Introduction
Makrofager är heterogena och plastceller som kan få olika funktionella fenotyper. In vivo, dessa celler svarar på ett stort antal mikromiljö signalssuch som mikrobiella produkter, cytokiner, etc. 1. In vitro, den pro-inflammatoriska fenotyp (M1) av makrofag kan induceras av lipopolysackarid (LPS) och den anti-inflammatoriska fenotypen (M2) av vissa cytokiner, såsom interleukin-4 (IL-4). Dessutom kan makrofager växla från en aktiverad M1 till M2 fenotyp, och omvänt, på specifika signaler 2.
Beroende på fenotypen, kommer makrofager har olika funktioner. M1 makrofager är celler som producerar proinflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor α (TNF-α), för att döda mikroorganismer eller tumörceller 3. Däremot M2 makrofager hindra dessa inflammatoriska svaret som i sårläkning och fibros genom att producera anti-inflammatory faktorer såsom TGF-β 3,4.
Humana perifera blodmononukleära celler från friska donatorer isolerades genom Ficoll-densitetsgradientcentrifugering såsom tidigare beskrivits 5 med användning av en teknik som anpassas från Boyum 6. Makrofager i kultur kan differentieras till M1 eller M2 fenotyp efter 6 dagars primär kultur 7.
Analys av proteinuttryck eller proteinförändringar mellan de två subtyper av makrofager under olika kontrollerade stimuli, till exempel värd patogenicitet eller mikrobiella toxiner, kommer att vara till hjälp för att dechiffrera funktionalitet pro- och antiinflammatoriska makrofager.
Proteomics är unika verktyg för direkt övervakning av proteiner som är specifikt upp- eller nedregleras i mänskliga odlade makrofager under olika stimuli. Fluorescerande färgämnen har löst vissa av de begränsningar av 2D-gelelektrofores, såsom låg känslighet och bildanalys 8 < / Sup>. De färgämnen som reagerar med cysteinrester har ökade detektionskänsligheten jämfört med de som reagerar med lysinrester 9. I en tidigare studie visade vi nyttan av Dige mättnadsmärkning för analys av knappa prover 10 jämfört med den klassiska silverfärgade 2D elektrofores 11. Denna teknik är till hjälp för snabb analys av proteinmodifieringar mellan de två subtyper av makrofager eller mellan obehandlade och behandlade makrofager från samma subtyp.
Fördelarna med denna proteomic teknik är att ha tillgång till den information om proteinstorlek och posttranslationella modifieringar genom att analysera 2D-gel 12. Det bör tas hänsyn till att detta inte är en hög genomströmning teknik, vilket begränsar det antal prov som kan analyseras. Utvecklingen av high throughput analyser baserade på masspektrometri som granskas nyligen 13 kan förbättra den här.
_content "> Här presenterar vi hur man utför 2D Dige analys från protein utvinning av odlade makrofager genom processerna för elektrofores, isoelectrofocusing och SDS-PAGE samt information om nyttan av adekvat 2D mjukvara.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i våra institutioner mänskligt forskningsetisk kommitté. Buffy coat från friska humana donatorer erhölls från Regional Blood Transfusion Center (Lille, Frankrike). Prov som erhållits från de gula hinnor deklareras som en Inserm samling (nr DC2010-1209).
1. Material och kultur Media Förberedelse
- Späd 10x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i sterilt destillerat vatten för erhållande av 1 x PBS.
- Gör RPMI 1640-medium kompletterat med gentamicin (40 | ig / ml) och L-glutamin (2 mM), med och utan 10% sammanslaget humant serum.
2. Primära Kulturer av monocythärledda Makrofager (MDM)
- Späd buffycoat (25 ml) med 1 x PBS. Noggrant läsa in på en Ficoll / leucosep rör och centrifugera vid 1600 xg under 20 min, vid rumstemperatur.
