Protocol
Alle Verfahren und Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Illinois in Chicago genehmigt. Hier beschriebenen Experimente sind akute nicht-Überlebensversuchen, und es gab keine Verwendung von Augensalbe. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen nur auftritt, wenn chirurgische Instrumente mit 70% Ethanol in DiH 2 O gewaschen Opferung Ratten am Ende des Experiments erfolgte durch Überdosierung von IV Ketamin / Xylazin.
1. Vorbereitung der Instrumente und Chemikalien
- Bereiten Stammlösung von 0,05 M 5-HT-HCl in PBS. Dann verdünnt Lager mit PBS zu einer endgültigen 5-HT-Konzentration von 0,203 mM.
- Verdünne Dronabinol in Sesamöl in einer Konzentration von 20 ug / ul.
- Schneiden 20 cm Länge aus Polyethylen (PE) -50-Schlauch (0,58 mm ID, OD 0,965 mm). An einem Ende des Schlauches, schneiden eine Schräge Spitze mit einer Schere, und am anderen Ende Platz, legen Sie eine 23 g Nadel. Verbinden Sie diese 23 g Nadel in einen 1 mlSpritze und füllen Sie es mit 0,3 ml von 50 U / ml Heparin.
- Schneiden Sie vier Stücke von 4-0 geflochtenen Seidenfaden und zur Seite gesetzt.
- Sterilisieren chirurgischer Scheren, 2 gekrümmt Graefe Pinzette und 3 Mikroschellen mit 70% Ethanol in DIH 2 O.
2. Katheterisierung der Oberschenkelvene
Protokoll zur Katheterisierung von Jespersen et al modifiziert. 21
- Anesthetize eine Sprague-Dawley-Ratte mit intraperitoneale (IP) Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Drücken Sie den Fuß von der Ratte und beobachten jede Bewegung, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu bestätigen. Rasieren Sie die ventralen Seite des linken Oberschenkels und der ventralen Seite des Halses. Wenn von der lokalen Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Bedarf wenden Sie Augensalbe zur Trockenheit zu verhindern.
- Sichere Ratte in Rückenlage auf einer chirurgischen Bord. Verwenden chirurgische Schere in die linke Hinterschenkel wegschneiden Haut.
- Mit einer Pinzette, Verhalten stumpfen DISSECTIOn der oberflächlichen Muskeln, um die Vena femoralis freizulegen. Verwenden Sie die Pinzette, um die Vene aus der Oberschenkelarterie auf der Vena femoralis zu trennen, und legen Sie zwei Threads.
- Verwenden Sie die Pinzette gebogen Graefe Pull-up die Vene um den Blutfluss zu stoppen. Mit einem 22 G Injektionsnadel, Punktion der Vena femoralis und legen Sie die abgeschrägte Ende des PE-50-Schlauch in die Vene.
- Prüfen, ob das PE-Schlauch 50 vollständig durch Zurückziehen des Kolbens der Spritze eingesetzt wurde. Blut sollte gesehen in die PE-50-Schlauch werden. Binden Sie 2 Knoten um die Vene und PE-50-Schlauch mit den zwei Themen.
3. 5-HT-induzierte Apnoe durch IV-Infusion
- Legen Sie eine piezoelektrische Dehnungsmessstreifen auf der Ratte, um die Atmung zu messen.
- Ändern der Einstellungen für Verstärkung Ebene der elektronischen Verstärker über den Verstärker-Software auf dem Computer: zu verstärken (100x) und Bandpassfilter (1-10 Hz) die Atemsignale von der DMS erhalten, setzen Sie "Hochpassfilter" auf & #8220; AC @ 1 HZ "und" Tiefpassfilter "auf" 10 Hz ", und stellen Sie die Verstärkung durch die Eingabe von" 10 "für die" Initial Gain "und" 100 "für" Total Gain "..
- Ändern Sie die Einstellungen für die Abtastrate durch Öffnen "Analog Input" über-Recording-Software auf dem Computer. Zu digitalisieren (500 Hz Abtastrate) mit einem Analog-Digital-Wandler, "Probe" auf "1000 Hz" und "Überspringen" jeden zweiten Aufnahmepunkt von "1" (effektive Abtastrate 500 Hz), und nehmen Sie dann das Signal mit Recording-Software.
- Entfernen Sie die 1-ml-Spritze aus dem Katheter und legen Sie eine 500 ul Präzisionsglasspritze mit 0,203 mM 5-HT gefüllt in den Katheter.
