Introduction
I macrofagi sono cellule eterogenee e plastica che sono in grado di acquisire fenotipi funzionali distinti. In vivo, queste cellule rispondono ad una grande varietà di micro signalssuch ambientale come prodotti microbici, citochine, ecc. 1. In vitro, il fenotipo pro-infiammatorio (M1) di macrofagi può essere indotta da lipopolisaccaride (LPS) e il fenotipo antinfiammatorio (M2) da alcune citochine come l'interleuchina-4 (IL-4). Inoltre, i macrofagi possono passare da una M1 M2 fenotipo attivato, e viceversa, sui segnali specifici 2.
A seconda del fenotipo, macrofagi avranno diverse funzioni. Macrofagi M1 sono cellule che producono citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), per uccidere i microrganismi o cellule tumorali 3. Al contrario, i macrofagi M2 evitare che queste risposta infiammatoria come nella guarigione delle ferite e la fibrosi producendo anti-inflammatorfattori y, come TGF-β 3,4.
Cellule mononucleate del sangue periferico umani di donatori sani sono stati isolati da Ficoll centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 5 utilizzando una tecnica adattata da Boyum 6. I macrofagi in coltura possono essere differenziati in M1 o M2 fenotipo dopo 6 giorni di coltura primaria 7.
Analisi di espressione della proteina o modifiche proteina tra i due sottotipi di macrofagi sotto vari stimoli controllati, quali patogenicità host o tossine microbiche, sarà utile per decifrare la funzionalità del pro- e macrofagi antinfiammatori.
Proteomica sono strumenti unici per il monitoraggio diretto di proteine che sono specificamente up- o down-regolato nei macrofagi in coltura umani sotto vari stimoli. Coloranti fluorescenti hanno risolto alcune delle limitazioni di elettroforesi su gel 2D, come la bassa sensibilità e analisi d'immagine 8 < / Sup>. I coloranti reagiscono con residui di cisteina hanno aumentato la sensibilità di rilevamento rispetto a quelli reagire con residui di lisina 9. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato l'utilità di etichettatura saturazione DIGE per l'analisi di campioni scarse 10 rispetto al classico argento macchiato elettroforesi 2D 11. Questa tecnologia è utile per analizzare rapidamente modificazioni proteiche tra i due sottotipi di macrofagi o tra macrofagi non trattati e trattati dallo stesso sottotipo.
I vantaggi di questa tecnica proteomica stanno avendo accesso alle informazioni di formato proteine e modificazioni post-traduzionali analizzando il gel 2D 12. Si deve tenere conto che questa non è una tecnica elevata produttività, limitando il numero di campioni che possono essere analizzati. Lo sviluppo di saggi high throughput basato su spettrometria di massa come rivisto recentemente 13 può migliorare questa.
_content "> Qui vi presentiamo come eseguire l'analisi 2D DIGE dall'estrazione di proteine di macrofagi in coltura attraverso i processi di elettroforesi, isoelettrofocalizzazione, e SDS-PAGE e informazioni sull'utilità di un adeguato software 2D.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il protocollo segue le linee guida delle nostre istituzioni umana comitato etico di ricerca. Buffy-coat da sani donatori umani sono stati ottenuti dal Regional Blood Transfusion Center (Lille, Francia). I campioni ottenuti dai buffy coats sono dichiarati come una collezione Inserm (n ° DC2010-1209).
1. Materiale e Culture Media Preparazione
- Diluire 10x tampone fosfato salino (PBS) in acqua distillata sterile per ottenere 1x PBS.
- Effettuare terreno RPMI 1640 supplementato con gentamicina (40 mcg / ml) e L-glutammina (2 mM), con e senza il 10% di siero umano pool.
2. Le colture primarie di macrofagi derivate da monociti (MDM)
- Diluire buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Caricare con attenzione su un Ficoll / provetta leucosep e centrifugare a 1600 xg per 20 min a temperatura ambiente.