- Samla monocyter vid gränsytan till ett nytt rör. Tvätta 3x med 10 ml 1 x PBS innehållande 0,1% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) genom successiva centrifugeringar vid 1000 x g, 370 xg och 160 xg under 10 minuter vardera och sedan en gång i 1 x PBS enbart vid 160 xg under 10 min.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml RPMI-1640-medium utan serum och ympa cellerna i 35 mm skålar vid en densitet av 1 x 10 6 celler per skål.
- Efter sedimentering under 90 min i inkubatorn, kassera supernatanten innehållande de icke-adherenta celler. Tvätta de vidhäftande cellerna, som består av monocyter, 3x med 1 ml PBS; tillsätt sedan 1 ml färskt medium innehållande 10% (vol / vol) humanserum till de tidigare serumfria celler.
- Efter 6 dagars odling, för att ge alternativa differentierade makrofager (M2), tillsätt rekombinant humant IL-4 (15 ng / ml) och bibehålla för 6 dagar. Sedan, behandla differentierade makrofager med lipopolysackarid (100 ng / ml) på dag 12 för 4 timmar för att erhålla M1 makrofager.
3. Extraktion av M1 och M2 Macrophage Proteiner för 2D elektrofores
- Tvätta macrophåldrar tre gånger med 25 mM Tris, pH 7,4, och skrot i buffert innehållande 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-kolamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS), 2 M tiokarbamid och 7 M urea.
- Lyserar celler med användning av en bländare som lämpar sig för 1,5 ml mikrorör för 5 min i is och förvara vid -20 ° C.
- Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av ett kommersiellt Bradford reagens. Lagra 100 | il alikvoter av proteinerna vid -20 ° C fram till användning.
4. Isoelectrofocusing
OBS: Utför alla förfaranden märkning i mörkret.
- Minska 5 ^ g av varje prov (M1 och M2 makrofager) justerades till 9 il med lysbuffert med 2 mM Tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) för 1 h vid 37 ° C.
- Lägg cyanin 3 (Cy3) till M1 extrakt och M2 sulfhydryl-reaktiv färg extrakt vid en koncentration av 0,8 nM / ig protein. Lägg cyanin 5 (Cy5) till M1 och M2 extraherar vid en koncentration av 0,8 nM / ig protein och inkuberaunder 30 min vid 37 ° C.
- Stoppa reaktionen genom tillsats av en lika stor volym provbuffert innehållande 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) och 2% pharmalytes.
- Mix Cy3-märkt M1 prover med Cy5-märkta M2 prover i ena handen och Cy3-märkt M2 prover med Cy5-märkta M1 prover i en annan hand.
- Rehydrera en Immobiliserad pH-gradient (IPG) band (240 mm, pH 3-10 linjär gradient) med 450 pl märkta blandade prover i buffert innehållande 7 M urea, 2 M tiokarbamid och 4% CHAPS på en isoelektrisk fokusering (IEF) cellsystem under 24 h utan att tillämpa någon ström.
- Utför fokusera på 300 volt (V) i 3 timmar, och sedan vid en gradient till 1000 V i 6 timmar, vid en gradient till 8.000 V under 3 timmar och slutligen vid 8000 V under 3 timmar.
5. Andra dimensionens
OBS: Utför alla elektroforesförfaranden i mörkret.
- Inkubera IPG remsorna i jämviktsbuffert innehållaing 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (vikt / volym) natriumdodecylsulfat (SDS) och 30% (v / v) glycerol under 10 min.
- Överför de jämviktade IPG remsor för den andra dimensionen (SDS-polyakrylamid-gelelektrofores (PAGE)) på 12,5% PAGE-geler och täta med lågsmältande agaros.
- Utför elektrofores vid 20 ° C med användning av en Ettan-Daltsix systemet vid en konstant spänning på 70 V över natten följt av 300 V tills bromfenolblått front når botten av gelén.
