Introduction
Макрофаги являются гетерогенными и пластмассовые клетки, которые способны приобретать различные функциональные фенотипы. В естественных условиях, эти клетки отвечают на большое разнообразие микро окружающей signalssuch как микробных продуктов, цитокины, и т.д.. 1. В пробирке, про-воспалительных фенотип (М1) из макрофагов может быть индуцирована липополисахарида (LPS) и противовоспалительного фенотипа (M2) с помощью некоторых цитокинов, таких как интерлейкин-4 (IL-4). Кроме того, макрофаги могут переключаться с активированным M1 M2 к фенотипу, и, наоборот, при определенных сигналов 2.
В зависимости от фенотипа, макрофаги будут иметь различные функции. M1 макрофаги являются клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли α (TNF-α), чтобы убить микроорганизмы или опухолевые клетки 3. В отличие от этого, М2 макрофаги предотвратить эти воспалительную реакцию, как в заживлении ран и фиброза производя анти-inflammatorY факторы, такие как TGF-β 3,4.
Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови от здоровых доноров были выделены с помощью Ficoll центрифугированием в градиенте плотности, как описано выше 5 с помощью метода, приспособленный от 6 Boyum. Макрофаги в культуре могут быть дифференцированы в фенотипе М1 или М2 через 6 дней после первичной культуры 7.
Анализ экспрессии белка или белка изменений между двумя подтипами макрофагов при различных величинах стимулами, такими как принимающей патогенности или микробные токсины, будет полезно, чтобы расшифровать функциональные возможности про- и противовоспалительных макрофагов.
Протеомика уникальные инструменты для прямого мониторинга белков, которые специфически вверх или вниз регулируется в культивируемых макрофагов человека при различных раздражителей. Флуоресцентные красители были решены некоторые из ограничений электрофореза гель 2D, таких как низкой чувствительности и анализа изображений 8 < / SUP>. Красители, реагирующие с остатками цистеина увеличили чувствительность обнаружения по сравнению с теми в реакцию с остатками лизина 9. В предыдущем исследовании, мы доказали полезность ПГЛП маркировки насыщения для анализа скудных образцов 10 по сравнению с классической серебряной окрашенных 2D электрофореза 11. Эта технология является полезным в быстро анализа белковых модификаций между двумя подтипами макрофагов или между необработанных и обработанных макрофагов из того же подтипа.
Преимущества этого протеомного техники будут иметь доступ к информации о размерах белка и пост-трансляционных модификаций, анализируя 2D гель 12. Следует принимать во внимание, что это не техника с высокой пропускной способностью, ограничение количества образцов, которые могут быть проанализированы. Развитие высоких анализов пропускной основе масс-спектрометрии, рассмотренный недавно 13 может улучшить это.
_content "> Здесь мы представляем, как выполнить 2D Dige анализ от извлечения белка из культивируемых макрофагов через процессы электрофореза, Изоэлектрофокусирование, и SDS-PAGE, а также информация о полезности адекватной 2D программного обеспечения.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол соответствии с руководящими принципами нашей учреждений комитета по этике человека. Баффи пальто от здоровых доноров были получены из областного центра переливания крови (Лилль, Франция). Образцы, полученные от лейкоцитарных пленок объявлены как коллекции Inserm (п ° DC2010-1209).
1. Материал и Культура Медиа Подготовка
- Развести 10x фосфатный буфер солевом растворе (PBS) в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить 1X PBS.
- Сделать RPMI 1640, дополненной гентамицин (40 мкг / мл) и L-глутамин (2 мМ), с и без 10% объединенной человеческой сыворотке.
2. Первичные культуры моноцитов макрофагов (MDM)
- Развести buffycoat (25 мл) с 1х PBS. Тщательно загрузить на Ficoll / leucosep трубки и центрифуге при 1600 х г в течение 20 мин, при комнатной температуре.
