Introduction
Главная проблема с реализацией полезных терапии для лечения расстройств нервной системы в развитии эффективных методов, которые препятствуют дальнейшему перерождению, а также содействия восстановлению функции. Инновационная стратегия заключается в генной инженерии стволовых клеток экс естественных условиях, для производства нейропротекторных факторов, до их трансплантации. Такое сочетание клеточной терапии, в сочетании с типом генной терапии, обеспечивает мощный способ лечения заболевания или гибели нейронов, вызванной травмой в нервной системе.
Нейротрофических факторов необходимы для роста и выживания развивающихся нейронов, а также техническое обслуживание и пластичности зрелых нейронов. Ряд исследований показал значительное роли нейротрофических факторов в развитии начального роста и дифференцировки нейронов в центральной и периферической нервной системы (ЦНС и ПНС), и они могут также стимулировать регенерацию в пробирке и вNimal моделей нейронных травмы 1. Мозга нейротрофический фактор (BDNF) экспрессируется на высоком уровне в ЦНС, играет важную роль в регулировании развития нервной системы, синаптической пластичности и ремонт 2. Глиальной клеточной линии нейротрофического фактора (GDNF) способствует выживанию многих типов нейронов в том числе дофаминергических и двигательных нейронов 3. Таким образом, важной стратегией для нервной ремонта является предоставление экзогенные источники нейротрофических факторов потерпевшей или больных регионах нервной системы.
МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ костного мозга мезенхимальных стволовых клеток (МСК), обладают большим потенциалом для доставки терапевтических белков для лечения поврежденной или больной нервную систему. Трансплантация МСК привлекла значительное внимание в усилиях по развитию Совместим клеточной терапии, так как они имеют ряд преимуществ, включая, 1) относительная простота изоляции и техническое обслуживание, 2) комплексную природу мощности, 3) мало этические проблемы, 4) Способность к выживанию и миграции после трансплантации и 5) потенциал для аутотрансплантации 4,5. Перспективные результаты были получены с использованием наивных и генетически модифицированных МСК на животных моделях для ряда различных нейродегенеративных состояний, в том числе травмы спинного мозга 6,7, инсульта 8,9, дефицит миелина 10, и дегенерации сетчатки 11-13. Соединительная трансплантации стволовых клеток с доставкой нейротрофических факторов из генетически модифицированных стволовых клеток новыми и важно нейронная стратегия ремонт.
Существенным шагом в развитии систем терапевтический доставки фактор на клеточной основе, чтобы определить нормальное здоровье сконструированных клетках. Таким образом, основной целью данного исследования было оценить общие параметры роста генетически модифицированных стволовых клеток взрослых. Важным подходом быстро оценить несколько параметров клеток является использование сотового изображения на основе высокопрочных через screeninG (HTS), часто упоминается как высокопроизводительного скрининга содержание (HCS) процедур 14. Эта технология позволяет автоматизировать сбор и анализ изображения, и этот подход особенно хорошо подходит для исследований стволовых клеток приложений. В рамках этого проекта мы разработали профилирования платформу, которая позволяет быстро характеристики и оптимизации предпочтений клеточный субстрат и клеточных функций с помощью генной инженерии взрослые стволовые клетки использования системы HCS.
Protocol
1. Подготовка основания для 96-а
- Создать карту в 96-луночный планшет с изложением различных субстратов и типов клеток, которые будут рассмотрены (рисунок 1).
- Получение исходных растворов различных субстратов [поли-L-лизин, фибронектин, коллаген типа I, ламинин и энтактин-коллагена IV-ламинин (ECL)], 96-а многоямный пластины и подготовить рабочую станцию в стерильной культуре клеток капот.
- Подготовка отдельных подложек путем разбавления состава в стерильный фосфатный буферный солевой раствор (PBS) до конечной концентрации 5 мкг / мл (эта концентрация была ранее определена на основе подложки зависимости от концентрации анализе роста и пролиферации клеток). Смешайте с помощью вихря перед заливкой в стерильный резервуар.
- Добавить 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку в соответствии с 96-луночный карте (рисунок 1) (микропипетки 12 или 8-канальный удобно micropipetting в 96-луночный планшет). Закрыть крышку на 96-луночного планшета с использованием полосы парафильмом и хранить в течение ночи при 4 ° С.
