Introduction
Makrofajlar, ayırt edici fonksiyonel fenotipleri elde edebiliyoruz heterojen ve plastik hücrelerdir. İn vivo olarak, bu hücreler mikrobiyal ürünler, sitokinler, vb. 1 mikro çevre signalssuch büyük bir çeşitlilik yanıt. İn vitro, pro-enflamatuar fenotip (M + -1) makrofaj lipopolisakarit (LPS) ve interlökin-4 (IL-4) gibi sitokinler tarafından anti-iltihabik bir fenotipe (M2) tarafından indüklenebilir. Dahası, makrofajlar belirli sinyalleri 2 üzerine, tersine M2 fenotip bir aktive M1 geçiş yapabilirsiniz.
Fenotip bağlı olarak, makrofajlar farklı işlevlere sahip olacaktır. M1 makrofajlar mikroorganizmaları ve tümör hücrelerini öldürmeye 3, tümör nekroz faktörü α (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri üreten hücrelerdir. Buna karşılık, M2 makrofajlar anti-enflamasyon üreterek yara iyileşmesi ve fibrozis gibi bu enflamatuar yanıtı önlemekörneğin 3,4, TGF-β Y faktörler.
Daha önce Boyum 6 uyarlanan bir teknik kullanarak 5 tarif edilen sağlıklı donörlerden elde edilen insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri Ficoll yoğunluk farklı santrifüjü yoluyla izole edilmiştir. Kültür makrofajlar primer kültür 7 6 gün sonra M1 veya M2 fenotip ayırt edilebilir.
Protein ekspresyonu ya da ana bilgisayar patojenik veya mikrobik toksinler gibi çeşitli kontrollü uyaranlarla altında makrofajların iki alt tip arasında, protein değişikliklerin analizi, pro- ve anti-inflamatuar makrofaj özelliğe deşifre yararlı olacaktır.
Proteomiks özellikle yukarı veya çeşitli uyaranlara altında insan kültürlü makrofajlar aşağı-regüle olan proteinlerin doğrudan izlenmesi için benzersiz araçlardır. Floresan boyalar gibi düşük duyarlılık ve görüntü analizi 8 gibi 2D jel elektroforezi sınırlamaları, bazı çözdük < / Sup>. Sistein kalıntıları ile reaksiyona sokulması boyalar lizin kalıntıları 9 ile reaksiyona kıyasla tespit karşı artmış bir hassasiyet. Önceki bir çalışmada, klasik, gümüş-lekeli 2D elektroforez 11 kıyasla çok az örnekleri 10 analizinde DIGE doygunluk etiketleme yararını göstermiştir. Bu teknoloji hızlı bir makrofaj iki alt tip arasında veya aynı tipinin muamele edilmemiş ve edilmiş makrofajlar arası protein değişiklikleri analiz etmek yararlıdır.
Bu proteomik tekniğin avantajları, 2 boyutlu jel 12 analiz protein boyut ve post-translasyonel modifikasyonları bilgilere erişim sahip olanlardır. Bu analiz edilebilir numunelerin sayısının sınırlandırılması, bu yüksek verimli bir yöntem değildir dikkate alınmalıdır. Kütle spektrometresi dayalı yüksek verimli deneyler gelişimi gözden olarak son 13 bu artırabilirsiniz.
_content "> Burada elektroforez, izoelektro-odaklanma süreçleri yoluyla kültürlü makrofajlar protein çıkarılması 2D DIGE analizi gerçekleştirmek için nasıl sunmak ve yeterli 2D yazılım kullanışlılığı SDS-PAGE yanı sıra bilgi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokolü kurumların insan araştırma etik kurulunun yönergeleri takip eder. Sağlıklı insan donörlerden Buffy coat Bölge Kan Transfüzyon Merkezi (Lille, Fransa) elde edilmiştir. Buffy kat elde edilen Numune bir Inserm koleksiyon (n ° DC2010-1209) olarak ilan edilmiştir.
1. Malzeme ve Kültür Medya Hazırlık
- 1x PBS elde etmek için steril damıtılmış su içinde, 10X fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir.
- Ve% 10 toplanmış insan serumu olmadan gentamisin (40 ug / ml) ve L-glutamin (2 mM) ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı sağlayın.
Monosit türevli makrofajlar 2. Primer Kültürleri (MDM),
- 1x PBS ile buffycoat (25 mi) seyreltin. Dikkatlice oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 1600 x g'de Ficoll / leucosep tüp ve santrifüj yüklemek.
