Introduction
Los macrófagos son células heterogéneas y de plástico que son capaces de adquirir fenotipos funcionales distintos. In vivo, estas células responden a una gran variedad de signalssuch ambiental micro como productos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, el fenotipo pro-inflamatoria (M1) de macrófagos puede ser inducida por lipopolisacárido (LPS) y el fenotipo anti-inflamatoria (M2) por algunas citoquinas tales como la interleuquina-4 (IL-4). Además, los macrófagos pueden cambiar de un M1 a M2 fenotipo activado, y por el contrario, de las señales específicas 2.
Dependiendo del fenotipo, macrófagos tendrán diferentes funciones. Macrófagos M1 son células que producen citoquinas pro-inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), para matar microorganismos o células tumorales 3. En contraste, los macrófagos M2 prevenir estas respuesta inflamatoria como en la curación de heridas y la fibrosis mediante la producción de anti-inflammatorY factores tales como TGF-β 3,4.
Células mononucleares de sangre periférica humanos de donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll como se describió anteriormente 5 utilizando una técnica adaptada de Boyum 6. Los macrófagos en cultivo pueden diferenciarse en M1 o M2 fenotipo después de 6 días de cultivo primaria 7.
Análisis de la expresión de proteínas o cambios en las proteínas entre los dos subtipos de macrófagos en virtud de diversos estímulos controlados, tales como la patogenicidad de host o toxinas microbianas, será útil para descifrar la funcionalidad de la pro- y anti-macrófagos inflamatorios.
Proteómica son herramientas únicas para la supervisión directa de las proteínas que son específicamente altura o hacia abajo-regulada en los macrófagos humanos cultivados bajo diferentes estímulos. Los tintes fluorescentes han resuelto algunas de las limitaciones de la electroforesis en gel de 2D, tales como una baja sensibilidad y análisis de imagen 8 < / Sup>. Los colorantes que reaccionan con residuos de cisteína han aumentado la sensibilidad de detección en comparación con los reaccionar con residuos de lisina 9. En un estudio anterior, hemos demostrado la utilidad del etiquetado saturación DIGE para el análisis de los escasos 10 muestras en comparación con el teñido de plata clásica electroforesis 2D 11. Esta tecnología es útil para analizar rápidamente modificaciones de la proteína entre los dos subtipos de macrófagos o entre los macrófagos no tratados y tratados del mismo subtipo.
Las ventajas de esta técnica proteómica están teniendo acceso a la información de tamaño de la proteína y las modificaciones posteriores a la traducción mediante el análisis del gel 2D 12. Debe tenerse en cuenta que esta no es una técnica de alto rendimiento, lo que limita el número de muestras que se pueden analizar. El desarrollo de ensayos de alto rendimiento basados en espectrometría de masas como revisado recientemente 13 puede mejorar esto.
_content "> Aquí presentamos cómo realizar análisis DIGE 2D a partir de la extracción de proteínas de los macrófagos en cultivo a través de los procesos de electroforesis, isoelectroenfoque y SDS-PAGE, así como información sobre la utilidad de software 2D adecuada.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo sigue las directrices de nuestro comité de instituciones de ética de la investigación humana. Capa de donantes humanos sanos Buffy se obtuvieron de la Transfusión de Sangre del Centro Regional (Lille, Francia). Las muestras obtenidas de las capas leucocitarias se declaran como una colección Inserm (n ° DC2010-1209).
1. Material y Cultura Preparación de Medios
- Diluir 10 veces de tampón fosfato salino (PBS) en agua destilada estéril para obtener PBS 1x.
- Hacer RPMI 1640 suplementado con gentamicina (40 mg / ml) y L-glutamina (2 mM), con y sin 10% de suero humano agrupado.
2. Los cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos (MDM)
- Diluir buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Coloque con cuidado en un / tubo Leucosep Ficoll y se centrifuga a 1600 xg durante 20 min, a temperatura ambiente.
