Introduction
대 식세포는 별개의 기능 표현형을 획득 할 수있는 이기종 및 플라스틱 세포이다. 생체 내,이 세포가 미생물 제품, 사이토 카인 등. 1과 마이크로 환경 signalssuch의 큰 다양성에 응답합니다. 시험관, 염증성 표현형 (M1) 대 식세포의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 인터루킨 -4 (IL-4)와 같은 일부 사이토킨에 의해 항 염증 표현형 (M2)에 의해 유도 될 수있다. 또한, 대 식세포는 특정 신호 2에 따라, 반대로 M2 표현형에 활성화 된 M1에서 전환 할 수 있습니다.
표현형에 따라, 대 식세포는 다른 기능을해야합니다. M1 마크로파지는 미생물 또는 종양 세포 (3)를 죽이고, 종양 괴사 인자 α (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인을 생산하는 세포이다. 반면, M2 식세포 안티 inflammator를 생성함으로써 상처 치유 및 섬유증과 같은 이러한 염증 반응을 방지3,4-을 TGF-β가 같은 Y 요인.
이전 Boyum 6에서 적응 기술을 사용하여 5 바와 같이 건강한 기증자로부터 인간의 말초 혈 단핵 세포를 피콜 밀도 구배 원심 분리에 의해 분리 하였다. 문화의 대 식세포는 차 문화 (7) 6 일 이후 M1 또는 M2 표현형로 분화 할 수있다.
단백질 발현 또는 숙주 병원성 미생물 또는 독소와 같은 다양한 제어되는 자극 하에서 식세포 두 아형 사이 단백질 변화 분석, 프로 및 소염 식세포의 기능을 해독하는데 도움이 될 것이다.
단백질 체학은 특히 업 또는 다양한 자극에 따라 인간 배양 된 대 식세포에서 아래로 조절되어 단백질의 직접 모니터링을위한 독특한 도구입니다. 형광 염료는 낮은 감도 및 이미지 분석 (8) 등의 2 차원 겔 전기 영동의 한계점을 해결 한 < / SUP>. 시스테인 잔기와 반응 염료는 리신 잔기 (9)와 반응에 비해 검출 감도가 증가하고있다. 이전의 연구에서는 고전 실버 염색 2 차원 전기 영동 (11)에 비해 부족한 시료 (10)의 분석을 위해 DIGE 포화 라벨링의 유용성을 입증 하였다. 이 기술은 빠른 속도로 대 식세포의 두 하위 유형 간 또는 동일한 하위 유형에서 치료 및 치료 대식 세포 사이의 단백질 변형을 분석하는 데 도움이됩니다.
이 단백질체 기술의 장점은 2D 겔 (12)을 분석하여 단백질의 크기 및 번역 후 변형의 정보에 대한 액세스를 가지고있다. 이 분석 될 수있는 샘플의 수를 제한하는, 이것이 높은 처리량 기법 아니다 고려되어야한다. 질량 분석을 기반으로 높은 처리량 분석의 개발 검토로는 최근에 13이을 향상시킬 수 있습니다.
_content "> 여기에서는 전기 영동 isoelectrofocusing의 과정을 통해 배양 된 대 식세포의 단백질 추출에서 2D DIGE 분석을 수행하는 방법을 제시하고, 적절한 2D 소프트웨어의 유용성에 대한 SDS-PAGE 정보뿐만 아니라.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 우리의 기관 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따른다. 건강한 사람의 기증자 버피 코트는 지역 수혈 센터 (릴, 프랑스)에서 얻었다. 버피 코트에서 얻은 샘플은 INSERM 컬렉션 (N ° DC2010-1209)로 선언됩니다.
1. 재료 및 문화 미디어 준비
- 1X PBS을 얻었다 멸균 증류수에 10 배의 인산 완충액 식염수 (PBS)에 희석.
- 와 10 % 풀링 된 인간 혈청이없는 겐타 마이신 (40 ㎍ / ㎖) 및 L- 글루타민 (2 mM)을 보충 RPMI 1640 배지를 확인합니다.
단핵구 유래 대 식세포의 2 차 문화 (MDM)
- 1X PBS와 buffycoat (25 ml)로 희석. 조심스럽게 실온에서 20 분 동안 1,600 XG에 피콜 / leucosep 튜브와 원심 분리기에로드.