6. Image Acquisition och Bioinformatic analys
- Skannings geler avgivna mellan de två låg-fluorescensglasplattor med en DIGE Imager scanner vid excitation / emissionsvåglängder av 532/580 nm för Cy3 och 633/670 nm för Cy5 för erhållande bilder med en pixelstorlek av 100 | im.
- Utföra bildanalys med kommersiella program som det beskrivits tidigare 12.
- Beräkna och normalisera spotvolymer i varje bild. Tilldela en normaliserad plats volym som en stöttaortion av det totala värdet av varje fläck detekteras i gelén.
- Analysera skillnaderna i proteinspotvolymer för varje typ av makrofager genom att jämföra den normaliserade fläck volymvärdet mellan de två grupperna (M1 och M2). Betrakta skillnaden mellan spotvolymer att vara betydande om förändringen är 1,5-faldigt (p <0,05, envägs-ANOVA-analys).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att utföra lämpliga särskilda proteomik analys, bör kontrolleras bearbetning av prover som ska analyseras.
I exemplet som presenteras, krävs cellodlingskvalitet av makrofager för morfologiska och molekylära aspekter som tidigare publicerats 5. Differentieringen av monocyter till makrofager och homogeniteten av odlingen följt av fas-mikroskopi. Figur 1 visade ett exempel på primära kulturer av M1 och M2 makrofager. Som framgår verifierade vi homogenitet M1 (Figur 1A, B) och M2 (Figur 1C, D) undertyper av makrofager vid dag 12 i kulturen genom fas-mikroskopi vid låg (Figur 1A, C) och hög (Figur 1B, D ) förstoring. Tydligt, observerade vi en distinkt morfologi av makrofager M1 och M2 efter 12 dagars primär kultur. Som tidigare publicerats, vi verifierat genom RT-PCR av närvaron av mRNA som kodar för TNF och IL1B i M1 makrofager och för MRC1 och CCL18 i M2 makrofager 14 (visas ej).
Endast kulturer som kombinerar dessa kriterier användes för proteomik analys.
Vi bestämde de 2D-proteinmönstren för de två undertyper av makrofager, M1 (pro-inflammatorisk) och M2 (antiinflammatorisk). För detta ändamål har vi extraherade proteiner från M1 och M2 odlade makrofager som beskrivs i protokollet och M1 och M2 makrofager antingen märkt med Cy3 eller Cy5 mättnads färgämnen för att analysera proteiner genom 2D Dige elektrofores. Figur 2 visar representativa 2D geler av M1 ( Figur 2A, B) och M2 (figur 2C, D) makrofager av tillräcklig kvalitet för bioinformatiska analyser. Samma mönster av proteiner observerades för antingen M1 eller M2 oberoende av cyaninfärgämnen används Cy3 (Figur 2A, C) eller Cy5 (Figur 2B, D). I detta exempel är en stor linjär pH-gradient användes (3-10) och för detailing proteiner med en sur eller basisk pl, kan smala pH-gradient kan användas.
Intressant, bioinformatikanalysen av 2D gel avslöjade 20 områden som innehåller fläckar som kan analyseras och jämföras med användning av 2D-mjukvaran, fig. 3 är ett exempel på numerised 2D-gel, i vilken de 20 områden av fläckar är belägna. 2D-programvaran kan kvantifiera och jämföra volymen för varje fläck mellan flera 2D geler från olika prover. Programvaran kan kvantifiera ökning eller minskning av spot volym och detta kan visualiseras genom färg som visas i figur 3. Spots anses ha betydande differentialuttryck om faldiga förändringen av normaliserade spotvolymer som anges i punkt 6 i protokoll sektion var större än 1,5 med ett p-värde <0,05. Närvaron eller frånvaron av ett protein eller polypeptid plats mellan de två grupperna av makrofager kan upptäckas av mjukvaran.
