Introduction
Makrofager er heterogene og plast celler som er i stand til å tilegne seg distinkte funksjonelle fenotyper. In vivo, disse cellene svare på et stort utvalg av mikro miljø signalssuch som mikrobielle produkter, cytokiner, osv. 1. In vitro, den pro-inflammatorisk fenotype (M1) av makrofager, kan induseres ved lipopolysakkarid (LPS) og den anti-inflammatoriske fenotype (M2) av enkelte cytokiner slik som interleukin-4 (IL-4). Videre kan makrofager bytte fra en aktivert M1 til M2 fenotype, og omvendt, avhengig av særskilte signaler 2.
Avhengig av fenotype, vil makrofager har forskjellige funksjoner. M1 makrofager er cellene som produserer pro-inflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor α (TNF-α), for å drepe mikroorganismer eller tumorceller 3. I kontrast, M2 makrofager hindre disse betennelsesreaksjon som i sårheling og fibrose ved å produsere anti-inflammatory faktorer som TGF-β 3,4.
Humane perifere mononukleære blodceller fra friske donorer ble isolert ved Ficoll-tetthetsgradient-sentrifugering som tidligere beskrevet 5 ved hjelp av en teknikk tilpasset fra Boyum 6. Makrofager i kultur kan differensieres i M1 eller M2 fenotype etter 6 dager med primær kultur 7.
Analyse av protein uttrykk eller proteinendringer mellom de to undertyper av makrofager under ulike kontrollerte stimuli, for eksempel verts patogenitet eller mikrobielle toksiner, vil være nyttig å tyde funksjonaliteten til pro- og anti-inflammatoriske makrofager.
Proteomikk er unike verktøy for direkte påvisning av proteiner som er spesielt opp- eller nedregulert i menneskelige dyrkede makrofager under ulike stimuli. Fluorescerende fargestoffer har løst noen av begrensningene i 2D gel elektroforese, slik som lav følsomhet og bildeanalyse 8 < / Sup>. De fargestoffer som reagerer med cysteinresiduer har økt følsomhet i forhold til de som reagerer med lysinrester 9. I en tidligere studie demonstrerte vi nytten av DIGE metnings merking for analysen av prøvene knappe 10 sammenlignet med den klassiske sølv-farget 2D-elektroforese 11. Denne teknologien er nyttig i raskt analysere protein modifikasjoner mellom de to undertyper av makrofager eller mellom ubehandlet og behandlet makrofager fra samme subtype.
Fordelene ved denne teknikk er proteomikk å ha tilgang til informasjon av protein størrelse og post-translasjonelle modifikasjoner ved å analysere 2D gel 12. Det bør tas hensyn til at dette ikke er en høy gjennomstrømning teknikk, noe som begrenser antallet prøver som kan analyseres. Utviklingen av store gjennomgangs analyser basert på massespektrometri som anmeldte nylig 13 kan forbedre dette.
_content "> Her presenterer vi hvordan du utfører 2D DIGE analyse fra protein utvinning av dyrkede makrofager gjennom prosesser av elektroforese, isoelectrofocusing, og SDS-PAGE samt informasjon om nytten av tilstrekkelig 2D programvare.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen følger retningslinjene til våre institusjoner menneskelige forskningsetisk komité. Buffycoat fra friske pasienter ble innhentet fra Regional Blood Trans Center (Lille, Frankrike). Prøver innhentet fra buffy strøk er erklært som en Inserm samling (n ° DC2010-1209).
1. Material and Culture Media Forberedelse
- Fortynn 10x fosfatbuffer saltvann (PBS) i sterilt destillert vann for å oppnå 1 x PBS.
- Gjør RPMI 1640-medium supplert med gentamicin (40 pg / ml) og L-glutamin (2 mM), med og uten 10% sammenslått humant serum.
2. Primærkulturer av moncyttavledede makrofager (MDM)
- Fortynn buffycoat (25 ml) med 1 x PBS. Nøye last på en Ficoll / leucosep røret og sentrifuger ved 1600 xg i 20 min, ved romtemperatur.