- Recoge los monocitos en la interfaz en un nuevo tubo. Lavar 3 veces con 10 ml de PBS 1X que contiene 0,1% etilendiaminotetraacéticoácido acético (EDTA) por centrifugaciones sucesivas a 1000 xg, 370 xg y 160 xg durante 10 min cada uno, y luego una vez en 1X PBS solo a 160 xg durante 10 min.
- Resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio RPMI-1640 sin suero y sembrar las células en placas de 35 mm a una densidad de 1 x 10 6 células por plato.
- Después de la sedimentación durante 90 min en la incubadora, descartar el sobrenadante que contiene las células no adherentes. Lavar las células adherentes, que consiste en monocitos, 3x con 1 ml de PBS; a continuación, añadir 1 ml de medio fresco que contiene 10% (v / v) de suero humano a las células previamente libres de suero.
- Después de 6 días de cultivo, para producir los macrófagos diferenciados alternativos (M2), añadir recombinante humano IL-4 (15 ng / ml) y mantener durante 6 días. A continuación, tratar macrófagos diferenciados con lipopolisacárido (100 ng / ml) en el día 12 durante 4 horas para obtener los macrófagos M1.
3. Extracción de M1 y M2 macrófagos Proteínas de electroforesis 2D
- Lave macrophedades tres veces con 25 mM Tris, pH 7,4, y desechos en tampón que contenía 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato (CHAPS), 2 M tiourea y 7 M urea.
- Lyse células utilizando un mezclador adecuado para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga durante 5 min en hielo y se almacena a -20 ° C.
- Determinar la concentración de proteína usando un reactivo de Bradford comercial. Almacenar 100 ml de alícuotas de las proteínas a -20 ° C hasta su uso.
4. isoelectroenfoque
NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de etiquetado en la oscuridad.
- Reducir 5 g de cada muestra (M1 y M2 macrófagos) ajustado a 9 l con tampón de lisis con 2 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C.
- Añadir cianina 3 (Cy3) para extraer M1 y el extracto de colorante reactivo sulfhidrilo M2 a una concentración de 0,8 de proteína / g nM. Añadir cianina 5 (Cy5) para M1 y M2 extrae a una concentración de 0,8 nM de proteína / g e incubardurante 30 min a 37 ° C.
- Detener la reacción con la adición de un volumen igual de tampón de muestra que contiene 7 M urea, 2 M tiourea, 4% de CHAPS, ditiotreitol 130 mM (DTT) y 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-etiquetados muestras M1 M2 con muestras marcadas con Cy5 en una mano y Cy3-etiquetados muestras M2 con muestras M1 etiquetados con Cy5 en otra parte.
- Rehidratar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) tira (240 mM, pH 3-10 gradiente lineal) con 450 l de muestras mezcladas marcadas en tampón que contenía 7 M urea, 2 M de tiourea y 4% de CHAPS en un sistema de células de enfoque isoeléctrico (IEF) durante 24 horas sin aplicar ninguna corriente.
- Realizar el enfoque a 300 voltios (V) durante 3 horas, y luego en un gradiente a 1000 V durante 6 horas, en un gradiente a 8000 V durante 3 horas y finalmente a 8000 V durante 3 horas.
5. segunda dimensión
NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de electroforesis en la oscuridad.
- Incubar las tiras IPG en tampón de equilibrio contienening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 30% (v / v) de glicerol durante 10 min.
- Transferencia de las tiras IPG equilibradas para la segunda dimensión (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) en 12,5% en geles de PAGE y sellar con bajo punto de fusión de agarosa.
- Llevar a cabo la electroforesis a 20 ° C utilizando un sistema Ettan-Daltsix a un voltaje constante de 70 V durante la noche seguido por 300 V hasta que el azul de bromofenol frontal alcanza la parte inferior del gel.
Análisis Adquisición y bioinformático 6. Imagen
- Geles de exploración emitidos entre las dos placas de vidrio de baja fluorescencia con un escáner DIGE Imager en longitudes de onda de excitación / emisión de 532/580 nm para Cy3 y 633/670 nm para Cy5 para producir imágenes con un tamaño de píxel de 100 micras.