- Yeni bir tüp içine arayüzde monositleri toplayın. 10 ml ile yıkayın 3x PBS% 0.1 etılendiamıntetra içeren 1x1,000 xg, 370 x g ve 10 dakika her biri için 160 x g ve daha sonra bir kez 1 x PBS içinde tek başına 160 x g'de, 10 dakika boyunca arka arkaya santrifüjleme ile asetik asit (EDTA).
- Serumsuz 5 mi RPMI-1640 ortamı içinde hücre pelletini ve kap başına 1 x 10 6 hücre yoğunluğunda 35 mm'lik kaplara hücreleri tohum.
- Inkübatörde 90 dakika boyunca çökelme sonra yapışmayan hücreler ihtiva eden üst sıvıyı atmak. 1 ml PBS ile, monositlerin 3x oluşan yapışmış olan hücrelerin yıkayın; Daha sonra, daha önce serumsuz hücreler% 10 gliserol içeren taze ortam (h / h) insan serumunun 1 ml.
- 6 günlük bir kültürden sonra, alternatif farklı makrofajlar (M2) elde rekombinant insan IL-4 (15 ng / ml) ekleyin ve 6 gün için muhafaza etmek. Daha sonra, M1, makrofajlar elde etmek üzere 4 saat 12. günde lipopolisakarit (100 ng / ml) ile farklılaştırılmış makrofajlar tedavi.
2D Elektroforez için M1 ve M2 Makrofaj Proteinlerin 3. Ekstraksiyon
- Yıkama macrophyaşları 25 mM Tris, 30 mM Tris pH 8, 4,% 3 ihtiva eden tampon içinde pH 7,4 ve hurda ile üç kez - [(3-kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS), 2M tioüre ve 7 M üre.
- -20 ° C'de bir buz ve deposunda 5 dakika için 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine için müsait bir mikser kullanılarak Hücreleri.
- Ticari bir Bradford reaktifi kullanılarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Kullanılana kadar -20 ° C'de, proteinlerin 100 ul alikotları saklayın.
4. izoelektro-odaklanma
NOT: Karanlıkta bütün etiketleme prosedürleri uygulayın.
- 37 ° C'de 1 saat boyunca 2 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP); ihtiva eden liziz tamponu ile 9 ul ayarlandı her bir örnek (M1 ve M2 makrofajlar) 5 ug azaltır.
- 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda M1 özü ve M2 sülfidril-reaktif boya ekstreye siyanin 3 (Cy3) ekleyin. M1 siyanin 5 (Cy5) ilave et ve M2 0.8 nM / ug protein konsantrasyonunda alır ve inkübe37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı.
- 7 M üre, 2 M tioüre, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitol (DTT) ve% 2 pharmalytes ihtiva eden numune tampon maddesinin eşit hacmi eklenerek reaksiyonu durdurun.
- Mix bir yandan Cy5 etiketli M2 örnekleri ile M1 örnekleri Cy3 etiketli ve başka bir el Cy5 etiketli M1 örnekleri ile M2 örnekleri Cy3 etiketli.
- Bir İmmobilize pH gradyanı Rehydrate (IPG) şerit (240 mm, pH 3-10 doğrusal gradyan) 7 M üre, bir İsoelektrik 2 M tiyoüre ve% 4 CHAPS odaklanarak içeren tamponda etiketli karışık örneklerin 450 ul (İEF) hücre sistemi herhangi bir akım uygulamadan 24 saat karıştırıldı.
- 3 saat ve 3 saat sonunda 8,000 V 8000 V bir gradyan ile, 6 saat süre ile 1000 V bir gradyan daha sonra da 3 saat boyunca 300 volt (V) 'de odaklama yapın ve.
5. İkinci Boyut
NOT: Karanlıkta bütün elektroforez işlemleri gerçekleştirin.
- Dengeleme tamponunda IPG şeritler içeren inkübe10 dakika süre ile 0.1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M üre,% 2 sodyum dodesil sülfat (w / v) (SDS) ve% 30 (h / h) gliserol ing.
- % 12.5 PAGE jelleri üzerine, ikinci boyutta (SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)) için dengelenmiş IPG şerit aktarma ve agaroz, erime noktası düşük ile sağlanır.
- Bromofenol mavisi önü jelin dibine ulaşana kadar, gece boyunca 300 V ve ardından, 70 V sabit gerilimde, bir Ettan-Daltsix sistemi kullanılarak 20 ° C 'de elektroforez yapınız.