- Samle monocytter ved grenseflaten inn i et nytt rør. Vask 3 ganger med 10 ml 1 x PBS inneholdende 0,1% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved suksessive sentrifugeringer ved 1000 xg, 370 xg og 160 xg i 10 minutter hver, og deretter en gang i 1 x PBS alene ved 160 xg i 10 min.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml RPMI-1640 medium uten serum og frø celler i 35 mm skåler i en tetthet på 1 x 10 6 celler pr fatet.
- Etter sedimentering i 90 minutter i inkubatoren, kast supernatanten inneholdende de ikke-adherente celler. Vask de adherente celler, som består av monocytter, 3x med 1 ml PBS; deretter legge 1 ml friskt medium inneholdende 10% (volum / volum) humant serum til de tidligere serum frie celler.
- Etter 6 dagers kultur, for å gi alternative differensierte makrofager (M2), legge til rekombinant humant IL-4 (15 ng / ml) og opprettholde i 6 dager. Deretter, behandler differensierte makrofager med lipopolysakkarid (100 ng / ml) på dag 12 i 4 timer for å oppnå M1 makrofager.
3. Utvinning av M1 og M2 Makrofage Proteiner for 2D elektroforese
- Vask macrophaldre tre ganger med 25 mM Tris, pH 7,4, og skrap i buffer inneholdende 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M tiourea og 7 M urea.
- Lyses celler ved hjelp av en mikser som passer for 1,5 ml mikrosentrifugerør for 5 min på isen og oppbevar ved -20 ° C.
- Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en kommersiell Bradford reagens. Lagre 100 ul alikvoter av proteinene ved -20 ° C inntil bruk.
4. Isoelectrofocusing
MERK: Utfør alle merkingsprosedyrer i mørket.
- Reduser 5 ug av hver prøve (M1 og M2 makrofager) justert til 9 med ul lyseringsbuffer med 2 mM Tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) i 1 time ved 37 ° C.
- Legg cyanin 3 (Cy3) til M1 og M2 ekstrakt sulfhydryl-reaktive fargestoffekstrakt med en konsentrasjon på 0,8 nM / ug protein. Legg cyanin 5 (Cy5) til M1 og M2 ekstrakter med en konsentrasjon på 0,8 nM / ug protein og inkuberi 30 minutter ved 37 ° C.
- Stopp reaksjonen med tilsetning av et likt volum prøvebuffer inneholdende 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) og 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-merket M1 prøver med Cy5 merkede M2 prøvene i den ene hånden og Cy3-merket M2 prøver med Cy5-merket M1 prøver i en annen hånd.
- Rehydrere en Immobilisert pH-gradient (IPG) stripe (240 mm, pH 3-10 lineær gradient) med 450 mL av merket blandede prøver i buffer som inneholder 7 M urea, 2 M thiourea og 4% CHAPS på en isoelektrisk fokusering (IEF) cellesystem for 24 timer uten å bruke strøm.
- Utfør fokusering på 300 volt (V) i 3 timer, og deretter ved en gradient til 1000 V i 6 timer, ved en gradient i 8,000 V i 3 timer og til slutt ved 8000 V i 3 timer.
5. Second Dimension
MERK: Utfør alle elektroforese prosedyrer i mørket.
- Inkuber IPG strimler i ekvilibreringsbuffer inneholdeing 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 30% (v / v) glyserol i 10 min.
- Overfør ekvilibrerte IPG strimler for den andre dimensjonen (SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE)) på 12,5% PAGE geler og forsegle med lavt smeltepunkt agarose.
- Utføre elektroforese ved 20 ° C ved hjelp av en Ettan Daltsix-system ved en konstant spenning på 70 V over natten etterfulgt av 300 V inntil bromfenolblått fronten har nådd bunnen av gelen.