- 새로운 튜브로 계면에서 단핵 세포를 수집합니다. 10 ml의 씻을 배는 PBS는 0.1 %의 에틸렌 디아민을 포함 1X1000 XG, 370 XG에 10 분간 각각 160 XG 다음 번 1X PBS 단독 160 XG에 10 분 동안의 연속적인 회 원심 의해 아세트산 (EDTA).
- 혈청 않고 5 ml의 RPMI-1640 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 접시 당 1 × 106 세포의 밀도로 35mm 접시에서 세포를 시드.
- 배양기에서 90 분 동안 침전 후 비 부착 세포를 함유하는 상층 액을 제거한다. 1 ml의 PBS로, 단핵구의 3 배를 구성, 부착 세포를 씻으십시오; 그 이전에 혈청 무료 세포에 10 %를 포함하는 새로운 배지 (v / v)의 인간 혈청 1ml를 추가합니다.
- 배양 6 일 후에, 분화 된 대 식세포 대체 (M2)을 수득 재조합 인간 IL-4 (15 ng의 / ㎖)을 첨가 6 일 동안 유지한다. 그리고, M1 식세포를 수득 4 시간 동안 12 일째에 리포 폴리 사카 라이드 (100 NG / ml)로 분화 된 대 식세포를 치료.
2D 전기 영동을위한 M1과 M2 대식 세포 단백질의 3 추출
- 세척 macroph나이 25 mM 트리스, 30 mM 트리스 pH를 8, 4 % 3 포함하는 버퍼의 pH 7.4, 스크랩으로 3 회 - [(3- cholamidopropyl) dimethylammonio] -1- 프로판 (CHAPS), 2 M 티오 7 M 요소를.
- -20 ° C에서 얼음과 상점에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 적합한 혼합기를 사용하여 세포를 Lyse.
- 상업 브래드 포드 시약을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 단백질 100 ㎕ 분주을 저장합니다.
4. Isoelectrofocusing
참고 : 어둠 속에서 모든 라벨링 작업을 수행합니다.
- 37 ° C에서 1 시간 동안 2 mM 트리스 (2- 카복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)에 용해 버퍼와 9 μL로 조정 각각의 샘플 (M1 및 M2 대 식세포)의 5 μg의를 줄입니다.
- 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 M1 및 M2 추출물의 설프 하이 드릴 - 반응성 염료 추출물 시아닌 3 (Cy3가)을 추가한다. M1로 시아닌 5 (Cy5에)를 첨가하고, M2는 0.8 nM의 / μg의 단백질 농도로 추출하여 부화37 ° C에서 30 분.
- 7 M 우레아, 2 M 티오 우레아, 4 % CHAPS, 130 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 2 % pharmalytes 함유 시료 완충액의 동일한 부피의 첨가로 반응을 중지.
- 믹스 한 손으로 Cy5에 표지 M2 샘플과 M1 샘플을 Cy3에이 표지와 다른 손에 Cy5에 표지 M1 샘플과 M2 샘플을 Cy3에이 표지.
- 고정화의 pH 구배를 재수 (IPG) 스트립 (240mm, pH를 3-10 선형 구배) 7 M 우레아, 등전점에 2 M 티오 4 % CHAPS 초점을 포함하는 버퍼에 표시된 혼합 된 시료 450 μL와 (IEF) 전지 시스템 어떤 전류를 적용하지 않고 24 시간 동안.
- 3 시간, 3 시간 동안 마지막으로 8,000 V 8000 V에 그라데이션에서 6 시간 동안 1,000 V에 그라데이션에서 다음 3 시간 동안 300 볼트 (V)에서 초점을 수행합니다.
5. 두 번째 차원
참고 : 어둠 속에서 모든 전기 작업을 수행합니다.
- 평형 완충액에서 IPG 스트립 포함 부화10 분 동안 0.1 mM 트리스 - 염산 (pH를 8), 6 M 우레아, 2 % 소듐 도데 실 설페이트 (/ V w) (SDS), 30 % (v / v) 글리세롤을 보내고.
- 12.5 %의 PAGE 젤에 두 번째 차원 (SDS 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE))에 대한 평형 IPG 스트립을 전송하고 아가 로스 로우 - 녹는 밀봉.
- 브로 모 페놀 블루 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 밤새 300 V이어서 70 V의 정전압 Ettan-Daltsix 시스템을 사용하여 20 ° C에서 전기 영동을 수행.