2. Сотовый Покрытие и замедленной изображений
Примечание: Мышь МСК были выделены из костного мозга взрослых мышей C57BL / 6 и поддерживается в качестве клейкого клеточной линии. МСК были заражены с помощью лентивирусные векторы довели их выделять мозга нейротрофического фактора (BDNF; человек кДНК) и глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF; человек кДНК) с использованием лентивирусный вектора, кодирующего BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), и зеленый флуоресцентный белок (GFP, LV-GFP; CMV-GFP).
Примечание: культуральные среды для мыши мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является модифицированной среде Исков Дульбекко, содержащей 10% гибридомной квалифицированных фетальной бычьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10000 ед / мл пенициллина, 10 мг / мл стрептомицина , Пять различных типов МСК мышей (МСК, GFP-МСК, BDNF-GFP-МСК, GDNF-GFP-МСКС и BDNF / GDNF-GFP-МСК) высевали на 30% слияния в Т75 культуры клеток колбы.
- Сотовый Покрытие
- На следующий день снять подложки решения от стремления и промыть каждую лунку примерно с 200 мкл стерильной PBS, в два раза. Добавить культуры клеток (200 мкл / лунку) в каждую лунку, после окончательного PBS полоскания. Поместите 96-луночного планшета в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С и 5% СО 2 для уравновешивания.
- В то время как 96-луночный планшет уравновешивания в инкубаторе, сбора клеток (МСК в колбах Т75 должна быть примерно 70% сливной во время уборки / покрытия) путем сбора питательных сред (упоминается как кондиционированной среды) от T75 колбу и хранение в 15 мл коническую пробирку в стерильных условиях (это кондиционированную среду будут использованы на этапе 2.1.4 ниже).
- Добавить 8 мл стерильной PBS в колбу и осторожно встряхните, а затем отбирают пипеткой в PBS и добавить 1 мл 0,05% трипсина и 0,01%ЭДТА, чтобы отделить клетки от культуральной поверхности T75 колбу. Монитор открепления клеток путем просмотра колбу использованием инвертированного микроскопа, оснащенный фазового контраста оптики.
- Когда клетки были отключены, сразу же добавить 8 мл кондиционированной среды (собранной на этапе 2.1.2) в колбу. Собирают суспензию клеток и передачи в 15 мл коническую центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 4 мин при 450 мкг для осаждения клеток.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл свежей и нагревали (37 ° С) среда культуры клеток.
- Определить количество клеток в клеточной суспензии путем выполнения трипановым синим жизнеспособных клеток с помощью гемоцитометра. Пластина клеток при плотности примерно 300 клеток / лунку в соответствующие лунки 96-луночного планшета.
- Повторите эти действия для каждой популяции клеток.
- Покадровый изображений
- После того, как все МСК были покрыны, место96-луночный планшет в инкубаторе в течение 2 часов, чтобы позволить МСК прикрепить к подложке.
- Запустите систему HCS и ждать 2 часа для системы, чтобы уравновесить. Установите на окружающую контроллер до 37 ° C и подключите смешанный газовый баллон, содержащий 5% CO 2 в воздухе в ЖКХ системы экологического камеры подачи постоянного источника воздуха.
- Извлеките 96-луночного планшета из инкубатора после 2 ч периода уравновешивания и поместить непосредственно в камеру роста клеток системы HCS. Разрешить 30 мин для уравновешивания к ответственности за любой связанной с жарой расширения пластины, а затем начать сбор и анализ изображений программное обеспечение для настройки параметров пластины.
- Выберите цель 20X для работы с изображениями. Выберите два скважин в состояние [т.е., GFP-МСК на фибронектине и т.д. (6 субстраты х 5 MSC подтипы в общей сложности 30 условий х 2 Копировщиков = 60 скважин в общей сложности)] для настройки покадровой обработки. Выберите два места для работы с изображениями сВ каждую лунку.
- Выберите правильный свет с длиной волны для работы с изображениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: двух различных длинах волн (фазовый контраст и флуоресценции GFP) были отобраны для покадровой обработки изображений. - Сосредоточьтесь на дне скважины с использованием лазерного автофокус и сделать пробные снимки для нескольких сайтов и несколько скважин, чтобы найти оптимальное фокальной плоскости.
- После того, как в центре было установлено, начинают захвата изображений каждые 5 мин в течение 48 ч для всех скважин 60 (120 сайтов).
- Питания клеток каждые 24 ч, удаляя 96-луночного планшета из системы HCS. Удалить 75 мкл среды из каждой лунки и добавьте 100 мкл свежей среды в каждую лунку (в равновесие этой свежей среде при температуре 37 ° С и 5% CO 2).