Figur 1: Fotografier av faskontrastmikroskopi av primär kultur av makrofager Exempel på morfologi M1. (A, B) och M2 (C, D) makrofager. M1 makrofager erhölls genom lipopolysackarid behandling under 4 timmar på dag 12. M2 makrofager erhölls genom IL-4 behandling med start från dag 6 till dag 12. faskontrastmikroskopi tillåter tydlig identifiering av de båda undertyper av makrofager. Fotografier på låg (10X) (A, C) och hög (40X) (B, D) förstoringen utfördes på dag 12 av kultur. Skala bar:. 50 pm klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
eep-together.within-page = "always"> 
Figur 2:. Representant 2D Dige gel av M1 och M2 odlade makrofager Proteiner (5 pg) märktes med antingen Cy3 (A, B) eller Cy5 (C, D) från M1 (A, B) och M2 (C, D) makrofager odlade i 12 dagar. Samma mönster av 2D gel för M1 och M2 makrofager erhölls oberoende av den märkta cyanin används. Positionerna för molekylvikt (Mr) standarder anges till vänster, och pl anges på botten av gelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
"/>
Figur 3:. Bioinformatisk analys av ett representativt 2D Dige gel från macrophage proteiner med Progenesis SameSpots programvara Tjugo områden upptäcktes att utföra differentialanalys mellan M1 och M2 makrofager. Den nedre delen av figuren visar färgkoden för den utfällbara förändring av volym fläckar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs häri detaljer en metod för att analysera effekterna av olika stimuli för de två subtyper av makrofager, M1 (pro-inflammatorisk) och M2 (antiinflammatoriskt). Primära kulturer av M1 och M2 makrofager erhölls från differentieringen av monocyter som tidigare publicerats 7.
Förfarandet i 2D Dige gelelektrofores kräver speciella material och utrustning, som IEF cell för isoelectrofocusing, låg fluorescens plattor för SDS-PAGE för att skanna dubbelt gelén vid excitation / emissionsvåglängd för Cy3 och Cy5, en scanner för fluorescens och 2D programvara. Denna metod kräver lite övning och fingerfärdighet.
Det finns flera viktiga steg för framgångsrik 2D gelelektrofores: 1) utvinning av proteiner är avgörande i en miljö utan föroreningar såsom albumin eller keratin, och 2) att utföra märkning och elektrofores i mörker. Undvikaanvändning av DTT för minskning protein i lysbuffert som tekniken som kräver användningen av TCEP för att reducera peptiden sulfid bindningar i proteiner före märkning med cyanin-reaktiva färgämnen.
Denna känsliga 2D DIGE teknik möjligt att bedöma om det differentiella uttrycket av proteinfläckar av makrofager under olika miljöbetingelser, i närvaro eller frånvaro av proteiner, beroende på subtyp.
En av begränsningarna med denna 2D DIGE teknik är att det är nödvändigt att märka proteinerna på cysteinresten, som är frånvarande i 14% av proteinet. Den andra begränsningen är det relativt lilla antalet prover som kan analyseras på samma typ i jämförelse med hög genomströmning teknik som kvantitativ masspektrometri, men 2D DIGE är billigare.
Mikrobiella stimuli, såsom LPS, liksom Th1-cytokiner, aktiverar makrofager in i en M1 inflammatoriskt tillstånd, medan Th2-cytokiner, såsom IL-4, sidolarize celler till en M2 fenotyp med immunreglerande, reparation och antiinflammatoriska funktioner 3. Fenotypning M1 och M2 odlade makrofager med eller utan värd patogenicitet genom proteomik metoder kommer att ge en mer detaljerad bild av den komplexa funktionella rollen för enskilda subtyper. 2D Dige elektrofores kan vara till hjälp för att identifiera polypeptider / proteiner eller post-translationella modifieringar av dessa proteiner differentiellt modifierade i en subtyp eller mellan de två subtyper av makrofager under specifika stimuli eller miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
