Protocol
Todos los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Illinois en Chicago. Los experimentos descritos aquí son experimentos agudos sin supervivencia, y no hubo uso de pomada para los ojos. El mantenimiento de condiciones estériles sólo se produce cuando los instrumentos quirúrgicos se lavan con etanol al 70% en DiH 2 O. Sacrificio de ratas al final del experimento se produjo a través de sobredosis de IV ketamina / xilazina.
1. Preparación de los instrumentos y productos químicos
- Preparar solución madre de 0,05 M de 5-HT HCl en PBS. Luego diluir la acción con PBS a una concentración de 5-HT final del 0,203 mM.
- Diluir dronabinol en aceite de sésamo a una concentración de 20 g / l.
- Cortar 20 cm de longitud de polietileno (PE) -50 tubo (ID 0,58 mm, OD 0,965 mm). En un extremo del tubo, se corta una punta de bisel con unas tijeras, y en el otro extremo cuadrado, inserte un 23 g de la aguja. Conecte este 23 g de agujas a un 1 mljeringa, y llenarlo con 0,3 ml de 50 u / ml de heparina.
- Corte cuatro piezas de hilo de seda 4-0 trenzado y se puso a un lado.
- Esterilizar tijeras quirúrgicas, 2 pinzas Graefe curvos, y 3 pinzas micro con 70% de etanol en DIH 2 O.
2. La cateterización de la vena femoral
Protocolo para la cateterización se modifica desde Jespersen et al. 21
- Anestesiar una rata Sprague-Dawley con intraperitoneal (IP) de ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Pellizcar la punta de la rata y observar cualquier movimiento para confirmar un nivel apropiado de anestesia. Afeitar el aspecto ventral del muslo izquierdo, y el aspecto ventral del cuello. Si es necesario por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional local, aplicar pomada para los ojos para evitar la sequedad.
- Secure rata en una posición supina sobre una tabla quirúrgica. Utilice tijeras quirúrgicas para cortar la piel en el muslo posterior izquierdo.
- Con unas pinzas, conducta dissectio romon del músculo superficial para exponer la vena femoral. Utilice las pinzas para separar la vena de la arteria femoral, y coloque 2 hilos alrededor de la vena femoral.
- Utilice las pinzas Graefe curvos para pull-up de la vena para detener el flujo sanguíneo. El uso de un G aguja de la jeringa 22, pinchar la vena femoral y luego insertar el extremo biselado de la tubería de PE-50 en la vena.
- Compruebe si el tubo de PE-50 se inserta correctamente por la retracción del émbolo de la jeringa. La sangre debe ser visto entrar en el tubo de PE-50. Ate 2 nudos alrededor de la vena y PE-50 tubos utilizando los 2 hilos.
3. 5-HT inducida por la apnea vía IV Infusion
- Coloque un calibrador de tensión piezoeléctrico alrededor de la rata para medir la respiración.
- Cambiar la configuración de nivel de amplificación del amplificador electrónico a través de software de amplificador en el equipo: para amplificar (100x) y el filtro de paso de banda (1-10 Hz) las señales respiratorias obtenidas de la galga de tensión, ajuste "filtro highpas" en & #8220; AC @ 1 HZ "y" filtro de paso bajo "a" 10 Hz ", y establecer la amplificación mediante la introducción de" 10 "para la" ganancia inicial "y" 100 "por" Total Gain "..
- Cambiar la configuración de velocidad de muestreo mediante la apertura de "Entrada analógica" a través de un software de grabación en el equipo. Para digitalizar (500 Hz de frecuencia de muestreo), utilizando un convertidor de analógico a digital, "muestra" en "1000 Hz" y "saltar" todos los demás puntos de grabación por "1" (frecuencia de muestreo efectiva 500 Hz), y luego grabar la señal usando software de grabación.
- Retire la jeringa 1 ml del catéter e insertar una jeringa de vidrio de precisión 500 l lleno de 0,203 mM de 5-HT en el catéter.
