Introduction
Os macrófagos são células heterogéneas e de plástico que são capazes de adquirir fenótipos funcionais distintos. In vivo, estas células respondem a uma grande variedade de micro signalssuch ambiental como produtos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, o fenótipo pró-inflamatória (M1) de macrófagos pode ser induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e o fenótipo anti-inflamatória (M2) por algumas citocinas tais como a interleucina-4 (IL-4). Além disso, os macrófagos podem alternar de um M1 M2 activado para fenótipo, e, inversamente, mediante sinais específicos 2.
Dependendo do fenótipo, os macrófagos possuem diferentes funções. M1 macrófagos são células que produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral α (TNF-α), para matar os microorganismos ou células tumorais 3. Em contraste, os macrófagos M2 evitar estes resposta inflamatória como na cicatrização de feridas e fibrose através da produção de anti-inflammatory factores, tais como TGF-β 3,4.
As células mononucleares do sangue periférico humano a partir de dadores saudáveis foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll como previamente descrito 5 utilizando uma técnica adaptada de Boyum 6. Os macrófagos em cultura podem ser diferenciadas em M1 ou M2 fenótipo após 6 dias de cultura primária 7.
Análise da expressão de proteínas ou mudanças de proteína entre os dois subtipos de macrófagos sob vários estímulos controlados, tais como patogenicidade hospedeiro ou toxinas microbianas, será útil para decifrar a funcionalidade do pro- macrófagos e anti-inflamatórios.
Proteômica são ferramentas exclusivas para o monitoramento direto de proteínas que são especificamente para cima ou para baixo-regulado em macrófagos cultivados humanos sob vários estímulos. Corantes fluorescentes resolveu algumas das limitações de eletroforese em gel 2D, como a baixa sensibilidade e análise de imagem de 8 < / Sup>. Os corantes que reagem com resíduos de cisteína aumentou a sensibilidade de detecção em comparação com aqueles reagir com 9 resíduos de lisina. Em um estudo anterior, demonstramos a utilidade de rotulagem saturação DIGE para a análise de amostras de escassos 10 em comparação com o 2D eletroforese manchada de prata clássica 11. Esta tecnologia é útil para analisar rapidamente modificações de proteína entre os dois subtipos de macrófagos ou entre os macrófagos não tratados e tratados do mesmo subtipo.
As vantagens desta técnica são proteómica ter acesso às informações do tamanho da proteína e modificações pós-tradução através da análise do gel 2D 12. Deve ser tomado em consideração que esta não é uma técnica de alto rendimento, o que limita o número de amostras que podem ser analisadas. O desenvolvimento de ensaios de alto rendimento com base em espectrometria de massa como revisto recentemente 13 pode melhorar esta.
_content "> Aqui apresentamos como realizar análise 2D DIGE da extração de proteínas de macrófagos em cultura através dos processos de eletroforese, isoelectrofocusing e SDS-PAGE, bem como informações sobre a utilidade do software 2D adequada.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo segue as diretrizes da nossa humana comitê de ética em pesquisa das instituições. Buffy coat de dadores humanos saudáveis foram obtidos a partir do Centro Regional de Sangue Transfusion (Lille, França). As amostras obtidas a partir dos casacos de Buffy são declaradas como uma coleção Inserm (n ° DC2010-1209).
1. Material e Meios de Cultura Preparação
- Diluir 10x de Tampão Fosfato Salino (PBS) em água destilada estéril para obter 1x PBS.
- Adicione meio RPMI 1640 suplementado com gentamicina (40 ug / ml) e L-glutamina (2 mM), com e sem 10% de soro humano reunido.
2. As culturas primárias de macrófagos derivados de monócitos (MDM)
- Diluir buffycoat (25 ml) com 1x PBS. Encher cuidadosamente num gradiente de Ficoll tubo de centrífuga e / Leucosep a 1.600 xg durante 20 min, à temperatura ambiente.
