This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Et stort problem med å implementere nyttige terapi for behandling av nervesystemet lidelser er i utviklingen av effektive metoder som hindrer ytterligere degenerasjon og også legge til rette for gjenvinning av funksjon. En innovativ strategi er genetisk å bygge stamceller ex vivo, for produksjon av nervecellene faktorer, før deres transplantasjon. Denne kombinasjonen av cellebasert terapi, kombinert med en type genterapi, tilveiebringer en effektiv metode for behandling av sykdom eller skade-indusert neuronal død i nervesystemet.
Neurotrofe faktorer er avgjørende for vekst og overlevelse av utviklings nevroner samt vedlikehold og plastisitet av modne nevroner. En rekke studier har vist betydelige roller neurotrofe faktorer i å fremme innledende vekst og differensiering av nevroner i det sentrale og perifere nervesystemet (CNS og PNS), og de kan også stimulere regenerering in vitro og i enNimal modeller av nerveskade en. Hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) blir høyt uttrykt i CNS, og spiller en viktig rolle i regulering av neural utvikling, synaptisk plastisitet og reparasjon 2. Glial cellelinje-avledet neurotrofisk faktor (GDNF) fremmer overlevelse av mange typer av nerveceller, inkludert dopaminerge og motorneurons 3. Således er en viktig strategi for nevral reparasjon for å gi eksogene kilder neurotrofiske faktorer til de skadede eller syke deler av nervesystemet.
Multipotent benmarg-avledede stamceller (MSC) holder et stort potensial for levering av terapeutiske proteiner for å behandle den skadede eller syke nervesystemet. Transplantasjon av MSC har vakt betydelig oppmerksomhet i arbeidet med å utvikle pasient kompatible cellebasert terapi, siden de har en rekke fordeler, inkludert, 1) relativ letthet av isolasjon og vedlikehold, 2) multipotential kapasitet, 3) lite etiske hensyn, 4) Evne til å overleve og migrere etter transplantasjon og 5) potensial for autolog transplantasjon 4,5. Lovende resultater er blitt rapportert ved bruk av naive og genetisk konstruerte MSC i dyremodeller for en rekke forskjellige nevrodegenerative tilstander, inkludert ryggmargsskader 6,7, hjerneslag 8,9, myelin-mangel 10, og retinal degenerasjon 11-13. Kobling celletransplantasjon med levering av neurotrofe faktorer fra genetisk modifiserte stamceller er en roman og viktig nevrale reparasjonsstrategi.
Et vesentlig skritt i utviklingen av cellebaserte terapeutiske faktor leveringssystemer er å bestemme normal helse av de modifiserte cellene. Som sådan, rektor Hensikten med denne studien var å evaluere generelle vekstparametre ved genmodifisert voksne stamceller. En viktig tilnærming for å vurdere raskt flere celleparametere er å ansette cellular bildebasert høy gjennom silingogg (HTS), ofte referert til som høyt innhold screening (HCS) prosedyrer 14. Denne teknologien gjør det mulig for automatisert bildeopptak og analyse og denne tilnærmingen er spesielt godt egnet for stamcelleforskningssøknader. I dette prosjektet har vi utviklet en profileringsplattform som gjør det mulig for den raske karakterisering og optimalisering av cellesubstrat preferanser og cellulære funksjoner med genmanipulerte adulte stamceller ansette en HCS system.
Voksen mesenchymale stamceller (MSC) er en attraktiv celletype for utvikling av en eksperimentell strategi kombinerer en cellulær og genavlevering basert terapi. MSC er multipotent, i stand til å differensiere i celler med mesodermal avstamning, og vise betydelig plastisitet, differensiere / transdifferentiating inn nevronale og gliaceller linjene med riktig induksjon paradigmer 17,18. Videre har MSC blitt transplantert og vist seg effektive i prekliniske studier for en rekke lidelser, inkludert tilstander nevrodegenerative 19. Den terapeutiske effekt av MSCer er velkjent på grunn av deres fordelaktige anti-proliferative, anti-inflammatorisk og anti-apoptotiske aktivitet 20. MSC er også kjent for å produsere og skille ut ulike neurotrofe og vekstfaktorer, som trolig bidrar til nervecellene kvaliteter forbundet med naive MSC etter transplantasjonen på områder av skade eller sykdom 21. Importantly kan MSCer bli genetisk modifisert for vedvarende levering av neurotrofiske faktorer for kombinerte cellulære og genterapi-baserte applikasjoner og er blitt anvendt i en rekke dyremodeller av skade eller sykdom i CNS 11,19,22.