- В конце эксперимента покадровой, удалить 96-луночного планшета из системы HCS. В стерильных условиях, собирать обусловленные образцы массовой информации из каждой лунки и передать эти образцы в другой 96-луночного планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы могут быть использованы для дальнейших Analysявляется выполнение ELISA для нейротрофических факторов. - Подготовка 96-луночный планшет с культивируемых МСК для дополнительных анализов, таких как пролиферации клеток Ki67 анализа или пропидийиодидом живой / мертвой окрашивания анализа (см подробности ниже).
- Выполнить анализ покадровой обработки изображений для отслеживания миграции / клеток клеток, как описано в разделе 5 ниже.
3. Ki67 клеточной пролиферации и пропидийиодидом Live / Dead Анализ
- Ki67 клеточной пролиферации анализ (Иммуноцитохимия)
- Промыть клеточных культур с 0,1 М фосфата (PO 4) буфер для одной минуты два раза. Закрепить культуру с 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре. Снимите PFA и промыть лунки PBS в течение семи минут три раза.
- После окончательной промывки, добавляют 100 мкл раствора блокатора (фосфатно-буферном солевом растворе, 5% нормальной сыворотки осла, 0,4% бычьего сывороточного альбумина и 0,2% Тритон Х-100) в каждую лункуго инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Подготовка первичных антител, анти-кролик Ki67, путем разбавления раствора в блокатора в рабочем соотношении 1: 200.
- Удалить блокатор решение и применить 100 мкл раствора первичных антител в каждую лунку. Накройте 96-луночного планшета и инкубировать образцов при 4 ° С в течение ночи.
- На следующий день, удалить раствор антител и промыть ЗФР в течение 7 мин, 3 раза.
- Подготовка вторичного антитела, осла против кролика Су3 в блокирующем растворе при рабочей соотношении 1: 500. Добавить DAPI окрашивающим ядра в растворе вторичного антитела в разведении 1: 100. После удаления последнего полоскания PBS, применяются 100 мкл вторичного антитела / DAPI раствора в каждую лунку. Инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 90 мин.
- Удалить вторичного антитела / DAPI решение и промыть каждую лунку с PBS в течение 7 минут, 3 раза. Накройте 96-луночного планшета и хранить при 4 ° С до визуализации.
- PropiDium йодид Live / Dead Анализ
- Измерение гибель клеток путем пропидий йодида (PI) анализа исключения, как описано ниже.
- Подготовка пропидийиодидом пятен раствора при концентрации 1,5 мкМ в культуральную среду.
- Добавить 100 мкл 70% этанола, чтобы один яме МСК в течение 2 мин с целью убить эти клетки. Это также служит в качестве положительного контроля для PI окрашивания. Большинство МСК будет PI-окрашенных с указанием гибели клеток. Удалить этанольного раствора.
- Добавить 100 мкл раствора пропидийиодидом пятна в каждую лунку и инкубируют в течение 20 мин при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе.
- Промыть клетки с 0,1 М фосфатного буфера в течение 1 мин, два раза. Зафиксировать клетки с 4% PFA в 0,1 М P0 4 буфере в течение 20 мин при комнатной температуре. Снимите PFA и промыть PBS три раза в течение 7 мин.
- Инкубируйте раствором DAPI (1:50), разведенного в блокатора раствора в течение 1 ч при комнатной температуре. Тщательно промойте все лунки сPBS в течение 7 минут, 3 раза.
- Удалить раствор DAPI и промыть каждую лунку с PBS в течение 7 минут, 3 раза. Накройте 96-луночного планшета и хранить при 4 ° С до визуализации.
Анализ 4. Автоматизированная изображений и многоволновой Скоринг
- Загрузите 96-луночного планшета (ранее обработаны для Ki67 иммунноокрашивания или пропидийиодидом-окрашенный) в системе ЖКХ и позволяют пластины для уравновешивания в течение 20 мин Откройте сбора и анализа системы образов программного обеспечения HCS.
- Выберите режим приобретения для целей 10X, используя камеру биннинговые на 1 и параметр усиления 2. Найдите Z-плоскости, в которой клетки находятся, используя функцию Auto Exposure и рассчитать смещение для каждой длины волны интереса. Для этого анализа, захват изображения для DAPI (W1), Cy3 (W2), и FITC (W3). Выберите максимальный уровень интенсивности, при которой негативные контрольные лунки не показывают сигнал для получения изображения. Подтвердите настройку подходит для позтельных скважин.