- Recolhe monócitos na interface para um novo tubo. Lavar 3x com 10 ml de 1x PBS contendo 0,1% etilenodiaminotetraácido acético (EDTA) por centrifugações sucessivas a 1.000 xg, 370 xg e 160 xg durante 10 min cada, e depois uma vez em 1x PBS sozinho a 160 xg durante 10 min.
- Ressuspender o sedimento celular em 5 ml de meio RPMI-1640 sem soro e semear as células em pratos de 35 mm a uma densidade de 1 x 10 6 células por prato.
- Após sedimentação durante 90 minutos na incubadora, desprezar o sobrenadante contendo as células não aderentes. Lavam-se as células aderentes, que consiste de monócitos, 3x com 1 ml de PBS; em seguida adicionar 1 ml de meio fresco contendo 10% (v / v) de soro humano para as células livres de soro anteriormente.
- Após 6 dias de cultura, para se obter os macrófagos diferenciados alternativos (M2), adicionar recombinante humana IL-4 (15 ng / ml) e manter durante 6 dias. Em seguida, o tratamento de macrófagos diferenciados com lipopolissacárido (100 ng / mL) no dia 12 durante 4 horas para se obter os macrófagos M1.
3. Extração de macrófagos M1 e M2 Proteínas para 2D Eletroforese
- Wash macrophidades três vezes com Tris 25 mM, pH 7,4, e resíduos em tampão contendo 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato (CHAPS), 2 M tioureia e 7 M de ureia.
- Lisar células utilizando um misturador adequado para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para 5 min em gelo e armazenar a -20 ° C.
- Determinar a concentração de proteína usando um reagente de Bradford comercial. Armazenar aliquotas de 100 ul das proteínas à temperatura de -20 ° C até à sua utilização.
4. Isoelectrofocusing
NOTA: Realizar todos os procedimentos de rotulagem no escuro.
- Reduzir a 5 ug de cada amostra (M1 e M2 macrófagos) ajustado para 9 mL com tampão de lise com Tris 2 mM (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C.
- Adicionar cianina 3 (Cy3) de extracto de M1 e M2 extracto corante sulfidrilo reactivo, a uma concentração de 0,8 nM de proteína / ug. Adicionar cianina 5 (Cy5) a M1 e M2 extrai a uma concentração de 0,8 nM / mg de proteína e incubardurante 30 min a 37 ° C.
- Pare a reacção com a adição de um volume igual de tampão de amostra contendo 7 M de ureia, 2 M tioureia, 4% CHAPS, 130 mM de ditiotreitol (DTT) e 2% pharmalytes.
- Mix Cy3 marcado amostras M1 com amostras M2 Cy5-rotulados em uma mão e Cy3 marcado amostras M2 com amostras M1 Cy5-rotulados em outro lado.
- Reidratar um gradiente de pH imobilizado (IPG) faixa (240 milímetros, pH 3-10 gradiente linear) com 450 mL de amostras misturadas marcados em tampão contendo 7 M uréia, 2 M de tiouréia e 4% CHAPS em uma focalização isoelétrica (IEF) sistema de célula para 24 horas, sem aplicar qualquer corrente.
- Realizar concentrando a 300 volts (V) durante 3 horas, e, em seguida, em um gradiente a 1.000 V durante 6 h, em um gradiente a 8000 V durante 3 horas e, finalmente a 8000 V durante 3 horas.
5. Segunda Dimensão
NOTA: Execute todos os procedimentos de eletroforese no escuro.
- Incubar as tiras de IPG em tampão de equilíbrio contering 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M de ureia, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sódio (SDS) e 30% (v / v) de glicerol durante 10 min.
- Transferem-se as tiras de IPG equilibradas para a segunda dimensão (electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) em 12,5% PAGE e selar com baixo ponto de fusão de agarose.