6. Görüntü Alma ve Biyoinformatik Analizi
- Cy5 100 um bir piksel boyutu ile görüntü elde etmek için Cy3 için 532/580 nm ve 633/670 nm uyarım / emisyon dalga boylarında, bir DIGE Görüntüleyici tarayıcı ile iki düşük floresan cam plakalar arasına dökülmektedir Tarama jeller.
- Daha önce 12 ayrıntılı olarak ticari yazılım ile görüntü analizi yapın.
- Hesaplayın ve her görüntüde spot hacimleri normale. Bir pervane gibi bir normalize nokta hacmi atamaHer nokta, toplam değerinin ortion jel saptanmıştır.
- Iki grup (M1 ve M2) arasındaki normalize nokta hacim değeri karşılaştırarak makrofajlar her tip protein nokta hacimlerindeki farklılıkları analiz. Değişim 1.5 kat (p <0.05, tek yönlü ANOVA analizi) ise anlamlı nokta hacimleri arasındaki farkı düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uygun diferansiyel proteomik analizi gerçekleştirmek için, analiz edilecek örneklerin işlenmesi doğrulanması gerekir.
Önce 5 yayınlanan sunulan örnekte, makrofaj hücre kültürü kalitesi, morfolojik ve moleküler özellikler için gereklidir. Makrofajlar monositlerin farklılaşması ve kültürün homojenliği faz mikroskobu ile takip edilmiştir. Şekil 1, M1 ve M2 makrofajların primer kültürlerinde bir örnek göstermiştir. Gösterildiği gibi, M1 (Şekil 1A, B) ve M2 (Şekil 1C, D) düşük seviyelerde faz mikroskobu ile kültürün 12. günde makrofajlann alt tipleri (Şekil 1A, C) ve yüksek (Şekil 1B, D homojenliğinin doğrulanmış ) büyütme. Açıkçası, primer kültür içinde 12 gün sonra, makrofaglar, M1 ve M2 ayrı bir morfoloji görülmektedir. Daha önce yayınlanmış olarak, RT-PCR ile, TNF ve IL1 kodlayan mRNA'nın varlığını doğrulanmışM2 MRC1 M1 makrofajlar ve B ve CCL18 14 makrofajlar (gösterilmemiştir).
Bu kriterleri birleştirerek sadece kültürler proteomik analizi için kullanılmıştır.
Biz, makrofajlar, M1 (pro-enflamatuar) ve M2 (anti-iltihap) olarak iki alt-tip 2 boyutlu protein örneğini belirlenmiştir. Protokolde ayrıntılı ve M1 ve M2 makrofajlar ya da 2D-DIGE elektroforez ile proteinleri analiz etmek için, Cy3 veya Cy5 doyma boyalarla işaretlenmiş gibi, bu amaç için, M1 ve M2 kültürlenmiş makrofajlardan proteinler ekstre edilmiştir. (2 M1 temsili 2D jelleri sunulur Şekil Şekil 2A, B), ve • M2 (Şekil 2C ve D) biyoinformatik analizi için yeterli bir kalitede makrofajlar. Proteinlerin Aynı model, M1 ve M2, bağımsız bir Cy3 kullanılan siyanin boyalarının (Şekil 2A, C) ve Cy5 (Şekil 2B, D) ya da gözlemlendi. Bu örnekte, büyük bir doğrusal sLH gradyanı kullanılmıştır (3-10) ve bir asidik ya da bazik plasmid'le proteinleri detay için dar bir pH gradyanı kullanılır.
İlginç bir şekilde, 2 boyutlu jel biyoinformatik analizi analiz ve 2B yazılımı kullanılarak karşılaştırılabilir noktalarını içeren 20 alanları açığa çıkardı. 3 lekelerin 20 alanları yer aldığı numerised 2B jel örneği Şekil. 2D yazılım ölçmek ve farklı örneklerden birkaç 2D jeller arasında her noktanın hacmini karşılaştırmak mümkün. Yazılım artış veya spot hacmi azalma ölçmek ve Şekil 3'te gösterildiği gibi bu renk ile görülebilir. Lekeler önemli diferansiyel ifade olduğu kabul edilen normalize nokta ciltlik kat değişiklik protokol bölümünün 6. paragrafında belirtildiği gibi eğer oldu p değerinin <0.05 ile 1.5 daha fazla. Makrofaj iki grup arasında bir protein ya da polipeptid nokta varlığı ya da yokluğu, yazılım tarafından tespit edilebilir.