- Legen Sie die 500 ul Präzisionsglasspritze in einer Infusionspumpe. Infundieren 12,5 ug / kg pro 350 ul / kg 5-HT-Lösung mit einer Rate von 63 ml / Std. Führen Sie mehrere Infusionen und beobachten Apnoe bei Ratte, was gesehen wird einsa in Atmung (≥ 2,5 s) in den aufgezeichneten Atemsignale auf dem Computermonitor anzuhalten.
- Bevor mit Hals-Chirurgie fortfahren, überwachen die Atmung Muster und überprüfen Sie die Schmerzreflex von der Zehe Prise bei der Ratte. Bei unregelmäßiger Atmung oder, wenn es eine Schmerzreflex von der Zehe Prise, zu verwalten IP Ketamin / Xylazin (100 mg / kg: 5 mg / kg) und dann erneut bestätigen eine angemessene Gabe von Betäubungsmitteln.
4. Hals-Chirurgie zu nodose Ganglia Expose
- Sichere Ratte in Rückenlage auf einer chirurgischen Bord. Machen Sie eine Mittellinie Längsschnitt mit chirurgische Schere am Hals.
- Mit stumpf auf dem Platysma (mit 2 Mikroklemmen, diese Muskel klar von der Operationsstelle zu halten), setzen die sternohyoideus und omohyoideus Muskeln. Trennen Sie die Muskeln um die innere Halsschlagader und einer ihrer Geschäftsstellen, die pterygopalatina Arterie freizulegen.
- Beachten Sie den Vagusnerv, wie es läuft entlang der A. carotis interna und dann entlang th e pterygopalatina Arterie. Beobachten Sie, wie die Vagusnerv und pterygopalatina Arterie, zusammen mit dem N. glossopharyngeus (Hirnnerven IX) und der N. accessorius (Hirnnerv XI), geben Sie die hintere zerrissen Foramen an der Basis des Schädels.
- Beachten Sie, dass das Ganglion nodosum als Schwellung der Vagusnerv rechts, bevor es die Hinter zerrissen Foramen tritt angezeigt. Beachten Sie auch, dass die Rachen- und Kehlkopfnervenäste kommen von den vorderen und hinteren Aspekte bzw. des Ganglion nodosum. 5
- Mit den Graefe Pinzette, trennen Sie den Vagusnerv von den Arterien, und legen Sie ein Stück Faden um den Vagusnerv. Legen Sie eine Klemme auf dem Thread, um leichte Spannung auf den Vagusnerv gelten, und reinigen Sie die Ganglion nodosum aller Bindegewebe auf weniger Widerstand bieten, wenn die Injektion.
- Wiederholen Sie die 5-HT-induzierte Apnoe, wie in Abschnitt 3 angegeben, um zu bestätigen, dass kein Schaden an den Ganglien nodosum getan.
- Füllen Sie eine 10 & mgr; gasPräzisionsGlasSpritze mit einem maßgeschneiderten 28 g Halbzoll-Spritzennadel mit einer 35 ° abgeschrägten Spitze mit 5 ul von Dronabinol in Sesamöl versehen.
- Legen Sie eine Mikroklemme am Faden leichter Spannung auf den Vagusnerv anwenden und durchbohren die Ganglion nodosum dabei nicht zu durchbohren. Drücken Sie den Spritzen langsam (≥ 60 sec), um den gesamten Inhalt der Spritze zu injizieren. Beachten Sie, dass einige der Spritzeninhalt wird aus dem Ganglion austreten.
- Wiederholen Sie die 5-HT-induzierte Apnoe, wie in Kapitel 3 angegeben.
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Representative Results
1 stellt Probenatmungsaufzeichnungs in Ratten, die Infusion von 5-HT-Apnoe vor und nach intranodose ganglia Injektionen von Dronabinol induziert hatte. 5-HT aktiviert 5-HT 3 -Rezeptoren auf der Knoten-Ganglien, die mit dem Bezold-Jarisch-Reflex Bradykardie, Hypotonie und Apnoe beitragen. 11,17-19 Intranodose ganglia Injektionen von Dronabinol aktivieren inhibitorische CB Rezeptoren oder allosterisch moduliert 5-HT 3 Rezeptoren, die die 5-HT-induzierte Anregung der Vagusnerv. 16,17,20,22 vor (Abbildung 1, oberes Feld) und nach zu hemmen (Abbildung 1, Mitte) Hals-Chirurgie Infusion von 5-HT (Bild 1 durch rote Linie angeklagt) löst eine Apnoe Reaktion als ein Mangel an Bauch Bewegung durch das piezoelektrische Dehnungsmessstreifen gemessen gesehen. Nach intranodose Ganglien Injektionen von Dronabinol (Abbildung 1, unteres Feld), habe IV 5-HT-Infusion nicht zu entlockeneine Apnoe Antwort. Nach Sesamöl-Injektionen (Daten nicht gezeigt) in nodose Ganglien des Fahrzeugkontrollratten, IV 5-HT Infusions löste eine Apnoe-Reaktion vergleichbar mit Basislinien. 17
Abb. 1: Beispiel-Aufnahmen von akuten 5-HT-indudced Apnoe Experimente vor und nach 100 ug Dronabinol in 5 ul Sesamöl Injektionen in den Ganglien nodosum der vagus 17 Atem Aufnahmen wurden vor der Operation (oben) aufgenommen, nach der Operation ( Mitte), und nach dem Ganglien nodosum Injektionen (unten). Rote Linie bedeutet IV 5-HT-Infusion zu einer Apnoe zu induzieren. Nach Sesamöl-Injektionen (Daten nicht gezeigt) in nodose Ganglien des Fahrzeugkontrollratten, IV 5-HT Infusions löste eine Apnoe-Reaktion vergleichbar mit Basislinien. 17 Diese Zahl hat sich von Calik et al geändert wurde. 17AU = willkürlichen Einheiten; RESP = Atemwege.