- Levar a cabo a electroforese a 20 ° C utilizando um sistema Ettan-Daltsix a uma voltagem constante de 70 V durante a noite seguido de 300 V até o azul de bromofenol a frente atinge o fundo do gel.
6. Aquisição de Imagem e Análise Bioinformatic
- Geles de digitalização expressos entre as duas placas de vidro de baixa fluorescência com um scanner DIGE Imager em comprimentos de onda de excitação / emissão de 532/580 nm para Cy3 e Cy5 para 633/670 nm para se obter imagens com um tamanho de pixel de 100 um.
- Realizar análise de imagem com software comercial, como anteriormente descrito 12.
- Calcule e normalizar volumes pontuais em cada imagem. Atribuir um volume local normalizada como um suporteortion do valor total de cada mancha detectada no gel.
- Analise as diferenças de volumes pontuais de proteína para cada tipo de macrófagos por comparação do valor de volume normalizado local entre os dois grupos (M1 e M2). Considere a diferença entre os volumes pontuais para ser significativa se a mudança é de 1,5 vezes (p <0,05, de um modo análise ANOVA).
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Representative Results
Para realizar a análise proteômica diferencial adequado, o processamento de amostras a serem analisadas devem ser verificadas.
No exemplo apresentado, a qualidade de cultura de células de macrófagos é necessário para os aspectos morfológicos e moleculares, tal como publicado anteriormente 5. A diferenciação de monócitos em macrófagos e a homogeneidade da cultura foi seguido por microscopia de fase. A Figura 1 mostrou um exemplo de culturas primárias de M1 e M2 macrófagos. Como mostrado, verificou-se a homogeneidade de M1 (Figura 1A, B) e M2 (figura 1C, D) subtipos de macrófagos no dia 12 de cultura por microscopia de fase com baixo (Figura 1A, C) e alta (Figura 1B, D ) ampliação. Claramente, observou-se uma morfologia distinta de macrófagos M1 e M2, após 12 dias de cultura primária. Tal como anteriormente publicado, verificou-se por RT-PCR a presença de mRNA que codifica para o TNF e IL1B em macrófagos M1 e para MRC1 e CCL18 no M2 macrófagos 14 (não mostrado).
Somente culturas que combinam estes critérios foram utilizados para a análise proteômica.
Determinou-se os padrões de proteínas 2D dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). Para o efeito, foram extraídas proteínas M1 e M2 macrófagos cultivados conforme detalhado no protocolo e macrófagos M1 e M2 foram ambos marcados com corantes Cy3 ou Cy5 saturação para analisar as proteínas por eletroforese 2D DIGE. Figura 2 apresenta géis representativos 2D de M1 ( A Figura 2A, B) e M2 (Figura 2C, D) macrófagos de qualidade suficiente para análise bioinformática. O mesmo padrão de proteínas foi observada durante ou M1 ou M2, independentemente, dos corantes de cianina utilizados Cy3 (Figura 2A, C) ou Cy5 (Figura 2B, D). Neste exemplo, uma grande p linearGradiente de H foi utilizado (3-10) e para o detalhamento proteínas com um pl ácida ou básica, gradiente de pH estreito pode ser utilizada.
Curiosamente, a análise bioinformática do gel 2D revelou 20 áreas que contêm pontos que podem ser analisados e comparados usando o software 2D. A Figura 3 é um exemplo de gel 2D numerised em que as áreas de 20 pontos estão localizados. O software 2D é capaz de quantificar e comparar o volume de cada ponto entre vários géis 2D a partir de diferentes amostras. O software pode quantificar o aumento ou a diminuição do volume local e isso pode ser visualizado por cor, conforme indicado na Figura 3. Spots são considerados como expressão diferencial significativa se o fold-change dos volumes pontuais normalizados, conforme indicado no parágrafo 6 da seção de protocolo foi maior do que 1,5 com um valor de p <0,05. A presença ou ausência de um local da proteína ou polipeptídeo entre os dois grupos de macrófagos pode ser detectado pelo software.