- Coloque la 500 l jeringa de vidrio de precisión en una bomba de infusión. Infundir 12,5 mg / kg por 350 l / kg de solución de 5-HT a una velocidad de 63 ml / hr. Realizar múltiples infusiones y observar la apnea en ratas, que se ve unasa hacer una pausa en la respiración (≥ 2,5 seg) en las señales respiratorias registradas en el monitor de la computadora.
- Antes de proceder con la cirugía de cuello, monitorear el patrón respiratorio y compruebe si hay dolor reflejo del pellizco del dedo del pie en la rata. Si la respiración es irregular, o si hay un dolor reflejo del pellizco del dedo del pie, administrar IP ketamina / xilazina (100 mg / kg: 5 mg / kg) y luego vuelve a confirmar un nivel adecuado de anestesia.
4. Cuello Cirugía para exposicion nodose Ganglia
- Secure rata en una posición supina sobre una tabla quirúrgica. Haga un corte longitudinal de la línea media con unas tijeras quirúrgicas en el cuello.
- Utilizando disección roma en el músculo cutáneo del cuello (utilizando 2 abrazaderas micro mantener este músculo clara de la zona quirúrgica), exponer los músculos esternohioideo y omohyoideus. Separar estos músculos para exponer la arteria carótida interna y una de sus ramas, la arteria pterigopalatino.
- Observe el nervio vago, ya que corre a lo largo de la arteria carótida interna y luego a lo largo ª e arteria pterigopalatino. Observe cómo el nervio vago y la arteria pterigopalatino, junto con el nervio glosofaríngeo (IX nervio craneal) y el nervio espinal accesorio (XI par craneal), entran en el foramen lacerado posterior en la base del cráneo.
- Observe que el ganglio nudoso se muestra como una inflamación del nervio vago derecho antes de que entre el foramen lacerado posterior. Observe también que las ramas faríngeas y los nervios de la laringe salen las caras anterior y posterior, respectivamente, del ganglio nudoso. 5
- Usando las pinzas Graefe, separar el nervio vago de las arterias, y colocar un trozo de hilo alrededor del nervio vago. Coloque una abrazadera en el hilo para aplicar una ligera tensión sobre el nervio vago, y limpiar el ganglio nodoso de cualquier tejido conectivo para proporcionar menos resistencia al inyectar.
- Repita la apnea inducida por 5-HT como se indica en la sección 3 para confirmar que no hubo ningún daño a los ganglios nudosos.
- Llene una jeringa de vidrio de precisión impermeable al gas 10 l fijada con un 28 g de media pulgada aguja de la jeringa a la medida con un 35 ° biselados punta con 5 l de dronabinol en aceite de sésamo.
- Coloque una abrazadera micro en la rosca para aplicar una ligera tensión sobre el nervio vago, y perforar el ganglio teniendo cuidado de no perforar nodose a través de él. Presionar la jeringa lentamente (≥ 60 seg) para inyectar todo el contenido de la jeringa. Tenga en cuenta que algunos de los contenido de la jeringa se saldrá por el ganglio.
- Apnea Repita 5-HT inducida como se indica en la sección 3.