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Discussion
Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche Injektion von Neurochemikalien in den Ganglien nodosum sind: 1) die Identifizierung und Reinigung des Bindegewebes an der Ganglien nodosum; 2) Bestätigung der Integrität der nodose Ganglien vor Injektion; 3) und unter Verwendung einer kleinen Nadel, um fein zu injizieren, aber nicht vollständig durch Punktierung nodosum ganglia.
Der Vagusnerv innerviert viele Organe in den Hals und Bauch, und gibt wichtige Informationen wie Herzfrequenz, Blutdruck, bronchopulmonale Reizung, und Magen-Spannungsgefühl an das ZNS. Die Ganglien nodosum des Vagus enthalten eine Vielfalt von Rezeptoren für Aminosäuren, Monoamine, Neuropeptide und andere Neurochemikalien. 1 Intranodose Ganglien Injektionen von Neurochemikalien für jene Rezeptoren, um die Aktivität des Nervus vagus ändern vorher getan haben, wurden 16,17 und stellen ein hervorragendes Versuchsmodell zu Peripherie pharmacologi aufzuklärencal Auswirkungen auf den Vagusnerv, die Krankheiten wie Schlafapnoe, gastroösophageale Refluxkrankheit, chronischer Husten oder ändern kann. 2-4
Um die Ganglien nodosum ausgesetzt wird Hals-Chirurgie durchgeführt und Nackenmuskulatur werden getrennt, um die innere Halsschlag aussetzen. Die vagus gesehen entlang der A. carotis interna und der pterygopalatina Arterien läuft. Die Zellkörper der unipolaren vagus sind im nodose und Felsenganglien, die als Quellen der vagus vor dem Eintritt in den Schädel an den hinteren zerrissen Foramina gesehen befinden. 5
Manipulationen der nodose Ganglien sind insofern von Bedeutung, dass die Knoten-Ganglien und vagus nicht während der Operation beschädigt. Unsachgemäße und roh Operationstechnik können die Ganglien nodosum und seine Nervenäste, zusammen mit den Arterien und anderen Hirnnerven schädigen. In diesem Protokoll, um den Vagusnerv stabilisieren, bieten wir eine leichte Spannung auf die Vagus Nerven über Seidenfaden an einen Mikroclip befestigt. Dies ermöglicht uns, jeden Bindegewebe, machen es schwieriger, in das Ganglion nodosum injizieren könnte ausreichend zu reinigen. Außerdem bestätigen wir, dass die Knoten-Ganglien intakt, bevor mit der Injektion verläuft durch Induktion Apnoe durch 5-HT-Infusion sind. Um in das Ganglion nodosum injizieren, haben wir kostengünstige Kleinanzeige (28 G, OD 362 um) Nadeln zu einem KPG-Spritze befestigt. Da der Injektionsstelle Tiefe Stechen durch die Ganglien nodosum abwenden konnte ein Anliegen, die abgeschrägten Spitzen der Spritzen wurden Brauch mit einer vertikalen Winkel von 35 ° hergestellt. Dies unterscheidet sich von anderen Mikroinjektion Techniken, bei denen Glasmikropipetten verwendet werden 8-10,14-16 Der Vorteil der Glasmikropipetten ist eine kleinere Spitzendurchmesser. jedoch besteht die Gefahr des Brechens der Spitze während des Verfahrens aufgrund der Zerbrechlichkeit des Glases. Darüber hinaus ist eine teure Ausrüstung erforderlich, um die Glas-Mikropipette, die nicht jedes Labor besitzen können, ziehen. Maßgeschneiderte Nadeln haben keine Bruchgefahr, und obwohl sie von größerem Durchmesser (362 um) 17 im Vergleich zu Glasmikropipetten (20-100 ul) wurden 8,9,14-16 die Nadeln noch klein genug für nodose Ganglien Injektionen. Darüber hinaus waren diese Nadeln wiederverwendbare für viele Experimente und waren erheblich weniger Kosten als Anlagen, die zur Mikropipetten zu ziehen.