Figura 1: Fotografias de microscopia de contraste de fase de uma cultura primária de macrófagos Exemplo de morfologia de M1. (A, B) e M2 (C, D) macrófagos. Macrófagos M1 foram obtidas por tratamento lipopolissacarídeo durante 4 h no dia 12. Os macrófagos M2 foram obtidos por IL-4 tratamento a partir do dia 6 até ao dia 12. A microscopia de contraste de fase permite a identificação clara de ambos os subtipos de macrófagos. As fotografias em baixo (10X) (A, C) e alta (40X) (B, D) de ampliação foram realizados no dia 12 de cultura. Barra de escala:. 50 mm Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2:. Representativas 2D DIGE gel de M1 e M2 macrófagos cultivados Proteínas (5 ug) foram marcadas quer com Cy3 (A, B) ou Cy5 (C, D) de M1 (A, B) e M2 (C, D) macrófagos cultivados durante 12 dias. O mesmo padrão de gel de 2D para M1 ou M2 macrófagos foi obtido independentemente de a cianina marcado utilizado. Os cargos de peso molecular padrões (RM) são indicados à esquerda, eo Pi é indicada na parte inferior do gel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3:. Bioinformatic análise de um representante de gel 2D DIGE a partir de proteínas de macrófagos com software progênese SameSpots Vinte áreas foram detectados para realizar a análise diferencial entre M1 e M2 macrófagos. A parte inferior da figura indica o código de cores para o fold-change dos pontos de volume. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito detalha um método para analisar o impacto de vários estímulos dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). As culturas primárias de M1 e M2 macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de monócitos como publicado anteriormente 7.
O procedimento de eletroforese em gel 2D DIGE requer materiais e equipamentos especializados, como o IEF celular para placas isoelectrofocusing, baixa fluorescência para a SDS-PAGE, a fim de verificar duas vezes o gel a excitação / comprimento de onda de emissão de Cy3 e Cy5, um scanner de fluorescência e software 2D. Este método requer um pouco de prática e destreza manual.
Existem vários passos críticos para a electroforese em gel 2D bem sucedida: 1) a extracção de proteínas é crítica em um ambiente sem quaisquer contaminantes, tais como albumina ou queratina, e 2) realizar a etiquetagem e electroforese no escuro. Evite outilização de DTT para redução da proteína no tampão de lise, como a técnica requer a utilização de TCEP para reduzir ligações de sulfureto de péptido em proteínas antes de rotular cianina com corantes reactivos.
Esta técnica 2D DIGE sensível permite a avaliação da expressão diferencial de manchas de proteínas por macrófagos, em diferentes condições ambientais, na presença ou ausência de proteínas, dependendo do subtipo.
Uma das limitações dessa técnica 2D DIGE é a necessidade de rotular as proteínas no resíduo de cisteína, que está ausente em 14% da proteína. A outra limitação é o número relativamente pequeno de amostras que podem ser analisadas no mesmo tipo em comparação com tecnologias de alto rendimento quantitativo como espectrometria de massa, embora 2D DIGE é menos dispendiosa.
Estímulos microbianos, tais como LPS, bem como citocinas Th1, activam os macrófagos para um estado inflamatório M1, enquanto que as citocinas de Th2, tais como IL-4, polarize células para um fenótipo M2 com imunorreguladora, reparar e funções anti-inflamatórias 3. Fenotipagem M1 e M2 macrófagos cultivados com ou sem patogenicidade hospedeiro através de abordagens proteômicas irá fornecer uma imagem mais detalhada do papel funcional complexo de subtipos individuais. A electroforese 2D DIGE podem ser úteis para a identificação de polipeptídeos / proteínas ou modificações pós-tradução destas proteínas diferencialmente modificados em um subtipo, ou entre os dois subtipos de macrófagos, sob estímulo ou ambiente específicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