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Representative Results
La Figura 1 representa la grabación de respiración muestra en las ratas que tenían infusión de 5-HT para inducir apnea antes y después de las inyecciones de los ganglios intranodose de dronabinol. 5-HT activa 5-HT 3 receptores en los ganglios nodose que contribuyen al reflejo de Bezold-Jarisch de bradicardia, hipotensión y apnea. 11,17-19 inyecciones ganglios Intranodose de dronabinol activan los receptores CB inhibitorios, o modula alostéricamente 5-HT 3 receptores que inhiben la excitación inducida por 5-HT-del nervio vago. Antes de 16,17,20,22 (Figura 1, panel superior) y después (Figura 1, panel central) cirugía del cuello de infusión de 5-HT (Figura 1 , acusado por línea roja) produce una respuesta apneico visto como una falta de movimiento abdomen medido por el indicador de tensión piezoeléctrico. Después de las inyecciones de los ganglios intranodose de dronabinol (Figura 1, panel inferior), IV 5-HT infusión no provocóuna respuesta de apnea. Después de inyecciones de aceite de sésamo (datos no mostrados) en los ganglios nudosos de las ratas de control del vehículo, IV 5-HT infusión provocó una respuesta apneic comparable a las líneas de base. 17
Figura 1:. Grabaciones de muestra de experimentos apnea aguda 5-HT-indudced antes y después de 100 mg de dronabinol en 5 inyecciones de aceite de sésamo l en los ganglios nudosos de los nervios vagos 17 grabaciones respiratorios se tomaron antes de la cirugía (panel superior), después de la cirugía ( panel central), y después de las inyecciones de los ganglios nodose (panel inferior). Línea roja significa IV 5-HT infusión para inducir apnea. Después de inyecciones de aceite de sésamo (datos no mostrados) en los ganglios nudosos de las ratas de control del vehículo, IV 5-HT infusión provocó una respuesta apneico comparable a las líneas de base. 17 Esta cifra ha sido modificado desde Calik et al. 17UA = unidades arbitrarias; RESP = respiratorio.
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Discussion
Los pasos críticos para el éxito de la inyección de neuroquímicos en los ganglios nodose son: 1) la identificación y la limpieza del tejido conectivo de los ganglios nodose; 2) confirmar la integridad de los ganglios nodose antes de la inyección; 3) y usando una aguja de pequeño calibre para inyectar delicadamente en, pero no completamente a través de la perforación, los ganglios nudosos.
El nervio vago inerva muchos órganos en el cuello y el abdomen, y transmite información importante, como la frecuencia cardíaca, la presión arterial, irritación broncopulmonar y distensión gastrointestinal al SNC. Los ganglios nodosos del nervio vago contiene una serie diversa de receptores para aminoácidos, monoaminas, neuropéptidos y otras sustancias neuroquímicas. 1 Intranodose inyecciones de los ganglios de neuroquímicos para esos receptores para modificar la actividad del nervio vago se han hecho antes, 16,17 y representan un modelo experimental excelente para dilucidar pharmacologi periféricaefectos CAL en el nervio vago que puede modificar enfermedades como la apnea del sueño, enfermedad de reflujo gastroesofágico, o tos crónica. 4.2
Para exponer los ganglios nudosos, se lleva a cabo una cirugía de cuello y los músculos del cuello se separan para exponer la carótida interna. Los nervios vagos se ven corriendo a lo largo de la carótida interna y las arterias pterigopalatino. Los cuerpos celulares de los nervios vagos unipolares se encuentran en el nodose y ganglios petroso, que son vistos como una inflamación de los nervios vagos antes de entrar en el cráneo en los forámenes posteriores lacerado. 5
Las manipulaciones de los ganglios nodose son importantes en la medida en que los ganglios nudosos y nervios vagos no se dañen durante la cirugía. Técnica quirúrgica inadecuada y el crudo puede dañar los ganglios nudosos y sus ramas nerviosas, junto con las arterias y los otros nervios craneales. En este protocolo, para estabilizar el nervio vago, proporcionamos una ligera tensión al Vagus nervio a través de hilo de seda ata a un clip micro. Esto nos permite limpiar adecuadamente cualquier tejido conectivo que pueden hacer que sea más difícil de inyectar en el ganglio nudoso. Además, confirmamos que los ganglios nodose están intactas antes de proceder con la inyección mediante la inducción de la apnea por infusión de 5-HT. Para inyectar en el ganglio nodoso, se utilizó de calibre pequeño barato (28 G, OD 362 micras) agujas unidas a una jeringa de vidrio de precisión. Dado que la profundidad sitio de la inyección para evitar la perforación a través de los ganglios nodose era una preocupación, las puntas biseladas de las jeringas se hicieron a medida con un ángulo más vertical de 35 °. Esto difiere de otras técnicas de microinyección en las que se utilizan micropipetas de vidrio 8-10,14-16 La ventaja de micropipetas de vidrio es un diámetro de la punta más pequeño.; Sin embargo, existe el riesgo de romper la punta durante el procedimiento debido a la fragilidad del vidrio. Además, se necesita un equipo costoso para tirar de la micropipeta de vidrio, que no todos los laboratorios puede poseer. Las agujas de medida no tienen riesgo de romperse, y si fueran de mayor diámetro (362 micras) 17 en comparación con micropipetas de vidrio (20 a 100 mu l), 8,9,14-16 las agujas eran todavía lo suficientemente pequeño para ganglios nodose inyecciones. Por otra parte, estas agujas eran reutilizables para muchos experimentos y fueron considerables menos gastos que los equipos utilizados para tirar de micropipetas.