- Raccogliere monociti all'interfaccia in un nuovo tubo. Lavare 3x con 10 ml di PBS 1X contenente 0,1% etilendiamminotetraacido acetico (EDTA) per successive centrifugazioni a 1000 xg, 370 xg e 160 xg per 10 minuti ciascuno, e poi una volta in PBS 1x solo a 160 xg per 10 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno RPMI-1640 senza siero e seminare le cellule su 35 mm piatti ad una densità di 1 x 10 6 cellule per piastra.
- Dopo sedimentazione per 90 min in incubatrice, scartare il surnatante contenente le cellule non aderenti. Lavare le cellule aderenti, composto da monociti, 3x con 1 ml di PBS; quindi aggiungere 1 ml di mezzo fresco contenente 10% (v / v) di siero umano per le celle libere precedenza siero.
- Dopo 6 giorni di coltura, per produrre macrofagi differenziati alternativi (M2), aggiungere umana ricombinante IL-4 (15 ng / ml) e mantenere per 6 giorni. Quindi, il trattamento di macrofagi differenziati con lipopolisaccaride (100 ng / ml) al giorno 12 per 4 ore per ottenere macrofagi M1.
3. Estrazione di M1 e M2 macrofagi proteine per elettroforesi 2D
- Lavare macrophetà tre volte con 25 mM Tris, pH 7,4, e rottami in tampone contenente 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 2 M tiourea e 7 M urea.
- Lisare le cellule utilizzando un mixer adatto per provette da 1,5 ml microcentrifuga per 5 min in ghiaccio e conservare a -20 ° C.
- Determinare la concentrazione di proteine usando un reagente commerciale Bradford. Conservare aliquote di 100 microlitri di proteine a -20 ° C fino al momento dell'uso.
4. Isoelettrofocalizzazione
NOTA: Eseguire tutte le procedure di etichettatura nel buio.
- Ridurre 5 mg di ciascun campione (M1 e M2 macrofagi) regolato a 9 microlitri di tampone di lisi con 2 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) per 1 ora a 37 ° C.
- Aggiungere cianina 3 (Cy3) per estrarre M1 e M2 estratto sulfidrilici colorante reattivo ad una concentrazione di 0,8 nM proteina / mg. Aggiungere cianina 5 (Cy5) M1 e M2 estrae ad una concentrazione di 0,8 nM / mg proteine e incubareper 30 minuti a 37 ° C.
- Arrestare la reazione con l'aggiunta di un volume uguale di tampone campione contenente 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitolo (DTT) e 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-marcato campioni M1 con M2 campioni Cy5-etichettati in una mano e Cy3-marcato campioni M2 con campioni M1 Cy5-etichettati in un altro mano.
- Reidratare un gradiente di pH immobilizzato (IPG) striscia (240 mm pH 3-10 gradiente lineare) con 450 ml di campioni misti etichettati in tampone contenente 7 M urea, 2 M tiourea e il 4% CHAPS su un sistema di messa a fuoco isoelettrica delle cellule (IEF) per 24 ore senza applicare alcuna corrente.
- Eseguire focalizzazione a 300 volt (V) per 3 ore, e poi ad un gradiente di 1000 V per 6 ore, con una pendenza a 8000 V per 3 ore e infine a 8000 V per 3 ore.
5. Seconda Dimensione
NOTA: Eseguire tutte le procedure di elettroforesi nel buio.
- Incubare le strisce IPG in tampone per l'equilibrazione contengonoing 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 30% (v / v) di glicerolo per 10 min.
- Trasferire le strisce IPG equilibrate per la seconda dimensione (elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (PAGE)) sul 12,5% gel PAGE e sigillare con basso punto di fusione agarosio.
- Effettuare elettroforesi a 20 ° C utilizzando un sistema Ettan-Daltsix ad una tensione costante di 70 V durante la notte seguita da 300 V fino alla bromofenolo blu anteriore raggiunge il fondo del gel.
6. Acquisizione di immagini e analisi bioinformatica
- Gel scansione espressi tra le due lastre di vetro a bassa fluorescenza con uno scanner DIGE Imager a lunghezze d'onda di eccitazione / emissione di 532/580 nm per Cy3 e Cy5 633/670 nm per cedere immagini con una dimensione di pixel di 100 micron.
- Eseguire l'analisi delle immagini con software commerciale come precedentemente descritto 12.
- Calcolare e normalizzare i volumi pronti in ogni immagine. Assegnare un volume posto normalizzato come un oggetto di scenaortion del valore totale di ogni punto rilevato nel gel.
- Analizzare le differenze di volumi di campione proteiche per ciascun tipo di macrofagi confrontando il valore del volume posto normalizzato tra i due gruppi (M1 e M2). Si consideri la differenza tra i volumi pronti ad essere significativo se il cambiamento è 1,5 volte (p <0.05, unidirezionale analisi ANOVA).
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Representative Results
Per eseguire un'adeguata analisi proteomica differenziale, il trattamento dei campioni da analizzare vanno verificate.
Nell'esempio presentato, è richiesta la qualità di coltura cellulare di macrofagi per aspetti morfologici e molecolari come precedentemente pubblicato 5. La differenziazione dei monociti in macrofagi e l'omogeneità della cultura è stata seguita da fase microscopio. Figura 1 ha mostrato un esempio di colture primarie di M1 e M2 macrofagi. Come mostrato, abbiamo verificato l'omogeneità di M1 (Figura 1A, B) e M2 (Figura 1C, D) sottotipi di macrofagi a 12 giorni di coltura di fase microscopio a basso (Figura 1A, C) e alta (Figura 1B, D ) di ingrandimento. Chiaramente, abbiamo osservato una morfologia distinta di macrofagi M1 e M2 dopo 12 giorni di coltura primaria. Come precedentemente pubblicato, abbiamo verificato mediante RT-PCR la presenza di mRNA che codifica per il TNF e IL1B in macrofagi M1 e per MRC1 e CCL18 in macrofagi M2 14 (non mostrati).
Solo le culture, che conciliano tali criteri sono stati utilizzati per l'analisi proteomica.
Abbiamo determinato i profili proteici 2D dei due sottotipi di macrofagi M1 (pro-infiammatori) e M2 (anti-infiammatori). A tal fine, abbiamo estratto proteine da M1 e M2 macrofagi in coltura, come specificato nel protocollo e M1 e M2 macrofagi erano o etichettati con coloranti saturazione Cy3 o Cy5 per analizzare le proteine mediante elettroforesi 2D DIGE. La figura 2 presenta gel rappresentativi 2D di M1 ( Figura 2A, B) e M2 (Figura 2C, D) macrofagi di qualità sufficiente per l'analisi bioinformatica. Lo stesso modello di proteine è stata osservata per M1 o M2 indipendentemente coloranti cianinici utilizzati Cy3 (Figura 2A, C) o Cy5 (Figura 2B, D). In questo esempio, un grande p lineareH gradiente è stato usato (3-10) e per dettagliare proteine con un pl acido o basico, stretto gradiente di pH può essere utilizzato.
È interessante notare che l'analisi bioinformatica del gel 2D rivelato 20 aree contenenti macchie che possono essere analizzati e confrontati usando il software 2D. La figura 3 è un esempio di numerised gel 2D in cui si trovano le 20 aree di macchie. Il software 2D è in grado di quantificare e confrontare il volume di ogni punto tra diversi gel 2D da diversi campioni. Il software è in grado di quantificare l'aumento o la diminuzione del volume posto e questo può essere visualizzato in base al colore, come indicato nella figura 3. Spots sono considerati avere una espressione differenziale significativo se la piega-cambio a pronti dei volumi normalizzati come indicato al punto 6 della sezione del protocollo è stato maggiore di 1,5 con un valore di p <0.05. La presenza o l'assenza di una macchia proteina o polipeptide tra i due gruppi di macrofagi può essere rilevato dal software.
Figura 1: Le fotografie della microscopia a contrasto di fase di colture primarie di macrofagi Esempio di morfologia M1. (A, B) e M2 (C, D) macrofagi. Macrofagi M1 sono stati ottenuti mediante trattamento lipopolisaccaride per 4 ore al giorno 12. macrofagi M2 sono stati ottenuti da IL-4 trattamento a partire dal giorno 6 al giorno 12 fino microscopia a contrasto di fase permette una chiara identificazione di entrambi i sottotipi di macrofagi. Fotografie a bassa (10X) (A, C) e alta (40X) (B, D) ingrandimento sono stati effettuati al giorno 12 di cultura. Scala bar:. 50 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2:. Rappresentativa 2D DIGE gel di M1 e M2 macrofagi in coltura Proteine (5 ug) etichettati sia con Cy3 (A, B) o Cy5 (C, D) da M1 (A, B) e M2 (C, D) macrofagi in coltura per 12 giorni. Lo stesso modello di gel 2D per M1 o M2 macrofagi è stata ottenuta indipendentemente dalla cianina marcato usato. Le posizioni di peso molecolare standard (MR) sono indicate sulla sinistra, e il pI è indicato sul fondo del gel. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3:. L'analisi bioinformatica di un rappresentante 2D DIGE gel da proteine macrofagi con il software progenesi SameSpots Venti aree sono state individuate per eseguire l'analisi differenziale tra M1 e M2 macrofagi. La parte inferiore della figura indica il codice colore per la piega-cambio di macchie di volume. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto dettaglio un metodo per analizzare l'impatto di vari stimoli dei due sottotipi di macrofagi M1 (pro-infiammatori) e M2 (anti-infiammatori). Colture primarie di M1 e M2 macrofagi sono stati ottenuti dalla differenziazione dei monociti come precedentemente pubblicato 7.
La procedura di elettroforesi su gel 2D DIGE richiede materiali e delle attrezzature speciali, come le batterie IEF per piatti isoelettrofocalizzazione, a bassa fluorescenza per l'SDS-PAGE al fine di eseguire la scansione di due volte il gel a lunghezza d'onda di eccitazione / emissione per Cy3 e Cy5, uno scanner per la fluorescenza e software 2D. Questo metodo richiede una certa pratica e destrezza manuale.
Ci sono diversi passaggi critici per il successo elettroforesi su gel 2D: 1) l'estrazione delle proteine è fondamentale in un ambiente senza contaminanti come albumina o di cheratina, e 2) esegue l'etichettatura ed elettroforesi al buio. Evitare iluso di DTT per la riduzione delle proteine nel tampone di lisi come tecnica richiede l'uso di TCEP per ridurre legami peptidici solfuro di proteine prima di etichettatura con cianina coloranti reattivi.
Questo sensibile tecnica 2D DIGE permette di valutare l'espressione differenziale di spot proteici da macrofagi in varie condizioni ambientali, in presenza o assenza di proteine a seconda del sottotipo.
Uno dei limiti di questa tecnica 2D DIGE è la necessità di etichettare le proteine sul residuo di cisteina, che è assente nel 14% della proteina. L'altra limitazione è relativamente piccolo numero di campioni che possono essere analizzati allo stesso tipo rispetto alla tecnologia ad alta velocità come spettrometria di massa quantitativa, sebbene 2D DIGE è meno costosa.
Stimoli microbici, quali LPS e citochine Th1, attivano macrofagi in uno stato infiammatorio M1, mentre citochine Th2, quali IL-4, polarize cellule di un fenotipo M2 con immunoregolatorio, riparazione, e le funzioni di anti-infiammatori 3. Fenotipizzazione M1 e M2 macrofagi in coltura con o senza patogenicità host mediante approcci di proteomica forniranno un quadro più dettagliato del ruolo funzionale complesso dei singoli sottotipi. L'elettroforesi 2D DIGE può essere utile per l'identificazione di polipeptidi / proteine o modificazioni post-traduzionali di queste proteine differenzialmente modificate in un sottotipo o tra i due sottotipi di macrofagi sotto stimoli o ambiente specifico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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