Protocol
Alle prosedyrer og protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Illinois i Chicago. Eksperimentene beskrevet her er akutt ikke-overlevelse eksperimenter, og det var ingen bruk av øyesalve. Opprettholdelse av sterile betingelser oppstår bare når kirurgiske instrumenter blir vasket med 70% etanol i DIH 2 O. Ofring av rottene ved slutten av forsøket funnet sted via overdose av IV ketamin / xylazin.
1. Klargjøring av instrumenter og kjemikalier
- Forbered stamløsning av 0,05 M av 5-HT-HCl i PBS. Deretter fortynnes lager med PBS til en endelig 5-HT-konsentrasjon på 0,203 mM.
- Fortynn dronabinol i sesamolje i en konsentrasjon på 20 pg / mL.
- Kutt 20 cm lengde av polyetylen (PE) -50 rør (ID 0,58 mm, utvendig diameter 0,965 mm). I den ene enden av slangen, kuttet en skråkant tips å bruke saks, og i den andre kvadratiske enden, sette inn en 23 g nål. Koble denne 23 g nål til en 1 mlsprøyte, og fylle den opp med 0,3 ml av 50 u / ml heparin.
- Skjær fire stykker av 4-0 flettet silketråd og satt til side.
- Sterilisere kirurgiske saks, to buede Græfe tang, og 3 mikroklemmer med 70% etanol i Dih 2 O.
2. Kateterisering av Femoral Vein
Protokoll for kateterisering er endret fra Jespersen et al. 21
- Bedøve en Sprague-Dawley rotte med intraperitoneal (IP) ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Knip tå av rotte og observere noen bevegelse for å bekrefte et riktig nivå av anestesi. Barbere ventrale del av venstre lår, og den ventrale del av halsen. Om nødvendig ved den lokale Institutional Animal Care og bruk komité, gjelder øyesalve for å hindre tørrhet.
- Sikker rotte i liggende stilling på et operasjonsbord. Bruk kirurgisk saks til å klippe bort huden på venstre hind lår.
- Bruk pinsett, oppførsel sløv dissection av den overfladiske muskel for å eksponere den femorale vene. Bruk pinsett for å skille venen fra lårarterie, og plassere to tråder rundt lårvenen.
- Bruk buede Græfe tang til å trekke opp venen for å stoppe blodtilførselen. Ved hjelp av en 22 G sprøyte nål, punktere lårvenen og deretter sette den skrå enden av PE-50 rør inn i venen.
- Sjekk om PE-50 rør ble satt riktig ved å trekke tilbake stempelet på sprøyten. Blod bør sees inn i PE-50 slange. Bind 2 knop rundt venen og PE-50 rør ved hjelp av to tråder.
3. 5-HT-indusert Apnea via IV Infusion
- Plasser en piezoelektrisk deformasjonsmåler rundt rotte å måle respirasjon.
- Endre innstillinger for forsterkingsnivået for elektronisk forsterker via forsterker programvare på datamaskinen: å forsterke (100x) og band-pass filter (1-10 Hz) åndedretts signaler innhentet fra deformasjonsmåleren, sette "highpas filter" på & #8220; AC @ 1 HZ "og" lavpassfilter "at" 10 Hz ", og sette forsterkningen ved å legge inn" 10 "for" Initial Gain "og" 100 "for" Total Gain "..
- Endre innstillinger for samplingsfrekvens ved å åpne "Analog inngang" via innspillingen programvare på datamaskinen. Å digitalisere (500 Hz samplingsfrekvens) ved hjelp av en analog-til-digital omformer, "sample" på "1000 Hz" og "hoppe over" alle andre opptakspunkt med "1" (effektiv samplingsfrekvens 500 Hz), og deretter ta opp signalet ved hjelp av innspillingen programvare.
- Ta ut en ml sprøyte fra kateteret og sette inn en 500 mL presisjon glass sprøyte fylt med 0,203 mM av 5-HT inn i kateteret.