I utviklingen av en kombinert celle og genterapi baserte strategien, er det viktig at helsen til cellene er nøye vurderes før deres omfattende anvendelse for in vitro, og spesielt in vivo-anvendelser. Som et bevis på konseptet, undersøkte vi flere bestander av konstruerte og kontroll MSC linjer for å studere konsekvensene av de genetiske modifikasjoner på celle helse og fitness ved hjelp av et høyt innhold screening (HCS) tilnærming. Generelt refererer HCS til cellulær bildebasert high throughput screening 14. Dette screening tilnærmingen tillater en kvantitativ vurdering av cellulære fenotyper på flere nivåer av romlig (celle til subcellulær) og tidsmessige (millisekunder til dager) resolution tvers av ulike eksperimentelle forhold. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi vist mulige forskjeller i underlaget preferanse på følgende parametre: celle spredning, uttrykk av grønt fluorescerende protein (GFP), celledød, og cellemotilitet / migrasjon. Forsøk ble utformet i 96-brønners cellekulturplate format. Innenfor en enkelt plate vi rutinemessig undersøkt mulige substrat relaterte forskjeller med hensyn til hver parameter for de ulike MSC populasjoner av lentivirale-transduced celler og sammenlignet de konstruerte MSC med den opprinnelige, ikke-transduserte MSC. Dette ga et middel til direkte sammenligne resultatene for de ulike MSC subtyper med et batteri av in vitro som celleproliferasjon bruker Ki67 immunolabeling, live / dead celleviabilitet analysen bruker propidiumjodidfarging, og celle atferd ved å utføre time-lapse digital bildebehandling . Som en forlengelse av dette HCS man kan også utføre ELISAer på klimaanlegg medie prøver samlet inn fra individ walen til kvantitativt bestemme sekresjon av neurotrofe faktorer. Kondisjonert media fra forskjellige MSC-undertyper kan også benyttes i in vitro bioanalyser for å bestemme biologisk aktivitet av utskilt faktorer 11,23. Denne type av HCS-plattformen kan også anvendes for in vitro-målinger av neurittutvekst fra primære nevronale kulturer og neurale stamcellelinjene 24. Samlet våre resultater viste at subpopulasjoner av de genmodifiserte MSC vises lignende atferd i forhold til de ikke-modifiserte MSC. Innflytelsen av forskjellige dyrkningsunderlag på cellevekst og cellevandring ble ikke dramatisk forskjellig mellom MSC-subtyper, så vel som kulturunderlag. Som sådan har de ekstracellulære matriks-substrater testet ikke synes å spille en kritisk rolle ved modulering av disse deler av cellen oppførsel for disse forskjellige konstruerte MSC.
Denne studien viser bruken av en HCS-system for å analysere different aspekter ved celle atferd. Imidlertid er det ikke uvanlig å støte på begrensninger som er forbundet med bildeanalyse. Noen ganger, mens analysere fluorescens bilder, var det litt vanskelig å finne den riktige terskelverdi over som immunolabeled eller fargede celler vil bli regnet som positivt merket / farget. Således, for å minimere subjektive forspenning, bestemmelse av terskelverdier var avhengig av en sammenligning med kontroller (negative kontroller for fluorescensavbildning ble utført parallelt under hele behandlingen ved utelatelse av de primære eller sekundære antistoffer). En annen begrensning ble påtruffet under analysen av celle migrasjon ved hjelp tids lapse digital bildebehandling. I noen tilfeller, bildebehandlingsprogrammer var ikke i stand til å skille mellom tilfeldig Brownske bevegelser av en celle versus en celle faktisk migrerer bare en svært kort avstand. Ytterligere begrensninger var tydelig i situasjoner der analyse programvare var ikke i stand til å skille tilstedeværelsen av multiple celler i umiddelbar nærhet til en annen. For å overvinne denne begrensningen som kreves manuell valget av celler i analysen i stedet for et fullt automatisert analyse. Cell plette tetthet kan også resultere i forvrenger celle migrasjon av data mellom populasjoner av celler som viser større preferanse til å vokse i klumper sammenlignet med celler som vokser i isolasjon fra hverandre. Disse typer av forskjellene er delvis sannsynlig en refleksjon av celle-substrat versus celle-celle preferanser.
Bruke en HCS system for å hente bilder og utføre dataanalyse gir en effektiv og rask måte å vurdere flere celleparametere. I tillegg ble time-lapse digitale videoer for 30 ulike forhold (6 underlag og fem forskjellige MSC subtyper) rutinemessig overtatt for perioder fra timer til dager (48 timer) mens du bruker miljøkammeret. Denne informasjonen ble senere brukt til å beregne og bestemme forskjeller i cellemigrasjonsrater på tvers av ulike cellelinjer på ulike ECMmolekyler.
I denne rapporten har vi fremhevet gjennomføringen av et høyt innhold screening plattform for å vurdere celle helse og funksjon. Denne type analyse er nyttige for å utvikle rasjonelle strategier for utforming av celletyper, så vel som polymere substrater for å lette rettet cellevekst og neural regenerering. Dette er et viktig skritt på veien mot bruk av stamcellebaserte levering av terapeutiske faktorer før omfattende in vivo prekliniske studier med celletransplantasjon strategier.
The authors have nothing to disclose.
Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).
96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1M PO4 buffer |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |