Introduction
マクロファージは、異なる機能の表現型を獲得することができる異種の、プラスチック細胞である。 インビボでの、これらの細胞は、微生物産物、サイトカインなど 1とマイクロ環境signalssuch多種多様に応答する。 インビトロ 、炎症誘発性表現型（M1）マクロファージのリポ多糖（LPS）およびインターロイキン4（IL-4）などのいくつかのサイトカインによる抗炎症性表現型（M2）によって誘導することができる。また、マクロファージは特定の信号2時には逆にM2表現型に活性化したM1から切り替え、することができます。
表現型に依存して、マクロファージは、異なる機能を有することになる。 M1マクロファージは、微生物または腫瘍細胞3を殺すために、例えば、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である。対照的に、M2マクロファージは、抗inflammatorを生成することによって創傷治癒および線維症のように、これらの炎症性反応を防ぐそのようなTGF-β-3,4-としてyの要因。
以前Boyum 6から適合技術を使用して5に記載のように、健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞を、Ficoll密度勾配遠心分離によって単離した。培養中のマクロファージは、初代培養7の6日後、M1またはM2表現型に分化させることができる。
タンパク質発現またはそのような宿主または病原微生物毒素などの様々な制御された刺激の下でマクロファージ2つのサブタイプ間のタンパク質の変化の分析は、プロ - および抗炎症性マクロファージの機能を解読するために役立つであろう。
プロテオミクスは、具体的に上方または様々な刺激の下でヒト培養マクロファージにおけるダウンレギュレートされたタンパク質の直接監視のためのユニークなツールです。蛍光色素は、低感度画像解析8 <ように、2Dゲル電気泳動の制限のいくつかを解決した / SUP>。システイン残基と反応染料は、リジン残基9との反応に比べ、検出感度が増加している。以前の研究では、古典的な銀染色した2D電気泳動11に比べて少ない試料10の分析のためのDIGE飽和標識化の有用性を実証した。この技術は、急速にマクロファージの2サブタイプ間または同じサブタイプからの未処理および処理マクロファージ間のタンパク質修飾を分析するのに役立ちます。
このプロテオミクス手法の利点は、2Dゲル12を分析することによって、タンパク質のサイズおよび翻訳後修飾の情報へのアクセスを行っている。これは分析することができるサンプルの数を制限し、高スループット技術ではないことを考慮すべきである。最近13日のように、質量分析に基づくハイスループットアッセイの開発は、これを改善することができる。
_contentは ">ここでは、等電点電気泳動、電気泳動の過程を経て培養されたマクロファージのタンパク質抽出から2D DIGE解析を実行する方法を提示し、SDS-PAGE、ならびに適切な2Dソフトウェアの有用性に関する情報。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
プロトコルは、私たちの機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。健康なヒトのドナーからのバフィーコートは、地域輸血センター（リール、フランス）から入手した。軟膜から得られた試料は、INSERMコレクション（N°DC2010-1209）として宣言されています。
1.材料と文化メディアの準備
- 1×PBSを取得するために滅菌蒸留水に10×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。
- とし、10％のプールしたヒト血清を含まないゲンタマイシン（40μg/ ml）を、およびL-グルタミン（2mM）を補充したRPMI 1640培地を加える。
単球由来マクロファージの2.初代培養（MDM）
- 1×PBSで軟膜（25ml）で希釈する。慎重に、室温で、20分間1600×gでフィコール/ leucosepチューブと遠心分離機にロードします。
- 新しいチューブに界面での単球を収集します。 10mlで3回洗浄をPBS、0.1％のエチレンジアミンを含有する1X入れ、1,000×g、370×gで10分間ごとに、160×gで、かつ一旦1×PBS中で、単独で160×gで10分間での連続遠心分離によって酢酸（EDTA）。
- 血清を含まない5ミリリットルRPMI-1640培地中で細胞ペレットを再懸濁し、皿あたり1×10 6細胞の密度で35mm皿中の細胞を播種する。
- インキュベーター内で90分間沈降した後、非接着細胞を含む上清を捨てる。 、単球からなる、1mlのPBSで3回接着細胞を洗浄。その後、以前に無血清の細胞の10％を含む新鮮培地1ml（v / v）のヒト血清を加える。
- 培養6日後に、代替的な分化したマクロファージ（M2）を得た組換えヒトIL-4（15 ngの/ ml）を追加し、6日間維持する。その後、M1マクロファージを得るために4時間12日目（100 ng / ml）を、リポ多糖で分化したマクロファージを治療する。
2D電気泳動用のM1およびM2マクロファージタンパク質の3.抽出
- ウォッシュmacroph年齢25 mMトリス、30 mMトリスpHが8,4％3を含む緩衝液中でpH7.4で、スクラップで三回 - [（3-コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ] -1-プロパンスルホネート（CHAPS）、2 Mチオ尿素および7 M尿素。
- -20℃で氷とストア内で5分間1.5ミリリットルマイクロチューブに適しミキサーを使用して細胞を溶解する。
- 商業Bradford試薬を用いてタンパク質濃度を決定する。使用するまで-20℃でタンパク質の100μlのアリコートに保管してください。
4.等電点電気泳動
注：暗闇の中で、すべてのラベリングの手順を実行します。
- 37℃で1時間、2 mMのトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）を溶解緩衝液で9μlに調整した各サンプル（M1およびM2マクロファージ）を5μgを減らす。
- 0.8 nMの/μgタンパク質の濃度M1抽出物及びM2のスルフヒドリル反応性染料抽出物、シアニン3（Cy3標識）を加える。 M1にシアニン5（Cy5の）を追加し、M2は0.8 NM /μgタンパク質の濃度で抽出し、インキュベート37℃で30分間インキュベートした。
- 7 M尿素を含む試料緩衝液の等容量を添加して反応を停止し、2 Mチオ尿素、4％CHAPS、130mMのジチオスレイトール（DTT）および2％pharmalytes。
- ミックス片手でCy5標識M2サンプルとM1サンプルをCy3標識は標識し、別の手でCy5標識M1サンプルとM2サンプルをCy3標識は標識。
- 7 M尿素を含むバッファー中の標識混合試料450μlの、等電点電気泳動（IEF）電池システム上の2 Mチオ尿素、4％CHAPSで固定化pH勾配（IPG）ストリップ（240ミリメートル、pHが3-10直線勾配）を再水和任意の電流を印加せずに24時間。
- 3時間と3時間最終的に8,000 V 8,000 Vまでの勾配で、6時間1,000 Vまでの勾配で、その後3時間300ボルト（V）でフォーカシングを行う、と。
5.第二次元
注：暗闇の中ですべての電気泳動手順を実行します。
- 平衡化緩衝液でIPGストリップを含んでインキュベート0.1のTris-HCl（pHは8）る、6 M尿素、2％（w / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、および10分間、30％（v / v）グリセロール。
- 平衡化したIPGは12.5％PAGEゲル上に二次元（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE））のためにストリップに移し、低融点アガロースでシールする。
- ブロモフェノールブルーフロントがゲルの底に到達するまで、一晩300 Vに続く70 Vの定電圧を、Ettan-Daltsixシステムを使用して20℃で電気泳動を行う。
6.画像取得およびバイオインフォマティクス解析
- スキャンゲルは、100ミクロンの画素サイズを有する画像を生成するためにCy3およびCy5 580分の532 nmのための670分の633の励起/発光波長でDIGEイメージャスキャナつの低蛍光ガラスプレートの間にキャスト。
- 以前に詳細な12などの商用ソフトウェアと画像解析を実行します。
- 各画像にスポットボリュームを計算し、正規化する。小道具として正規化されたスポット·ボリュームを割り当てるゲルで検出された各スポットの合計値のortion。
- 二つのグループ（M1およびM2）の間の正規化されたスポットのボリューム値を比較することにより、マクロファージの各タイプのタンパク質スポット量の違いを分析する。変化は1.5倍に（p <0.05、一方向ANOVA分析）である場合に有意であると、スポットボリュームの差を考慮する。
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Representative Results
適切な差動プロテオーム解析を実行するために、分析される試料の処理は、検証されるべきである。
示した例では、マクロファージの細胞培養物の品質は、以前に公開された5として形態学的および分子の側面に必要とされる。マクロファージ培養物の均質性への単球の分化は、位相顕微鏡検査を行った。 図1は、M1とM2マクロファージの一次培養物の一例を示した。図示のように、我々は、低（ 図1A、C）および高（ 図1B、Dでの位相顕微鏡により培養の12日目にマクロファージのM1（ 図1A、B）及びM2（ 図1C、D）サブタイプの均質性を検証）拡大。明らかに、我々は、初代培養の12日後に、マクロファージM1およびM2の異なる形態を観察した。以前に公開されたように、我々は、RT-PCRにより、TNFおよびIL1をコードするmRNAの存在を検証するM2マクロファージにおけるM1マクロファージにおけるとMRC1とCCL18のため、B 14（図示せず）。
これらの基準を組み合わせた唯一の培養は、プロテオーム解析のために使用された。
我々は、マクロファージ、M1（炎症誘発性）およびM2（抗炎症性）の2つのサブタイプの2Dタンパク質パターンを決定した。プロトコールで詳述するように、その目的のために、我々は、M1とM2培養したマクロファージからタンパク質を抽出し、M1とM2マクロファージはいずれかの2D DIGE電気泳動によってタンパク質を分析するためにCy3またはCy5の飽和色素で標識した。 図2は、（M1の代表的な2Dゲルを提示する図2A、B）及びM2（ 図2C、D）生物情報分析のための十分な品質のマクロファージ。タンパク質の同一のパターンは独立にCy3（ 図2A、C）またはCy5（ 図2B、D）を用いたシアニン色素のM1またはM2のいずれかで観察された。この例では、大規模な線形のpH勾配を使用した（3-10）及び酸性又は塩基性PLを有するタンパク質を詳述するために、狭いpH勾配を使用することができる。
興味深いことに、2Dゲルのバイオインフォマティクス分析により、分析し、2Dソフトウェアを用いて比較することができるスポットを含む20の領域を明らかにした。 図3のスポット20の領域が位置するnumerised 2Dゲルの一例である。 2Dソフトウェアは、異なるサンプルから複数の2Dゲルの間の各スポットの体積を定量化し、比較することである。ソフトウェアは、スポットボリュームの増減を定量化することができ、 図3に示されるように、これは、色で視覚化することができる。スポットの正規化されたスポットボリュームの倍率変化した場合に有意な差次的発現を有すると考えられるプロトコルセクションのパラグラフ6に示される通りであったp値<0.05と1.5より大きい。マクロファージの2つの群の間のタンパク質またはポリペプチドスポットの有無をソフトウェアにより検出することができる。
図1：マクロファージの初代培養の位相差顕微鏡の写真 M1の形態の例。 （A、B）およびM2（C、D）マクロファージ。 M1マクロファージは、12日目に位相差顕微鏡まで、6日目から開始してIL-4処理によって得られた12日目M2マクロファージで4時間リポ多糖処理により得られたマクロファージの両方のサブタイプの明確な同定を可能にする。低い（10×）（A、C）および高（40X）（B、D）倍率での写真は、培養の12日目に行った。スケールバー：50μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2：M1およびM2培養マクロファージの代表的な2D DIGEゲルタンパク質（5μgの）をM1（A、B）およびM2（C、D）からのCy3（A、B）またはCy5（C、D）のいずれかで標識した。マクロファージは、12日間培養した。 M1またはM2マクロファージ2Dゲルの同じパターンが使用される標識されたシアニンは独立して得た。分子量（MR）規格の位置が左側に示され、PIはゲルの底部に表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図3：Progenesis SameSpotsソフトウェアとマクロファージのタンパク質由来の代表的な2D DIGEゲルのバイオインフォマティクス分析十領域はM1とM2マクロファージとの間の差分解析を行うために検出された。図の下部は、ボリュームスポットの倍率変化のためのカラーコードを示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本明細書中に記載されるプロトコルは、マクロファージ、M1（炎症誘発性）およびM2（抗炎症性）の2つのサブタイプの種々の刺激の影響を分析するための方法を詳述する。以前に公開され7 M1及びM2マクロファージの初代培養物は、単球の分化から得た。
2D DIGEゲル電気泳動の手順は、Cy3およびCy5の励起/発光波長で2回ゲルを走査するために、SDS-PAGEのために、低蛍光プレート等電点電気泳動のためのIEFセル、蛍光スキャナーなどの特殊な材料や設備を必要とおよび2Dソフトウェア。この方法は、いくつかの練習や手先の器用さを必要とします。
1）タンパク質の抽出は、例えば、アルブミンやケラチンなどのあらゆる汚染のない環境において重要であり、2）暗所においてラベリングと電気泳動を実施：成功した2Dゲル電気泳動のためのいくつかの重要なステップがあります。避ける技術として、溶解緩衝液中のタンパク質の減少のためにDTTの使用は、反応性シアニン色素で標識する前に、タンパク質中のペプチドのスルフィド結合を低減するためのTCEPを使用する必要がある。
この敏感な2D DIGE技術は、サブタイプに依存して、タンパク質の存在下または非存在下で、様々な環境条件下でのマクロファージによるタンパク質スポットの示差的発現の評価を可能にする。
この2D DIGE技術の限界の一つは、タンパク質の14％に存在しないシステイン残基上のタンパク質を標識する必要があることである。他の制限は、2D DIGEは安価であるが、定量的な質量分析のようなハイスループット技術と比較して、同じタイプで分析することができる比較的少数のサンプルである。
そのようなIL-4のpとしてしばらくTh2サイトカイン、微生物LPSなどの刺激、ならびにTh1サイトカインは、炎症状態M1にマクロファージを活性化する免疫調節、修理、および抗炎症機能3 M2表現型に細胞をolarize。またはプロテオミクスアプローチを介して、ホスト病原性なし表現型M1とM2培養したマクロファージは、個々のサブタイプの複雑な機能的役割のより詳細な図を提供する。 2D DIGE電気泳動は、ポリペプチド/タンパク質または差次1サブタイプまたは特定の刺激または環境下でマクロファージの2つのサブタイプ間で変更されたこれらのタンパク質の翻訳後修飾の同定に有用であろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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