- Plasser 500 mL presisjon glass sprøyte inn i en infusjonspumpe. Tilfører 12,5 ug / kg per 350 ul / kg av 5-HT-oppløsning ved en hastighet på 63 ml / time. Utføre flere infusjoner og observere apnea i rotte, som er sett ens en pause i å puste (≥ 2,5 sek) i de registrerte respiratoriske signaler på dataskjermen.
- Før du fortsetter med halskirurgi, overvåke pustemønster og sjekk for smerte refleks fra tå klype i rotte. Dersom åndedrettet er ujevnt, eller hvis det er en smerte refleks fra tå klype, administrere IP ketamin / xylazin (100 mg / kg: 5 mg / kg) og deretter bekrefte et riktig nivå av anestesi.
4. Neck Surgery til Expose Nodose ganglia
- Sikker rotte i liggende stilling på et operasjonsbord. Lag en midtlinjen langsgående kutt ved hjelp av kirurgiske saks i nakken.
- Ved hjelp av stump disseksjon på Platysma (ved hjelp av to mikroklemmer for å holde denne muskelen klar av den kirurgiske området), utsett sternohyoideus og omohyoideus muskler. Skille disse musklene til å eksponere arteria carotis interna og en av dens grener, den pterygopalatine arterie.
- Observere vagus nerve som det går langs arteria carotis interna og deretter langs th e pterygopalatine arterie. Observere hvordan vagus nerve og pterygopalatine arterie, sammen med glossopharyngeal nerve (hjernenerve IX) og rygg tilbehør nerve (hjernenerve XI), angir bakre flenget foramen ved foten av skallen.
- Legg merke til at nodose ganglion vises som en hevelse av vagus nerve rett før den kommer de bakre flenget foramen. Legg også merke til at de svelget og strupehodet nerve grener kommer av fremre og bakre aspekter, henholdsvis av nodose ganglion. 5
- Bruke Græfe tang, skille vagus nerve fra arteriene, og plassere et stykke tråd rundt nervus vagus. Plasser en klemme på tråden for å legge litt spenning på nervus vagus, og rengjør nodose ganglion av noen bindevev for å gi mindre motstand ved injisering.
- Gjenta 5-HT-indusert apnea som nevnt i § 3 for å bekrefte at ingen skade ble gjort til nodose ganglia.
- Fyll en 10 pl gasstett presisjon glass sprøyte festet med en skreddersydd 28 g halv-tommers sprøyte nål med en 35 ° skrå spiss med 5 mL av dronabinol i sesamolje.
- Plassere en mikro klemme på tråden for å legge litt spenning på nervus vagus, og punktere nodose ganglion tar seg ikke å punktere gjennom den. Tråkk sprøyten langsomt (≥ 60 sek) for å injisere alt innholdet i sprøyten. Vær oppmerksom på at noen av de sprøyte innholdet vil lekke ut av ganglion.
