Protocol
Toutes les procédures et protocoles ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Illinois à Chicago. Les expériences décrites ici sont des expériences non-survie aigus, et il n'y avait pas d'utilisation de pommade oculaire. Le maintien de conditions stériles se produit uniquement lorsque les instruments chirurgicaux sont lavées avec 70% d'éthanol dans Dih 2 O. Sacrifice de rats à la fin de l'expérience a eu lieu par l'intermédiaire de surdose de kétamine IV / xylazine.
1. Préparation des instruments et des produits chimiques
- Préparer la solution d'achat d'actions de 0,05 M de 5-HT HCl dans du PBS. Ensuite diluer stocks avec du PBS à une concentration finale de 5-HT de 0,203 mM.
- Diluer dronabinol dans l'huile de sésame à une concentration de 20 ug / ul.
- Couper 20 cm de longueur de polyéthylène (PE) -50 tube (0,58 mm ID, OD 0,965 mm). À une extrémité du tube, couper une pointe conique avec des ciseaux, et à l'autre extrémité carrée, insérer une aiguille de 23 g. Connectez cette aiguille 23 g pour un 1 mlseringue, et le remplir avec 0,3 ml de 50 u / ml d'héparine.
- Coupez quatre morceaux de fil de soie 4-0 tressé et mettre sur le côté.
- Stériliser ciseaux chirurgicaux, deux forceps Graefe courbes, et trois micro pinces avec 70% d'éthanol dans diH 2 O.
2. cathétérisme de la veine fémorale
Protocole pour le cathétérisme est modifié à partir Jespersen et al. 21
- Anesthésier un rat Sprague-Dawley avec intraperitoneale (IP) de la kétamine / xylazine (100 mg / kg: 10 mg / kg). Pincez le bout du rat et d'observer tout mouvement de confirmer un niveau approprié de l'anesthésie. Raser la face ventrale de la cuisse gauche, et la face ventrale du cou. Si nécessaire par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnel local, appliquer une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse.
- Rat sécurisé en position couchée sur une planche chirurgicale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau de la cuisse arrière gauche.
- En utilisant des pinces, conduite dissectio émousséen du muscle superficiel pour exposer la veine fémorale. Utiliser la pince pour séparer la veine de l'artère fémorale, et placer deux fils autour de la veine fémorale.
- Utilisez la pince Graefe courbes de pull-up de la veine pour arrêter l'écoulement du sang. En utilisant une aiguille 22 G de la seringue, de percer la veine fémorale, puis insérez l'extrémité biseautée du tube PE-50 dans la veine.
- Vérifiez si le tuyau PE-50 a été inséré correctement en rétractant le piston de la seringue. Le sang doit être vu entrer dans le tube PE-50. Attachez deux noeuds autour de la veine et PE-50 tube en utilisant les deux fils.
3. 5-HT induite par l'apnée par perfusion IV
- Placer une jauge de contrainte piézo-électrique autour du rat pour mesurer la respiration.
- Modifier les paramètres pour le niveau de l'amplificateur électronique via logiciel de l'amplificateur sur l'ordinateur d'amplification: pour amplifier (100x) et le filtre passe-bande (1-10 Hz) les signaux respiratoires obtenus à partir de la jauge de contrainte, réglez "filtre highpas" au & #8220; AC @ 1 Hz "et" Filtre passe-bas "à" 10 Hz, "et régler l'amplification en entrant" 10 "pour le" Initial Gain "et" 100 "pour" Gain total "..
- Modifier les paramètres de taux d'échantillonnage en ouvrant "Entrée analogique" via le logiciel d'enregistrement sur l'ordinateur. Pour numériser (500 fréquence d'échantillonnage Hz) en utilisant un convertisseur analogique-numérique, "échantillon" à "1000 Hz" et "sauter" tous les autres points de "1" (vitesse d'échantillonnage effective 500 Hz) d'enregistrement, puis enregistrer le signal en utilisant le logiciel d'enregistrement.
- Retirer la seringue de 1 ml à partir du cathéter et insérer une seringue en verre de précision 500 pi rempli de 0,203 mM de 5-HT dans le cathéter.
