज द्वारा प्रोटीन स्पॉट के अंतर अभिव्यक्ति के आकलन की अनुमति देता है.
इस 2 डी DIGE तकनीक की सीमाओं में से एक प्रोटीन की 14% में अनुपस्थित है जो सिस्टीन अवशेषों, पर प्रोटीन लेबल करने की जरूरत है. 2 डी DIGE कम महंगा है, हालांकि अन्य सीमा, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की तरह उच्च throughput प्रौद्योगिकी की तुलना में एक ही प्रकार पर विश्लेषण किया जा सकता है कि नमूनों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या है.
ऐसे LPS के साथ-साथ Th1 साइटोकिन्स के रूप में माइक्रोबियल उत्तेजनाओं, एक एम 1 भड़काऊ राज्य में इस तरह के आईएल -4, पी के रूप में, जबकि Th2 साइटोकिन्स, मैक्रोफेज सक्रिय करेंimmunoregulatory, मरम्मत, और विरोधी भड़काऊ कार्यों 3 के साथ एक m2 phenotype के लिए कोशिकाओं olarize. साथ या प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण के माध्यम से मेजबान pathogenicity बिना phenotyping एम 1 और M2 सुसंस्कृत मैक्रोफेज व्यक्ति उपप्रकार की जटिल कार्यात्मक भूमिका के एक अधिक विस्तृत चित्र प्रदान करेगा. 2 डी DIGE वैद्युतकणसंचलन polypeptides / प्रोटीन या विभिन्न एक उप-प्रकार में या विशिष्ट उत्तेजनाओं या वातावरण के तहत मैक्रोफेज की दो उपप्रकार के बीच संशोधित इन प्रोटीनों के बाद translational संशोधनों की पहचान के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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