Debido al tamaño de las aduanas agujas utilizadas para la inyección en los ganglios nudosos, es importante para evaluar los daños, si los hay, a los ganglios nudosos. Uno de los métodos de evaluación de los daños a los ganglios nodose es a través del procesamiento histológico y la microscopía de los ganglios nudosos. 6-9,13,15 Un segundo método, que se utiliza en este protocolo, para evaluar la función aferente vagal es comparar los resultados electrofisiológicos y de comportamiento entre grupos experimentales y de control de inyección de inyecciones. 14-17 dronabinol se ha demostrado para atenuar inducida por 5-HT en comparación con apnea control inyecciones, 17 significando que si hubo algún daño de los más grandes agujas personalizados diámetro, todavía había suficientes células de los ganglios nodose funcionales que fueron inhibidas por dronabinol. Del mismo modo, cuantificar el grado de difusión de los 5 l de dronabinol en aceite no es necesario, ya que los resultados funcionales (es decir, apnea) eran la métrica importante de este protocolo. El volumen utilizado en este protocolo fue elegido para garantizar amplia difusión de la solución inyectada en los ganglios nudosos. En otros protocolos similares, inyectaron volúmenes no eran excesivamente diferente y osciló de 0,1 a 3 l. 8,9,14-16 El grado de difusión de dronabinol de aceite era suficiente para atenuar inducida por 5-HT apnea. 17
Se pueden hacer modificaciones a este protocolo. En primer lugar, si la prevención de daños a los ganglios nodose es una necesidad, agujas de calibre más pequeño (más pequeño 33 G) se puede utilizar en este protocolo. La desventaja de usar un gau menoragujas GE es: 1) que pueden ser fácilmente rotas o dobladas; 2) que el diámetro interior es demasiado pequeño para permitir la inyección de fluidos viscosos como el aceite de sésamo. Además, si el lugar de inyección profundidad es importante, más agujas ángulo vertical (hasta 45 °) se pueden comprar. Sin embargo, un ángulo más vertical hará que sea más difícil de perforar los ganglios nudosos. Durante la inyección de los ganglios nudosos, la modificación de la tensión del nervio vago se puede cambiar mediante la colocación de micro abrazaderas de distintos tamaños. Si necesita los daños en los nervios vagos / ganglios nodose que evitar, a continuación, utilizando pinzas micro pequeñas es ideal. Por último, la inyección de fluidos que contienen neuroquímicos se puede modificar a través de volumen y la concentración de fluido inyectado. En este protocolo, 5 l era más que suficiente para saturar los ganglios nudosos.
Una limitación importante de este protocolo es la posibilidad de perforar a través de los ganglios nudosos. Si esto ocurre, vuelva a la confirmación de la integridad del sho ganglios nodoseULD por hacer. Si se confirma la integridad de los ganglios nudosos, a continuación, la inyección de ganglios nodosos se puede repetir. Sin embargo, si hay dudas acerca de la integridad de los ganglios nudosos, a continuación, un experimento con una nueva rata debe ser completado. 17
La diversidad de receptores en los ganglios nodose puede aumentar o inhibir la actividad del nervio aferente. La evidencia creciente sugiere que la actividad aferente nunca juega un papel importante en enfermedades humanas. 2-4,23 Este protocolo proporciona un método barato de la administración local de neuroquímicos en los ganglios nodose para estudiar su efecto sobre la actividad del nervio aferente.
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Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
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