- Gjenta 5-HT-indusert apnea som nevnt i § 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerer prøven pusteopptak hos rotter som hadde infusjon av 5-HT for å indusere apnea før og etter intranodose ganglia injeksjoner av dronabinol. 5-HT aktiverer 5-HT3-reseptorer på nodose ganglia som bidrar til Bezold-Jarisch refleks av bradykardi, hypotensjon og søvnapné. 11,17-19 Intranodose ganglia injeksjoner av dronabinol aktivere hemmende CB-reseptorer, eller allosterisk modulere 5-HT- 3 reseptorer som hemmer 5-HT-indusert magnetisering av nervus vagus. 16,17,20,22 Før (Figur 1, topp panel) og etter (Figur 1, midt panel) halskirurgi infusjon av 5-HT (figur 1 , tiltalt av rød linje) utløser en apneic respons sett på som en mangel på magen bevegelse målt ved den piezoelektriske deformasjonsmåler. Etter intranodose ganglia injeksjoner av dronabinol (figur 1, nedre panel), gjorde IV 5-HT infusjon ikke framprovosereen apneic respons. Etter sesamolje injeksjoner (data ikke vist) inn i nodose ganglia kjøretøy kontrollrotter, IV 5-HT infusjon fremkalte en apneic respons sammenlignes med grunnlinjene. 17
Figur 1:. Eksempel på opptak fra akutt 5-HT-indudced apnea eksperimenter før og etter 100 mikrogram dronabinol i 5 mL sesamolje injeksjoner i nodose ganglia av vagus nervene 17 Respiratory opptakene ble tatt før operasjonen (øverste panel), etter operasjonen ( midtre panelet), og etter nodose ganglia injeksjoner (nederst panel). Rød linje betyr IV 5-HT infusjon å indusere apnea. Etter sesamolje injeksjoner (data ikke vist) inn i nodose ganglia kjøretøy kontrollrotter, IV 5-HT infusjon fremkalte en apneic respons sammenlignes med basislinjer. 17. Denne figuren har blitt forandret fra Calik et al. 17AU = vilkårlige enheter; SVARTID = luftveiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinn for vellykket injeksjon av neurochemicals inn i nodose ganglia er: 1) identifisere og rengjøring av bindevev av nodose ganglia; 2) bekrefter integriteten til nodose ganglia før injeksjon; 3) og ved hjelp av en tynn kanyle til delikat injisere inn i, men ikke helt punktering gjennom, nodose gangliene.
Vagus nerve innervates mange organer i nakke og buk, og videreformidler viktig informasjon som puls, blodtrykk, bronkopulmonær irritasjon, og mage oppblåst til CNS. Den nodose ganglia av nervus vagus inneholder et variert utvalg av reseptorer for aminosyrer, monoaminer, nevropeptider og andre nevrokjemiske. 1 Intranodose ganglia injeksjoner av neurochemicals for disse reseptorene for å endre effekten av vagus nerve har blitt gjort før, 16,17 og representerer en utmerket eksperimentell modell for å belyse perifer pharmacological effekter på nervus vagus som kan endre sykdommer som søvnapné, gastroøsofageal reflukssykdom, eller kronisk hoste. 2-4
Å avsløre nodose ganglia, er halskirurgi utført og musklene i nakken er skilt for å eksponere interne carotis. Vagus nervene er sett løpende langs interne carotis og pterygopalatine arteriene. Cellen kroppene til de unipolare vagus nervene ligger i nodose og petrosal ganglia, som blir sett på som en hevelse av vagus nervene før vi går i skallen på de bakre flenget foramens. 5
Manipulasjoner av den nodose ganglia er viktig i den grad at nodose ganglia og vagus nervene ikke er skadet under operasjonen. Feilaktig og råolje kirurgisk teknikk kan skade nodose ganglia og dets nerve grener, sammen med arterier og de andre hjernenerver. I denne protokollen, for å stabilisere nervus vagus, tilbyr vi en liten spenning til vagus nerve via silketråd festet til en mikroklemme. Dette gjør oss i stand til å tilstrekkelig rengjøre noen bindevev som kan gjøre det vanskeligere å injisere inn i nodose ganglion. Videre bekreftes det at nodose gangliene er intakt før du fortsetter med injeksjon ved å fremkalle apnea med 5-HT infusjon. Å injisere inn i nodose ganglion, brukte vi rimelig liten måler (28 G, OD 362 mikrometer) nåler festet til en presisjon glass sprøyte. Siden injeksjonsstedet dybde for å unngå punktering gjennom nodose ganglia var en bekymring, de skrå tips av sprøyter var tilpasset laget med en mer vertikal vinkel på 35 °. Dette skiller seg fra andre mikroinjeksjon teknikker hvor glass mikropipetter benyttes 8-10,14-16 Fordelen med glass mikropipetter er en mindre spiss diameter.; men det er fare for å bryte spissen under prosedyren på grunn av skjørhet av glass. Videre er kostbart utstyr som er nødvendig for å trekke glass mikropipette, som ikke alle kan ha lab. De skreddersydde nålene har ingen risiko for å bryte, og om de var av større diameter (362 mm) 17 sammenlignet med glass mikropipetter (20-100 mikroliter), 8,9,14-16 nålene var fortsatt liten nok for nodose ganglia injeksjoner. Dessuten, disse nålene var gjenbrukbar for mange eksperimenter og var betydelig mindre kostnader enn utstyr som brukes til å trekke mikropipetter.