6. 이미지 인식 및 바이오 인포 매틱스 분석
- Cy5에 100 ㎛의 화소 크기로 이미지를 산출하기 위해 Cy3에 대한 580분의 532 nm 내지 670분의 633 나노 미터의 여기 / 방출 파장에서 DIGE 이미 저 스캐너 두 낮은 형광 유리판 사이에 캐스팅 스캔 젤.
- 이전에 (12)을 설명하는대로 상용 소프트웨어와 이미지 분석을 수행합니다.
- 계산하고 각 이미지에 자리 볼륨을 정상화. 소품으로 정규화 된 자리 볼륨을 할당각 지점의 총 가치의 ortion 젤에서 검출.
- 두 그룹 (M1 및 M2) 간의 정규화 스폿 볼륨 값을 비교하여 대 식세포의 각 유형에 대한 단백질 스폿 볼륨의 차이를 분석한다. 변화가 1.5 배 (p <0.05, 일방향 ANOVA 분석) 인 경우 상당한 것으로 스폿 볼륨 사이의 차이를 고려한다.
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Representative Results
적절한 차동 프로테옴 분석을 수행하기 위해, 분석 할 시료의 처리를 확인해야합니다.
이전 5 공표 제시된 예에서, 대 식세포의 세포 배양 품질은 형태학 및 분자 양태 요구된다. 대 식세포에 단핵구의 분화와 문화의 동질성이 위상 현미경으로 하였다. 그림 1은 M1과 M2 대 식세포의 차 문화의 예를 보여 주었다. 도시 된 바와 같이, 우리는 M1 (그림 1A, B)과 M2 (그림 1C, D) 낮은에서 위상 현미경으로 문화의 날 (12)의 대 식세포의 아형 (그림 1A, C)와 높은 (그림 1B, D의 동질성을 확인 ) 확대. 분명히, 우리는 차 문화의 12 일 후 대 식세포 M1과 M2의 독특한 형태를 관찰했다. 이전에 출판 된, 우리는 RT-PCR에 의해 TNF와 IL1 코딩의 mRNA의 존재를 확인M2에 MRC1 M1 대 식세포와 대한 B와 CCL18 14 대 식세포 (도시하지 않음).
이러한 조건을 조합 만 배양 단백질체 분석에 사용 하였다.
우리는 대 식세포, M1 (염증성)과 M2 (항 염증)의 부속 유형의 2D 단백질 패턴을 결정했다. 프로토콜에 설명과 M1과 M2 대 식세포가 하나 2D DIGE 전기 영동하여 단백질을 분석하기를 Cy3 또는 Cy5에 포화 염료로 표지 된 같은 목적을 위해, 우리는 M1과 M2 배양 대식 세포에서 단백질을 추출 하였다. (2 M1의 대표적인 2D 젤을 선물 그림 그림 2A, B)과 M2 (그림 2C, D) 생물 정보 학적 분석을위한 충분한 품질의 대 식세포. 단백질의 동일한 패턴 M1 또는 M2 독립적 인 Cy3을 사용 시아닌 염료 (도 2A, C) 또는 Cy5에 (도 2B, D) 중 관찰되었다. 이 예에서, 큰 선형 쪽H 구배를 사용 하였다 (3-10) 및 산성 또는 염기성 PL과 단백질 디테일 위해, 좁은의 pH 구배가 사용될 수있다.
흥미롭게도, 2D 겔의 생물 정보학적인 분석은 분석 2D 소프트웨어를 사용하여 비교 될 수있는 지점을 포함하는 (20) 영역을 밝혔다. 3 스폿 (20) 영역이 위치한 numerised 2D 젤의 예이다도. 2D 소프트웨어는 정량화 다른 샘플에서 여러 2D 겔 사이에 각각의 스폿의 양을 비교할 수있다. 소프트웨어가 증가 또는 스폿 볼륨의 감소를 정량화하고도 3에 나타낸 바와 같이,이 색에 의해 시각화 될 수있다. 스포트는 상당한 차등 발현을 갖는 것으로 간주되는 정규화 스폿 볼륨의 배 변화 프로토콜 부 문단 6에 나타낸 바와 같이 경우였다 P 값 <0.05와 1.5보다 큰. 대 식세포의 두 그룹 사이의 단백질 또는 폴리펩티드 스폿의 유무 소프트웨어에 의해 검출 될 수있다.