- Сбор моноциты на границе раздела в новую пробирку. Промыть 3 раза с 10 мл 1X PBS, содержащим 0,1% этилендиаминтетрауксуснаяуксусной кислоты (ЭДТА) путем последовательных центрифугирования при 1000 х г, 370 мкг и 160 мкг в течение 10 мин соответственно, а затем один раз в 1х PBS в покое при 160 х г в течение 10 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл среды RPMI-1640 без сыворотки и семян клеток в 35 мм чашках при плотности 1 × 10 6 клеток на чашку.
- После оседания в течение 90 мин в инкубаторе, отбросить супернатант, содержащий неадгезированных клетки. Вымойте прилипшие клетки, состоящие из моноцитов, 3x с 1 мл PBS; Затем добавляют 1 мл свежей среды, содержащей 10% (об / об) сыворотки крови человека с ранее сыворотки свободных клеток.
- После 6 дней культивирования, с получением альтернативных дифференцированные макрофаги (м2), добавить рекомбинантный человеческий IL-4 (15 нг / мл) и поддерживать в течение 6 дней. Затем лечения дифференцированные макрофаги с липополисахаридом (100 нг / мл) на 12-й день в течение 4 ч, чтобы получить M1 макрофаги.
3. Добыча М1 и М2 макрофагов белков для 2D-электрофореза
- Вымойте macrophвозраст три раза с 25 мМ Трис, рН 7,4, и лома в буфере, содержащем 30 мМ Трис рН 8, 4% 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS), 2 М тиомочевины и 7 М мочевины.
- Лизировать клетки с помощью смесителя, подходящую для 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в течение 5 минут в лед и хранить при -20 ° С.
- Определить концентрацию белка с использованием коммерческого реагента Брэдфорда. Хранить 100 мкл аликвоты белков при температуре -20 ° С до использования.
4. Изоэлектрофокусирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры маркировки в темноте.
- Уменьшить 5 мкг каждого образца (M1 и M2 макрофаги) доводили до 9 мкл буфера для лизиса с 2 мМ Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) в течение 1 ч при 37 ° С.
- Добавить цианиновыми 3 (Cy3) для извлечения M1 и M2 экстракта красителя сульфгидрильной-реактивного при концентрации 0,8 нМ / мкг белка. Добавить цианиновыми 5 (Су5) до M1 и M2 извлекает при концентрации 0,8 нМ / мкг белка и инкубироватьв течение 30 мин при 37 ° С.
- Остановка реакции с добавлением равного объема образца буфере, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 130 мМ дитиотреитола (ДТТ) и 2% pharmalytes.
- Mix Cy3 меченных образцов М1 с Cy5 меченных образцов М2 в одной руке и Cy3 меченных образцов M2 с Cy5 меченных образцов М1 в другой руке.
- Увлажняет иммобилизованным градиентом рН (IPG) полоса (240 мм, рН 3-10 линейный градиент) с 450 мкл меченых смешанных образцов в буфере, содержащем 7 М мочевину, 2 М тиомочевины и 4% ХАПС на изоэлектрофокусирование (МЭФ) система клеток в течение 24 часов без применения каких-либо ток.
- Выполнение фокусировки на 300 вольт (В) в течение 3 ч, а затем при градиенте до 1000 В в течение 6 ч, при градиенте до 8000 В в течение 3 ч и, наконец, в 8000 V в течение 3 часов.
5. Второе измерение
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры электрофореза в темноте.
- Выдержите полоски IPG в уравновешивающего буфера содержатчисле 0,1 мМ Трис-HCl (рН 8), 6 М мочевины, 2% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS) и 30% (об / об) глицерина в течение 10 мин.
- Перенесите уравновешивают IPG полоски для второго измерения (электрофорез SDS-полиакриламидном геле (PAGE)) на 12,5% -ном ПААГ и печать с низкой температурой плавления агарозы.