- Placer la seringue 500 ul de verre de précision dans une pompe à perfusion. Infuser 12,5 ug / kg par 350 pl / kg de solution de 5-HT à un débit de 63 ml / h. Effectuez plusieurs perfusions et d'observer l'apnée chez le rat, qui est vu d'unSA pause respiratoire (≥ 2,5 sec) dans les signaux respiratoires enregistrées sur l'écran d'ordinateur.
- Avant de procéder à la chirurgie du cou, surveiller rythme respiratoire et vérifier réflexe de douleur de pincement de l'orteil chez le rat. Si la respiration est irrégulière, ou se il est un réflexe de la douleur de pincement de l'orteil, administrer IP kétamine / xylazine (100 mg / kg: 5 mg / kg) et puis re-confirmer un niveau approprié de l'anesthésie.
4. chirurgie cervico-faciale pour exposer noueux Ganglia
- Rat sécurisé en position couchée sur une planche chirurgicale. Faire une coupe longitudinale médiane à l'aide des ciseaux chirurgicaux au niveau du cou.
- Utilisation de dissection sur le muscle platysma (en utilisant deux pinces micro de garder ce muscle claire du site chirurgical), exposer les sternohyoideus et omohyoideus muscles. Séparer ces muscles pour exposer l'artère carotide interne et une de ses branches, l'artère ptérygopalatine.
- Observez le nerf vague car il longe l'artère carotide interne et puis le long de e e ptérygopalatine artère. Observez comment le nerf vague et l'artère ptérygopalatine, avec le nerf glossopharyngien (nerf crânien IX) et le nerf spinal accessoire (nerf crânien XI), entrent dans le foramen lacérées postérieures à la base du crâne.
- Notez que le ganglion noueux se affiche comme un gonflement du nerf vague droit avant qu'il ne pénètre dans les postérieures lacéré foramen. Notez également que les pharynx et du larynx nerveuses branches se détachent les aspects antérieures et postérieures, respectivement, du ganglion noueux. 5
- En utilisant les forceps Graefe, séparer le nerf vague dans les artères, et placez un morceau de fil autour du nerf vague. Placez une pince sur le fil d'appliquer une légère tension sur le nerf vague, et nettoyer le ganglion noueux de tout tissu conjonctif de fournir moins de résistance lors de l'injection.
- Répétez l'apnée 5-HT induite comme indiqué à la section 3 pour confirmer qu'aucun dommage a été fait pour les ganglions noueux.
- Remplir une précision étanche seringue en verre de 10 pi apposé avec un 28 g aiguille de seringue demi-pouce sur mesure avec 35 ° biseautées pointe avec 5 pi du dronabinol à l'huile de sésame.
- Placez un micro pince sur le fil d'appliquer une légère tension sur le nerf vague, et percer le noueux en prenant garde à ne pas percer ganglion à travers elle. Appuyer sur la seringue lentement (≥ 60 sec) pour injecter tout le contenu de la seringue. Notez que certains de contenu de la seringue se échappe du ganglion.
- Répétez l'apnée 5-HT induit comme indiqué dans l'article 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 représente un exemple d'enregistrement de la respiration chez les rats qui avaient perfusion de 5-HT pour induire une apnée avant et après les injections de ganglions intranodose de dronabinol. 5-HT active 5-HT3 sur les ganglions noueux qui contribuent à l'réflexe de Bezold-Jarisch de la bradycardie, l'hypotension et l'apnée. 11,17-19 injections de ganglions Intranodose de dronabinol activent les récepteurs CB inhibiteurs, ou module de manière allostérique 5-HT 3 récepteurs qui inhibent l'excitation 5-HT induite par le nerf vague. 16,17,20,22 Avant (Figure 1, panneau supérieur) et après (Figure 1, panneau central) du cou chirurgie perfusion de 5-HT (Figure 1 , inculpé par ligne rouge) provoque une réponse apnéique vu comme un manque de mouvement abdomen mesurée par la jauge de contrainte piézoélectrique. Après des injections de ganglions intranodose du dronabinol (Figure 1, panneau inférieur), IV perfusion de 5-HT n'a pas suscitéune réponse apnéique. Après injection d'huile de sésame (données non représentées) dans les ganglions noueux de rats de contrôle du véhicule, perfusion intraveineuse de 5-HT induit une réponse comparable à apnéique lignes de base 17.