Aufgrund der Größe der benutzerdefinierten Adeln zur Injektion in nodose ganglia verwendet wird, ist es wichtig, zu Schaden zu beurteilen, wenn überhaupt, auf die Knoten-Ganglien. Eine Methode zur Bewertung der Beschädigung der nodose ganglia ist durch histologische Verarbeitung und Mikroskopie nodosum ganglia. 6-9,13,15 Eine zweite Methode, die in diesem Protokoll verwendet wird, um vagalen afferenten Funktion beurteilen vergleicht elektro oder Verhaltensergebnisse zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen Injektion. 14-17 Dronabinol Injektionen wurde gezeigt, dass 5-HT-induzierter Apnoe dämpfen Vergleich zu control Injektionen, 17 was bedeutet, dass, wenn es einige Schäden aus den größeren Durchmesser benutzerdefinierte Nadeln gab es noch genügend funktions nodose Ganglienzellen, die von Dronabinol gehemmt wurden. Ähnlich Quantifizieren des Ausmaßes der Diffusion des 5 ul Dronabinol in Öl ist nicht notwendig, da der funktionellen Fähigkeiten (dh Apnoe) waren die wichtige Metrik dieses Protokolls. Der in diesem Protokoll verwendete Volumen wurde gewählt, um die weite Verbreitung der in den Ganglien nodosum injizierten Lösung zu garantieren. In anderen ähnlichen Protokollen injizierten Volumina waren nicht übermßig unterschiedlich und lag im Bereich von 0,1 bis 3 & mgr; l. 8,9,14-16 Das Ausmaß der Diffusion von Dronabinol Öl ausreichend war, um 5-HT-induzierter Apnoe dämpfen. 17
Änderungen an diesem Protokoll sind möglich. Erstens, wenn die Schadensprävention an den Ganglien nodosum ist eine Notwendigkeit, kleinere Gauge-Nadeln (kleinste 33 G) kann in diesem Protokoll verwendet werden. Der Nachteil bei der Verwendung einer kleineren Gauge Nadeln ist: 1) sie leicht gebrochen oder verbogen werden; 2) sie den Innendurchmesser zu klein ist, um die Injektion von viskosen Flüssigkeiten wie Sesamöl ermöglichen. Außerdem, wenn Tiefen Website Injektion erforderlich ist, können mehrere vertikale Winkel Nadeln (bis zu 45 °) bezogen werden. Jedoch wird eine weitere Vertikalwinkel machen es schwieriger, die Knoten-Ganglien stechen. Beim Einspritzen des nodose Ganglien können modifiziert Spannung des Nervus vagus, indem Mikroschellen unterschiedlicher Größe verändert werden. Wenn eine Beschädigung des Nervus vagus / nodose Ganglien verhindert werden soll, dann mit kleineren Mikroklemmen ist ideal. Schließlich kann die Injektion von Flüssigkeiten, die Neurochemikalien über Volumen und die Konzentration der Flüssigkeit injiziert modifiziert werden. Bei diesem Protokoll war 5 & mgr; l mehr als genug, um die Knoten-Ganglien zu sättigen.
Eine Hauptbeschränkung dieses Protokolls ist die Möglichkeit des Durchstechens durch die Knoten-Ganglien. Wenn dies geschieht, dann erneut die Bestätigung der Integrität der nodose ganglia should erfolgen. Wenn die Integrität des nodose ganglia wird bestätigt, dann nodose ganglia Injektion kann wiederholt werden. Allerdings, wenn es Zweifel an der Integrität des nodose Ganglien, dann ein Experiment mit einem neuen Ratten abgeschlossen sein soll. 17
Die Vielfalt der Rezeptoren auf der Ganglien nodosum kann vermehrt oder gehemmt afferenten Nervenaktivität. Zunehmende Hinweise darauf, dass afferente nie Aktivität spielt eine wichtige Rolle in der menschlichen Krankheiten. 2-4,23 Dieses Protokoll stellt ein kostengünstiges Verfahren der lokalen Verwaltung von Neurochemikalien in die Ganglien nodosum, um ihre Auswirkungen auf die afferenten Nervenaktivität zu untersuchen.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde vom National Institutes of Health (Grants 1UM1HL112856) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
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