- Провести электрофорез при 20 ° С с использованием системы Ettan-Daltsix при постоянном напряжении 70 В в течение ночи с последующим 300 V, пока бромфеноловый синий фронт не достигнет дна геля.
6. Получение изображения и Биоинформационный Анализ
- Проверять гели, поданные между двумя стеклянными пластинами с низким уровнем флуоресценции с помощью сканера ПГЛП Imager на длинах волн возбуждения / излучения 532/580 нм для Cy3 и 633/670 нм для Cy5 для получения изображений с размером пикселя 100 мкм.
- Выполнить анализ изображения с коммерческим программным обеспечением, как ранее описано 12.
- Рассчитать и нормализовать объемы спот в каждом изображении. Связать нормированный объем спот как опоруortion от общей стоимости каждого пятна обнаружены в геле.
- Анализ различий в объемах спот белка для каждого типа макрофагов путем сравнения нормированное значение громкости место между двумя группами (M1 и M2). Рассмотрим разницу между объемами спотовых быть значительным, если это изменение в 1,5 раза (р <0,05, односторонний ANOVA анализ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для выполнения соответствующего дифференциального протеомного анализа, обработки анализируемых образцов должно быть проверено.
В примере, представленном, качество культуры клеток макрофагов требуется для морфологических и молекулярных аспектов, как опубликовано ранее 5. Дифференцировка моноцитов в макрофаги и однородность культуры последовало фазовой микроскопии. Рисунок 1 показал пример первичных культурах М1 и М2 макрофагов. Как показано, мы проверяется однородность M1 (1А, Б) и М2 (рис 1С, D) подтипов макрофагов в день 12 культуры по поэтапному микроскопии при низких (рис 1а, в) и высокой (рис 1В, D ) увеличение. Ясно, что мы наблюдали отчетливую морфологию макрофагов М1 и М2 через 12 дней после первичной культуре. По опубликованным ранее, мы проверяется RT-PCR на присутствие мРНК, кодирующую TNF и IL1B в макрофагах и M1 для MRC1 и CCL18 в М2 макрофагов 14 (не показано).
Только культур, сочетающих эти критерии были использованы для протеомного анализа.
Мы определили 2D модели белка двух подтипов макрофагов, М1 (провоспалительного) и М2 (противовоспалительное). Для этой цели, мы извлекли белки из М1 и М2 культивируемых макрофагов, как указано в протоколе и М1 и М2 макрофаги либо помечены Cy3 или Cy5 красителей насыщения для анализа белков от 2D ПГЛП электрофореза. Рисунок 2 представляет представительские 2D гелей M1 ( 2А, Б) и М2 (рис 2С, D) макрофаги достаточного качества для биоинформатики анализа. Та же картина белков наблюдалась ни для M1 или M2 независимо от цианиновых красителей, используемых Су3 (фиг.2А, C) или Cy5 (фиг.2В, D). В этом примере большое линейное рН градиент был использован (3-10) и для детализации белки с кислотным или основным пл, узкая градиент рН могут быть использованы.
Интересно, что биоинформатики анализ 2D-геле показал 20 областей, содержащих места, которые могут быть проанализированы и сравнены с использованием программного обеспечения 2D. Рисунок 3 является примером numerised 2D гель, в котором участки 20 расположены пятен. 2D программное обеспечение способно количественно и сравнить объем каждого пятна между несколькими 2D гелей из различных образцов. Программное обеспечение может количественно увеличение или уменьшение объема спот, и это может быть визуализированы цвета, как показано на рисунке 3. Пятна как считается, имеют значительную дифференциальную экспрессию если складка-смена нормированных объемов спотовых, как указано в пункте 6 раздела протокола был больше, чем 1,5 с р-значение <0,05. Наличие или отсутствие в месте белка или полипептида между двумя группами макрофагов может быть обнаружен с помощью программного обеспечения.