그림 1 : 대 식세포의 차 문화의 위상차 현미경 사진 (M1)의 형태의 예. (A, B) 및 M2 (C, D) 대 식세포. M1 대 식세포가 하루 12 위상차 현미경까지 6 일부터 IL-4 처리로 얻어진 하루 12 M2 대 식세포에서 4 시간 동안 리포 폴리 사카 라이드 처리에 의해 얻었다는 대 식세포의 두 아형의 명확한 식별을 할 수 있습니다. 낮은 (10X) (A, C)와 높은 (40X) (B, D) 확대에 사진 문화의 날 (12)에서 수행 하였다. 스케일 바 :. 50 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 :. M1과 M2 배양 된 대 식세포의 대표 2D DIGE 젤 단백질 (5 μg의가)으로 표시되었다 중 하나를 Cy3 (A, B) M1에서 또는 Cy5에 (C, D) (A, B)과 M2 (C, D) 대 식세포 12 일 동안 배양 하였다. M1 또는 M2 대 식세포 2D 겔의 동일한 패턴이 사용되는 표지 된 시아닌 독립적 얻었다. 분자량의 위치가 (MR) 표준이 왼쪽에 표시되고, PI는 겔의 하단에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 :. Progenesis SameSpots 소프트웨어와 대식 세포 단백질의 대표 2D DIGE 젤의 바이오 인포 매틱스 분석 스물 지역은 M1과 M2 대 식세포 사이의 차이 분석을 수행 검출되었다. 그림 하단에는 볼륨 명소의 배 변화의 색상 코드를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 식세포, M1 (염증 유발)와 M2 (소염)의 두 아형의 다양한 자극의 영향을 분석하는 방법을 자세히. 이전에 7을 발표 한 M1과 M2 대 식세포의 차 문화는 단핵구의 분화에서 얻었다.
2D DIGE 겔 전기 영동 과정은를 Cy3 및 Cy5의 형광 용 스캐너 여기 / 발광 파장 두배 겔을 검사하기 위하여 SDS-PAGE 용 isoelectrofocusing 낮은 형광 플레이트 IEF 셀 같은 특수 재료 및 장비를 필요 및 2D 소프트웨어. 이 방법은 약간의 연습과 손재주를 필요로한다.
1) 단백질의 추출은 알부민이나 케라틴 등의 불순물이없는 환경에서 중요하며, 2) 어둠 라벨 및 전기 영동을 수행, 성공적 2D 겔 전기 영동에 대한 몇 가지 중요한 단계가있다. 피기술로서 용해 완충 용액에서 단백질 감소 DTT의 사용은 반응성 시아닌 염료 라벨링 전에 단백질의 펩티드 설파이드 결합을 감소시키기위한 TCEP의 사용을 요구한다.
이 민감한 2D DIGE 기술은 존재 또는 서브 타입에 따라 단백질의 부재 하에서, 다양한 환경 조건에서 대 식세포에 의한 단백질 스폿의 차등 발현의 평가를 허용한다.
이 2D DIGE 기술의 한계 중 하나는 단백질의 14 %에 존재하지 않는 시스테인 잔기에 단백질 레이블 필요하다. 2D DIGE이 저렴 비록 다른 제한은, 정량적 질량 분석과 같은 높은 처리량의 기술과 비교하여 동일한 유형에서 분석 될 수있는 샘플의 비교적 작은 숫자이다.
이러한 LPS뿐만 아니라 TH1 사이토 카인 등의 미생물 자극,,, M1 염증 상태로 같은 IL-4, P와 같은 동안의 Th2 사이토 카인, 대 식세포를 활성화면역, 복구 및 항 염증 기능 3 M2 표현형에 셀을 olarize. 또는 단백질 체학 접근 방식을 통해 호스트 병원성이없는 표현형 M1과 M2 배양 된 대 식세포는 개별 하위 유형의 복잡한 기능 역할에 대한 자세한 사진을 제공 할 것입니다. 2D DIGE 전기는 폴리 펩타이드 / 단백질 또는 차등 하나의 하위 유형 또는 특정 자극이나 환경에서 대 식세포의 두 하위 유형 사이에 수정이 단백질의 번역 후 변형의 식별에 도움이 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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