På grunn av størrelsen av de tilpassede-nåler som brukes for injeksjon i nodose ganglia, er det viktig å vurdere skade, om noen, til den nodose ganglia. En fremgangsmåte for vurdering av skade på nodose ganglia er gjennom histologiske bearbeiding og mikroskopi av den nodose ganglia. 6-9,13,15 En annen metode, som anvendes i denne protokollen, for å vurdere vagal afferent funksjon er å sammenligne elektrofysiologiske og adferdsmessige resultater mellom eksperimentelle og kontrollgrupper injeksjon. 14-17 Dronabinol injeksjoner har vist seg å svekke 5-HT-indusert apnea sammenlignet med c-regulering injeksjoner, 17 tegn på at hvis det var noen skader fra de større diameter tilpassede nåler, var det fortsatt nok funksjonelle nodose ganglia celler som ble hemmet av dronabinol. Tilsvarende kvantifisere graden av diffusjon av 5 ul av dronabinol i olje er ikke nødvendig siden funksjonelle resultater (dvs. apnea) var det viktig beregning av denne protokoll. Volumet som brukes i denne protokoll ble valgt for å garantere bredt diffusjon av løsningen injisert inn i nodose ganglia. I andre lignende protokoller, injiserte volum var ikke overdrevent forskjellige og varierte 0,1 til 3 pl. 8,9,14-16 Graden av diffusjon av dronabinol av olje var tilstrekkelig til å svekke 5-HT-indusert apnea. 17
Modifikasjoner av denne protokollen er mulig. Først, hvis skader forebygging til nodose ganglia er en nødvendighet, mindre spor nåler (minste 33 G) kan brukes i denne protokollen. Ulempen med å bruke en mindre gauge nåler er: 1) de kan lett ødelagt eller bøyd; 2) de indre diameter er for liten til å tillate injeksjon av viskøse væsker som sesamolje. Videre, hvis dybde nettstedet injeksjon er viktig, flere vertikale vinkel nåler (opp til 45 °) kan kjøpes. Imidlertid vil en mer vertikal vinkel gjøre det vanskeligere å punktere nodose ganglia. Under injeksjon av nodose ganglia, kan modifisere spenningen i vagusnerven endres ved å plassere mikroklemmer av forskjellige størrelser. Ved skade på nervus nerver / nodose ganglia må forebygges, deretter bruke mindre mikro klemmer er ideelt. Til slutt, kan injeksjon av fluider inneholdende nevrokjemiske modifiseres via volum og konsentrasjonen av injisert fluid. I denne protokollen, 5 mL var mer enn nok til å mette nodose ganglia.
En vesentlig begrensning av denne protokoll er muligheten for å punktere gjennom nodose ganglia. Hvis dette skjer, så re-bekreftelse på integriteten til nodose ganglia should gjøres. Dersom integriteten til nodose ganglia er bekreftet, så nodose ganglia injeksjon kan gjentas. Men hvis det er tvil om integriteten til nodose ganglia, deretter et eksperiment med en ny rotte skal være fullført. 17
Mangfoldet av reseptorer på nodose ganglia kan øke eller hemme afferente nerveaktivitet. Økende bevis tyder på at afferent aldri aktivitet spiller en viktig rolle i sykdommer hos mennesker. 2-4,23 Denne protokollen gir en billig metode for lokal administrasjon av nevrokjemiske til nodose ganglia å undersøke deres effekt på afferente nerveaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J.
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G.
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