Figure 1:. Enregistrements exemples d'expériences d'apnée aiguë 5-HT-indudced avant et après 100 ug dronabinol dans 5 pi sésame injections d'huile dans les ganglions noueux des nerfs vagues 17 enregistrements respiratoires ont été prises avant la chirurgie (en haut), après la chirurgie ( panneau du milieu), et après les injections de ganglions noueux (panneau inférieur). Ligne rouge signifie IV perfusion de 5-HT pour induire l'apnée. Après injections d'huile de sésame (données non présentées) dans les ganglions noueux de rats de contrôle du véhicule, IV perfusion de 5-HT induit une réponse apnéique comparable à des lignes de base. 17 Ce chiffre a été modifié depuis Calik et al. 17UA = unités arbitraires; REEE = respiratoire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les étapes essentielles pour l'injection de substances neurochimiques succès dans les ganglions noueux sont les suivants: 1) l'identification et le nettoyage du tissu conjonctif de la ganglions noueux; 2) confirmer l'intégrité des ganglions noueux avant injection; 3) et en utilisant une aiguille de calibre petite pour injecter délicatement dans, mais pas complètement piquant à travers, les ganglions noueux.
Le nerf vague innerve nombreux organes dans le cou et l'abdomen, et relaie des informations importantes telles que la fréquence cardiaque, la pression artérielle, irritation broncho-pulmonaire, et une distension gastro-intestinal pour le SNC. Les ganglions noueux du nerf vague contient un large éventail de récepteurs pour les acides aminés, les monoamines, les neuropeptides, et d'autres substances neurochimiques. 1 Intranodose ganglions injections de substances neurochimiques pour ces récepteurs de modifier l'activité du nerf vague ont été fait avant, 16,17 et représentent un excellent modèle expérimental pour élucider pharmacologi périphériqueeffets cal sur le nerf vague qui peut modifier des maladies telles que l'apnée du sommeil, la maladie de reflux gastro-oesophagien, ou la toux chronique. 2-4
Pour exposer les ganglions noueux, la chirurgie du cou est effectuée et les muscles du cou sont séparés pour exposer la carotide interne. Les nerfs vagues sont voyait courir le long de la carotide interne et les artères ptérygopalatine. Les corps cellulaires des nerfs vagues unipolaires sont situés dans le noueux et pétreux ganglions, qui sont considérés comme un gonflement des nerfs vagues avant d'entrer dans le crâne au postérieures lacéré foramens. 5
Manipulations des ganglions noueux sont importants dans la mesure que les ganglions noueux et nerfs vagues ne sont pas endommagés pendant la chirurgie. Une mauvaise technique chirurgicale et brut peut endommager les ganglions noueux et ses rameaux nerveux, avec les artères et les autres nerfs crâniens. Dans ce protocole, afin de stabiliser le nerf vague, nous fournissons une légère tension à l'vagus nerf via fil de soie attaché à un micro clip. Cela nous permet de bien nettoyer tout tissu conjonctif qui peut rendre plus difficile à injecter dans le ganglion noueux. Par ailleurs, nous confirmons que les ganglions noueux sont intactes avant de procéder à l'injection en induisant l'apnée en perfusion de 5-HT. Pour injecter dans le ganglion noueux, nous avons utilisé petit calibre peu coûteuse (28 G, OD 362 um) aiguilles attachées à une seringue de verre de précision. Depuis profondeur du site d'injection pour prévenir piquant à travers les ganglions noueux était un sujet de préoccupation, les conseils biseautés des seringues ont été fabriqués sur mesure avec un angle plus vertical de 35 °. Cela diffère des autres techniques de micro-injection dans lequel micropipettes de verre sont utilisés 8-10,14-16 L'avantage de micropipettes de verre est un diamètre de buse plus petite. cependant, il ya risque de rupture de la pointe lors de la procédure en raison de la fragilité du verre. En outre, un équipement coûteux est nécessaire pour tirer la micropipette de verre, qui ne peut posséder tous les laboratoires. Les aiguilles sur mesure ne ont pas de risque de rupture, et se ils étaient de diamètre plus grand (362 um) 17 par rapport à micropipettes de verre (20-100 pi), 8,9,14-16 les aiguilles étaient encore assez petit pour ganglions noueux injections. En outre, ces aiguilles sont réutilisables pour de nombreuses expériences et étaient moins dépenses considérables que l'équipement utilisé pour tirer micropipettes.