6. Image Acquisition og bioinformatiske analyse
- Scan gels kastet mellom de to lav-fluorescens glassplater med en DIGE Imager skanner på eksitasjon / utslippsbølgelengder av 532/580 nm for Cy3 og 633/670 nm for Cy5 å gi bilder med en pikselstørrelse på 100 mikrometer.
- Utfør bildeanalyse med kommersiell programvare som tidligere beskrevet 12.
- Beregn og normalspotvolum i hvert bilde. Tildele en normalisert flekk volum som en rekvisittortion den totale verdien av hver spot påvist i gel.
- Analyser forskjeller i proteinspotvolum for hver type makrofager ved å sammenligne normalisert flekk volumverdien mellom de to gruppene (M1 og M2). Vurdere forskjellen mellom spotvolum som vesentlig dersom endringen er 1,5 ganger (p <0,05, enveis ANOVA-analyse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å utføre passende differensial proteomikk analyse, bør behandlingen av prøver som skal analyseres verifiseres.
I det eksempel som presentert, blir cellekulturkvalitet av makrofager som kreves for morfologiske og molekylære aspekter som tidligere utgitt 5. Differensieringen av monocytter til makrofager og homogeniteten av kulturen ble etterfulgt av fase-mikroskopi. Figur 1 viser et eksempel på primærkulturer av M1 og M2 makrofager. Som vist, verifisert vi homogenitet M1 (figur 1A, B) og M2 (figur 1C, D) subtyper av makrofager på dag 12 av kultur ved fase-mikroskopi ved lav (Figur 1A, C) og høy (figur 1B, D ) forstørrelse. Klart, observerte vi en distinkt morfologi makrofager M1 og M2 etter 12 dager av primær kultur. Som tidligere publisert, har vi bekreftet ved RT-PCR i nærvær av mRNA som koder for TNF og IL1B i M1 makrofager og for MRC1 og CCL18 i M2 makrofager 14 (ikke vist).
Bare kulturer som kombinerer disse kriteriene ble brukt for proteomikk analyse.
Vi har fastslått 2D protein mønstre av de to undertyper av makrofager, M1 (pro-inflammatoriske) og M2 (anti-inflammatorisk). For dette formål vi ekstrahert proteiner fra M1 og M2 dyrkede makrofager som beskrevet i protokollen og M1 og M2 makrofager ble merket enten med eller Cy3 Cy5 metningsfargestoffer for å analysere proteinene ved elektroforese 2D DIGE. Figur 2 viser representative 2D-geler av M1 ( Figur 2A, B) og M2 (figur 2C, D) makrofager av tilstrekkelig kvalitet for bioinformatiske analyse. Det samme mønster av proteiner ble observert for enten M1 eller M2 uavhengig av de cyaninfargestoffer som brukes Cy3 (figur 2A, C) eller Cy5 (figur 2B, D). I dette eksempel ble en stor lineær pH gradient ble anvendt (3-10) og for detaljering proteiner med en sur eller basisk pl, kan smal pH-gradient benyttes.
Interessant, bioinformatiske analyse av 2D-gel avdekket 20 områder som inneholder flekker som kan analyseres og sammenlignes ved hjelp av 2D-programvaren. Figur 3 viser et eksempel på numerised 2D gel i hvilken de 20 områder av flekker er plassert. 2D-programvare er i stand til å kvantifisere og sammenligne volumet av hver spot mellom flere 2D gels fra ulike prøver. Programvaren kan kvantifisere økning eller reduksjon av sted volum og dette kan visualiseres ved farge som vist i Figur 3. Spots anses å ha betydelig differensial uttrykk hvis fold-endring av normaliserte spotvolum som angitt i punkt 6 i protokollen delen var større enn 1,5 med en p-verdi <0,05. Nærværet eller fraværet av et protein eller polypeptid sted mellom de to grupper av makrofager kan detekteres av programvaren.