- Realizar análisis de imágenes con software comercial como se detalla anteriormente 12.
- Calcular y normalizar los volúmenes puntuales en cada imagen. Asigne un volumen normalizado lugar como apoyoortion del valor total de cada mancha detectada en el gel.
- Analizar las diferencias de volúmenes disponibles para cada tipo de proteína de los macrófagos mediante la comparación del valor de volumen normalizado punto entre los dos grupos (M1 y M2). Tenga en cuenta la diferencia entre los volúmenes disponibles para ser significativo si el cambio es de 1,5 veces (p <0,05, de un solo sentido el análisis de ANOVA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para realizar el análisis proteómico diferencial apropiado, el procesamiento de las muestras para ser analizadas debe ser verificada.
En el ejemplo presentado, la calidad de cultivo celular de los macrófagos se requiere para los aspectos morfológicos y moleculares según lo publicado previamente 5. La diferenciación de los monocitos en macrófagos y la homogeneidad de la cultura fue seguido por microscopía de fase. Figura 1 mostró un ejemplo de cultivos primarios de macrófagos M1 y M2. Como se muestra, se verificó la homogeneidad de M1 (Figura 1A, B) y M2 (Figura 1C, D) subtipos de macrófagos en el día 12 de cultivo por microscopía de fase a baja (Figura 1A, c) y alto (Figura 1B, D ) de ampliación. Claramente, se observó una morfología distinta de los macrófagos M1 y M2 después de 12 días de cultivo primario. Como se publicó anteriormente, se verificó por RT-PCR la presencia de ARNm que codifica TNF y IL1B en macrófagos M1 y para MRC1 y CCL18 en macrófagos M2 14 (no mostrados).
Sólo culturas combinan esos criterios se utilizaron para el análisis proteómico.
Se determinó los patrones de proteínas en 2D de los dos subtipos de macrófagos, M1 (pro-inflamatoria) y M2 (anti-inflamatorio). Para ello, se extrajeron las proteínas de M1 y M2 macrófagos cultivados según se detalla en el protocolo y M1 y M2 macrófagos fueron etiquetados, ya sea con tintes de saturación Cy3 o Cy5 para analizar las proteínas por electroforesis 2D DIGE. La figura 2 presenta geles 2D representativas de M1 ( Figura 2A, B) y M2 (Figura 2C, D) los macrófagos de calidad suficiente para el análisis bioinformático. Se observó el mismo patrón de proteínas, ya sea para M1 o M2 independientemente de los colorantes de cianina Cy3 utilizados (Figura 2A, C) o Cy5 (Figura 2B, D). En este ejemplo, un gran p linealSe utilizó H gradiente (3-10) y para detallar las proteínas con un pl ácida o básica, gradiente de pH estrecho se puede utilizar.
Curiosamente, el análisis bioinformático del gel 2D reveló 20 áreas que contienen puntos que pueden ser analizados y comparados con el software 2D. La figura 3 es un ejemplo de gel 2D numerised en la que se encuentran las 20 áreas de manchas. El software 2D es capaz de cuantificar y comparar el volumen de cada punto entre varios geles de 2D a partir de diferentes muestras. El software se puede cuantificar el aumento o disminución de volumen al contado y esto puede ser visualizada por el color, como se indica en la figura 3. Las manchas se considera que tienen significativa expresión diferencial si el factor de cambio de volúmenes disponibles normalizados como se indica en el párrafo 6 de la sección de protocolo era superior a 1,5, con un valor de p <0,05. La presencia o ausencia de una proteína o polipéptido lugar entre los dos grupos de macrófagos pueden ser detectados por el software.