Şekil 1: makrofajlar primer kültür faz-kontrast mikroskobu fotoğrafları, M1 morfolojisi örneği. (A, B), ve • M2 (C, D), makrofajlar üzerinde. M1, makrofajlar gün 12. Faz kontrast mikroskobu kadar günlük 6 başlayarak, IL-4 muamele ile elde edilmiştir gün 12 m2 makrofajlar, 4 saat süre ile lipopolisakarit işlenmesi suretiyle elde edilmiştir makrofajların Her iki alt tipin açık bir şekilde belirlenmesini sağlar. Düşük (10X) (A, C) ve yüksek (40X) (B, D) büyütme Fotoğraf kültür 12. günde yapıldı. Ölçek çubuğu:. 50 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
eep-together.within-page = "always"> 
Şekil 2:. M1 ve M2 kültürlenmiş makrofajların Örnek 2B DIGE jel proteinler (5 ug) ile etiketlenmiş iki Cy3 (A, B) M1 ya da Cy5 (C, D), (A, B), ve • M2 (C, D) makrofajlar 12 gün kültürlendi. M1 veya M2 makrofajlar için 2D jel Aynı durum, kullanılan etiketli cyanine bağımsız olarak elde edildi. Molekül ağırlığı pozisyonları (Bay) standartlarına solda gösterilir ve pl jelin alt gösterilir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
"/>
Şekil 3:. Progenesis SameSpots yazılımı ile makrofaj proteinlerden bir temsilci 2B DIGE jel Biyoinformatik analiz Yirmi alanları M1 ve M2 makrofajlar arasındaki diferansiyel analizi gerçekleştirmek için tespit edildi. Şeklin alt hacmi noktalar kat-değişim için renk kodunu gösterir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tarifnamede tarif edilen protokol makrofajlar, M1 (pro-enflamatuar) ve M2 (anti-iltihap) olarak iki alt-tip farklı uyaranların etkisini analiz etmek için bir yöntem göstermektedir. Daha önce 7 yayınlanan M1 ve M2 makrofajların birincil kültürleri monositlerin farklılaşması elde edilmiştir.
2D DIGE jel elektroforezi prosedür, Cy3 ve Cy5 floresans bir tarayıcı için uyarım / emisyon dalga iki kez jel tarama yapmak için SDS-PAGE için izoelektro-odaklanma, düşük floresan levhaları IEF hücresi gibi özel materyaller ve ekipman gerektirir ve 2D yazılım. Bu yöntem biraz pratik ve el becerisi gerektirir.
1) proteinlerin çıkarma albümin veya keratin gibi herhangi bir kirletici olmayan bir ortamda kritik olduğunu ve 2) karanlıkta etiketleme ve elektroforezi: Başarılı 2D jel elektroforezi için birkaç kritik adımlar vardır. Kaçınınteknik olarak liziz tamponu protein azaltılması için DTT kullanımı siyanin reaktif boyalar ile etiketleme önce proteinlerin peptit sülfit bağların indirgenmesine yönelik TCEP kullanılmasını gerektirir.
Bu, hassas 2B DIGE tekniği varlığında ya da alt tipine bağlı proteinlerin yokluğunda, farklı çevre koşulları altında makrofajlar protein lekelerinin farklı ifade değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.
Bu 2D DIGE teknik sınırlamaları bir protein% 14, mevcut değildir sistein kalıntısının, ilgili proteinleri etiketlemek için ihtiyaç vardır. 2D DIGE daha az maliyetli olmakla birlikte diğer sınırlaması, kantitatif kütle spektrometrisi gibi yüksek verimli teknoloji ile karşılaştırıldığında, aynı tip analiz edilebilir numunelerin nispeten küçük bir sayıdır.
LPS gibi, Th1 sitokin gibi Mikrobiyal uyaranlara, bir M1 enflamatuar duruma, IL-4, p ise, Th2 sitokinleri, makrofajları aktivebağışıklık düzenleme, tamir ve anti-iltihap fonksiyonları 3 M2 fenotipe hücreleri olarize. Veya proteomik yaklaşımlar yoluyla konak patojenisiteye olmadan Fenotiplendirme M1 ve M2 kültürlü makrofajlar bireysel alt tiplerinin karmaşık fonksiyonel rolünün daha ayrıntılı bir resim sağlayacaktır. 2D DIGE elektroforez polipeptitler / proteinler ya da farklı olarak, bir alt tipinde ya da belirli bir uyarı veya ortamında makrofajların iki alt tip arasında tadil edilmiş, bu proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonların tespit edilmesi için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamine-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamycin 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| human serum | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Filter 0.22 µm | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 ml cylinder | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 | |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | ||
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| Urée | Merk | 108484-500 | |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S.
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