Figur 1: Fotografier av fasekontrastmikroskopi av primær kultur av makrofager Eksempel på morfologi av M1. (A, B) og M2 (C, D) makrofager. M1 makrofager ble oppnådd ved lipopolysakkarid behandling i 4 timer ved dag 12. M2 makrofager ble oppnådd ved hjelp av IL-4 behandling med start fra dag 6 til dag 12. fase-kontrastmikroskopi tillater entydig identifisering av begge undertyper av makrofager. Fotografier på lav (10X) (A, C) og høy (40X) (B, D) forstørrelse ble utført på dag 12 av kultur. Målestokk:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
EEP-together.within-page = "always"> 
Figur 2:. Representative 2D DIGE gel av M1 og M2 dyrkede makrofager Proteins (5 ug) ble merket med enten Cy3 (A, B) eller Cy5 (C, D) fra M1 (A, B) og M2 (C, D) makrofager dyrket i 12 dager. Det samme mønster av 2D-gel for M1 eller M2 makrofager ble oppnådd uavhengig av den merkede cyanin anvendes. Posisjonene til molekylvekt (MR) standarder er angitt til venstre, og pi er indikert på bunnen av gelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
"/>
Figur 3:. Bioinformatiske analyse av en representant 2D DIGE gel fra makro proteiner med Progenese SameSpots programvare Tjue områder ble oppdaget for å utføre differensial analyse mellom M1 og M2 makrofager. Bunnen av figuren angir fargekode for fold-endring av volum flekker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet heri detaljer en metode for å analysere virkningen av ulike stimuli i de to undertyper av makrofager, M1 (pro-inflammatoriske) og M2 (anti-inflammatorisk). Primære kulturer av M1 og M2 makrofager ble oppnådd fra differensieringen av monocytter som tidligere publisert 7..
Prosedyren for 2D DIGE gel elektroforese krever spesialiserte materialer og utstyr, for eksempel IEF celle for isoelectrofocusing, lav-fluorescens plater for SDS-PAGE for å skanne to ganger gelen ved eksitasjon / emisjon bølgelengde for Cy3 og Cy5, en skanner for fluorescens og 2D programvare. Denne metoden krever litt øvelse og fingerferdighet.
Det er flere kritiske trinn for vellykket 2D-elektroforese: 1) utvinning av proteiner er kritisk i et miljø uten noen forurensninger slik som albumin eller keratin, og 2) å utføre merking og elektroforese i mørket. UnngåBruken av DTT for protein reduksjon i lyseringsbuffer som teknikken krever bruk av TCEP for å redusere peptid sulfid bindinger i proteiner før merking med cyanin reaktive fargestoffer.
Denne følsomme 2D DIGE teknikken tillater vurdering av den differensielle ekspresjonen av proteinflekker av makrofager under forskjellige miljøbetingelser, i nærvær eller fravær av proteiner, avhengig av subtype.
En av begrensningene ved denne 2D DIGE teknikk er behovet for å merke proteiner på cystein-rest, som er fraværende i 14% av proteinet. Den andre begrensningen er det relativt lille antallet prøver som kan analyseres på samme type i sammenligning med høy gjennomstrømning slik teknologi kvantitativ massespektrometri, skjønt 2D DIGE er mindre kostbart.
Mikrobielle stimuli, slik som LPS, samt Th1 cytokiner, aktiverer makrofager i en M1 inflammatorisk tilstand, mens Th2-cytokiner, slik som IL-4, polarize celler til en M2 fenotype med immunoregulatory, reparasjon, og anti-inflammatoriske funksjoner tre. Fenotyping M1 og M2 dyrkede makrofager med eller uten verts patogenitet gjennom proteomikk tilnærminger vil gi et mer detaljert bilde av den komplekse funksjonelle rollen til den enkelte undergrupper. 2D-elektroforese DIGE kan være nyttig for identifikasjon av polypeptider / proteiner eller post-translasjonelle modifikasjoner av disse proteiner differensielt modifisert på en subtype eller mellom de to undertyper av makrofager i henhold til spesifikke stimuli eller miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