En raison de la taille des douanes aiguilles utilisées pour l'injection dans les ganglions noueux, il est important d'évaluer les dommages, le cas échéant, aux ganglions noueux. Une méthode d'évaluation des dommages aux ganglions noueux est grâce à la transformation et la microscopie histologique des ganglions noueux. 6-9,13,15 Une deuxième méthode, qui est utilisé dans ce protocole, pour évaluer la fonction afférente vagale compare les résultats électrophysiologiques ou comportementales entre On a montré que les groupes d'injection expérimentaux et de contrôle. de 14 à 17 injections de Dronabinol d'atténuer la 5-HT induit par l'apnée par rapport à contrôle injections, 17 signifiant que se il y avait des dommages de plus grand diamètre personnalisés aiguilles, il y avait encore suffisamment cellules des ganglions noueux fonctionnels qui ont été inhibées par dronabinol. De même, la quantification de la mesure de la diffusion de la 5 pi de dronabinol dans l'huile ne est pas nécessaire car les résultats fonctionnels (ce est à dire, l'apnée) étaient la métrique importante de ce protocole. Le volume utilisé dans ce protocole a été choisi pour garantir une large diffusion de la solution injectée dans les ganglions noueux. En d'autres protocoles similaires, les volumes injectés étaient pas trop différente et varie de 0,1 à 3 ul. 8,9,14-16 Le degré de diffusion de dronabinol d'huile était suffisante pour atténuer la 5-HT induit par l'apnée. 17
Les modifications apportées à ce protocole sont possibles. Premièrement, si la prévention des dommages aux ganglions noueux est une nécessité, aiguilles de calibre plus petit (plus petit de 33 G) peut être utilisé dans ce protocole. L'inconvénient de l'utilisation d'un plus petit gauaiguilles GE est: 1) ils peuvent être facilement brisés ou pliés; 2) ils le diamètre intérieur est trop petit pour permettre l'injection de fluides visqueux comme l'huile de sésame. En outre, si l'injection du site de profondeur est important, plusieurs aiguilles d'angle vertical (jusqu'à 45 °) peuvent être achetés. Cependant, un angle plus vertical, il sera plus difficile de percer les ganglions noueux. Lors de l'injection des ganglions noueux, en modifiant la tension du nerf vague peut être modifiée en plaçant micro pinces de différentes tailles. Si des dommages à l'nerfs vagues / ganglions noueux doit être empêché, puis en utilisant les petites pinces micro est idéal. Enfin, l'injection de fluides contenant des substances neurochimiques peut être modifiée par l'intermédiaire volume et la concentration de fluide injecté. Dans ce protocole, 5 pi était plus que suffisant pour saturer les ganglions noueux.
Une limitation importante de ce protocole est la possibilité de piquant à travers les ganglions noueux. Si cela se produit, puis re-confirmation de l'intégrité des ganglions noueux shoULD être fait. Si l'intégrité des ganglions noueux est confirmée, injection de ganglions noueux peut être répété. Cependant, se il ya doute sur l'intégrité des ganglions noueux, puis une expérience avec une nouvelle rat devrait être achevé. 17
La diversité des récepteurs sur les ganglions noueux peut augmenter ou inhiber l'activité du nerf afférent. En plus de preuves suggère que l'activité afférente ne joue un rôle important dans les maladies humaines. 2-4,23 Ce protocole fournit une méthode peu coûteuse de l'administration locale de substances neurochimiques aux ganglions noueux d'étudier leur effet sur l'activité du nerf afférent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par les Instituts nationaux de la santé (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