Figura 1: Las fotografías de microscopía de contraste de fases de cultivo primario de macrófagos Ejemplo de la morfología de la M1. (A, B) y M2 (C, D) los macrófagos. Macrófagos M1 se obtuvieron por tratamiento lipopolisacárido durante 4 horas a día 12. Los macrófagos M2 fueron obtenidos por IL-4 tratamiento a partir del día 6 hasta el día 12. microscopía de contraste de fases permite la identificación clara de los dos subtipos de macrófagos. Las fotografías en baja (10X) (A, C) y alta (40X) (B, C) de aumento se realizaron en el día 12 de la cultura. Barra de escala:. 50 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
eep-together.within-page = "always"> 
Figura 2:. Representante 2D DIGE gel de M1 y M2 macrófagos cultivados Proteínas (5 g) se marcaron con Cy3 o bien (A, B) o Cy5 (C, D) a partir de M1 (A, B) y M2 (C, D) macrófagos cultivados durante 12 días. El mismo patrón de gel de 2D para M1 o M2 macrófagos se obtuvo independientemente de la cianina marcado utilizado. Las posiciones de peso molecular (Mr) normas se indican a la izquierda, y la PI se indican en la parte inferior del gel. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
"/>
Figura 3:. El análisis bioinformático de un representante de gel DIGE 2D a partir de proteínas de macrófagos con software progénesis SameSpots se detectaron veinte áreas para realizar el análisis diferencial entre M1 y M2 macrófagos. La parte inferior de la figura indica el código de color para el factor de cambio de puntos de volumen. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El protocolo se describe en el presente documento detalla un método para analizar el impacto de diversos estímulos de los dos subtipos de macrófagos, M1 (pro-inflamatoria) y M2 (anti-inflamatorio). Los cultivos primarios de macrófagos M1 y M2 se obtuvieron de la diferenciación de los monocitos según lo publicado previamente 7.
El procedimiento de la electroforesis en gel 2D DIGE requiere materiales y equipos especializados, tales como células IEF para placas isoelectroenfoque, bajo fluorescencia para el SDS-PAGE con el fin de escanear dos veces el gel a la excitación / longitud de onda de emisión para Cy3 y Cy5, un escáner de fluorescencia y el software 2D. Este método requiere un poco de práctica y destreza manual.
Hay varios pasos críticos para el éxito de la electroforesis en gel 2D: 1) la extracción de las proteínas es crítico en un ambiente sin ningún tipo de contaminantes tales como albúmina o queratina, y 2) llevar a cabo el etiquetado y la electroforesis en la oscuridad. Evite eluso de TDT para la reducción de la proteína en el tampón de lisis como la técnica requiere el uso de TCEP para la reducción de enlaces de sulfuro de péptido en proteínas antes de etiquetar con cianina colorantes reactivos.
Esta técnica DIGE 2D sensible permite la evaluación de la expresión diferencial de manchas de proteínas por los macrófagos en diversas condiciones ambientales, en presencia o ausencia de proteínas dependiendo del subtipo.
Una de las limitaciones de esta técnica DIGE 2D es la necesidad de etiquetar las proteínas en el residuo de cisteína, que está ausente en el 14% de la proteína. La otra limitación es el relativamente pequeño número de muestras que se pueden analizar al mismo tipo en comparación con la tecnología de alto rendimiento como la espectrometría de masas cuantitativa, aunque DIGE 2D es menos costoso.
Estímulos microbianos, como LPS, así como citoquinas Th1, activan los macrófagos en un estado inflamatorio M1, mientras que las citoquinas Th2, tales como IL-4, polarize células a un fenotipo M2 con inmunorreguladora, reparación, y las funciones anti-inflamatorios 3. Fenotipificación M1 y M2 macrófagos cultivados con o sin la patogenicidad de acogida a través de enfoques proteómica proporcionarán una imagen más detallada del papel funcional complejo de los subtipos individuales. La electroforesis 2D DIGE puede ser útil para la identificación de polipéptidos / proteínas o modificaciones posteriores a la traducción de estas proteínas diferencialmente modificados en un subtipo o entre los dos subtipos de macrófagos en virtud de estímulos o entorno específico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