Рисунок 1: Фотографии фазово-контрастной микроскопии первичной культуре макрофагов Пример морфологии M1. (A, B) и М2 (C, D) макрофаги. M1 макрофаги были получены путем обработки липополисахаридом в течение 4 часов в день 12. М2 макрофагов были получены ИЛ-4 не лечения, начиная с 6-й день до дня 12. фазово-контрастной микроскопии позволяет четко идентифицировать обоих подтипов макрофагов. Фотографии при низкой (10X) (А, С) и высокой (40Х) (б, г) увеличение проводились на 12-й день культуры. Масштабная линейка:. 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
ЕЭП-together.within-страница = "всегда"> 
На рисунке 2:. Представитель 2D ПГЛП гель из М1 и М2 культивируемых макрофагов Белки (5 мкг) были помечены либо Су3 (А, В) или Cy5 (С, D) от M1 (А, В) и М2 (С, D) макрофаги культивировали в течение 12 дней. Такая же картина из 2D гель для М1 или М2 макрофагов была получена независимо от меченого цианин используется. Позиции молекулярной массой (MR) стандарты указаны слева, и Пи указывается в нижней части геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
"/>
Рисунок 3:. Биоинформационный анализ репрезентативной 2D ПГЛП геля из макрофагов белков с программным обеспечением Progenesis SameSpots Двадцать области были обнаружены выполнять дифференциальное анализ между М1 и М2 макрофагов. В нижней части рисунка показывает, цветовой код для сгиба-изменение объема пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол описано здесь подробно метод для анализа влияния различных раздражителей двух подтипов макрофагов, М1 (провоспалительного) и М2 (противовоспалительное). Первичные культуры из М1 и М2 макрофагов были получены от дифференциации моноцитов, опубликованной ранее 7.
Процедура гелевого электрофореза 2D ПГЛП требует специализированных материалов и оборудования, таких как РИФ клетки для Изоэлектрофокусирование, с низким уровнем флуоресценции пластин для SDS-PAGE для сканирования в два раза гель при возбуждения / длины волны излучения для Cy3 и Cy5, сканер для флуоресценции и 2D программное обеспечение. Этот метод требует некоторой практики и ловкости рук.
Есть несколько важных шагов для успешного электрофореза гель 2D: 1) экстракция белков имеет решающее значение в среде без каких-либо примесей, таких как альбумин или кератина, и 2), выполняющего маркировки и электрофореза в темноте. ИзбегайтеИспользование DTT для снижения белка в буфере для лизиса, как технике требует использования ТСЕР для снижения сульфидных пептидных связей в белках, прежде маркировки с цианиновыми активных красителей.
Этот чувствительный 2D ПГЛП методика позволяет оценивать дифференциальной экспрессии белковых пятен макрофагами при различных условиях окружающей среды, в присутствии или в отсутствие белков в зависимости от подтипа.
Один из недостатков этого метода 2D ПГЛП является необходимость маркировать белки на остаток цистеина, который отсутствует в 14% белка. Другим ограничением является относительно небольшое число образцов, которые могут быть проанализированы в то же типа, по сравнению с высокой пропускной технологии, как количественного масс-спектрометрии, при том, что 2D ПГЛП является менее дорогостоящим.
Микробные стимулы, такие как LPS, а также Th1 цитокинов, активируют макрофаги в воспалительного состояния M1, в то время как Th2 цитокины, такие как IL-4, Сolarize клетки фенотипа М2 с иммунорегуляторными, ремонту и противовоспалительных функций 3. Фенотипирование M1 и M2, культивируемые макрофаги с или без хозяина патогенности через протеомики подходов обеспечит более детальную картину сложной функциональной роли отдельных подтипов. 2D-электрофореза ПГЛП может быть полезным для идентификации полипептидов / белков или посттрансляционных модификаций этих белков, модифицированных в дифференциально одного подтипа или между двумя подтипами макрофагов в конкретных стимулов или окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