- Приобретать пластину. Захват изображений и хранить их в приобретении изображений и анализа базы данных программного обеспечения.
- Как только изображения были приобретены, открытый образ сбор и анализ форума программного обеспечения и просмотр пластин данные из изображений, полученных выше.
- Выберите анализ забил Multi-длины волны. Настройка минимальной и максимальной интенсивности для каждой длины волны.
ПРИМЕЧАНИЕ: обнаружение DAPI должен отметить окрашивание вокруг каждого видимого ядра. Cy3 должен обнаружить позитивные клетки с Ki67 иммунореактивности (ИК) и не должны обнаружить ИК под отрицательных контролей. Для Cy3 Ki67 ИК, приблизительная минимальная ширина составляет 7 мкм, приблизительная максимальная ширина составляла 30 мкм, интенсивность выше локального фоне было 150 уровней серого, и минимальная окрашивали размер 50 мкм 2. - Запустите анализ всех позиций. Экспорт данных для просмотра в таблице.
Отслеживание 5. Сотовый
- Открыть acquisitio изображенияп и программа анализа и нажмите на кнопку "Обзор Табличка с техническими данными [DB] ...», выбрав тарелку интерес.
- Просмотреть данные как "Время против хорошо."
- Выберите один из сайтов из раздела "Сайты" левой кнопкой мыши на нужной отбора. Выберите "Передано ..." под "длин волн:". Щелкните правой кнопкой мыши на цели и в шаблоне 96-луночного планшета и нажмите на кнопку "Загружать изображения".
- Отслеживать клетки, нажав на кнопку "Apps" и затем "Объекты пути".
- Используйте "динамического обмена данными (DDE)", чтобы выбрать формат для экспорта данных, например, Microsoft Excel.
- Выберите отслеживания данных по экспорту, например, истекшее время, номер объекта, расстояния, интервала времени, скорости, абсолютного угла, расстояния до происхождения, DELTA X и дельта у.
- Пометить каждую ячейку интересов с "ключом Ctrl + левый клик" на клетках-мишенях.
- Трек клетки, Если необходимо, остановите / изменить Неправильное перемещение клеток с помощью клавиши "Esc", а затем настроить параметры.
- После отслеживания клетка будет завершено, сохраните данные с "регистрационных данных".
Representative Results
Параметры роста MSC были рассмотрены культивирования различных популяций МСК на различных подложках. Пять различных популяций MSC подтипов (МСК, GFP-МСК, BDNF-GFP-МСК, GDNF-GFP-МСК, и BDNF / GDNF-GFP-МСК) высевали в 96-луночные культуральные ткани пластин, предварительно покрытых с разными субстраты, как показано на фиг.1. После четырех дней культивирования, планшеты фиксировали и immunolabeled и / или окрашивали с помощью соответствующих реагентов, а затем исследовали с использованием системы HCS и анализов, проводимых с захвата изображений и анализа программного обеспечения.
Рисунок 1:. Шаблон 96-луночный планшет для эксперимента 96-луночные планшеты покрывали различных субстратов и скважин высевали с конструированными стволовых клеток, как показано на шаблоне. В качестве примера, только вэйLs в строках BF были использованы в этом эксперименте. Строки, G и H были оставлены пустыми. Сокращения - МСК: мезенхимальные стволовые клетки; GFP-МСК: зеленый флуоресцентный белок, экспрессирующих МСК; BDNF-GFP-МСК: мозг нейротрофического фактора-GFP-экспрессирующих МСК; GDNF-GFP-МСК; Глиальных клеток нейротрофический фактор-GFP-экспрессирующих МСК; BDNF / GDNF-GFP-МСК; BDNF и GDNF- GFP-экспрессирующих МСК; ECL: энтактин-Коллаген IV-Ламинин).
Анти-Ki67 иммунного последующим DAPI counterstaining, был использован для оценки того, различные субстраты влияние пролиферацию различных популяций сконструированных МСК (фиг.2А). Экспрессия антигена Ki67 происходит преимущественно на поздних G 1, S, G 2 и М фазах клеточного цикла, и не обнаружено в клетках в фазе покоя (G 0), и, следовательно, является полезным в качестве клеточного маркера пролиферации 15 , 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) является широко используется нюясно и хромосомы контрастирующая, который излучает синий флуоресценции при связывании с AT участков ДНК 16. Общее количество клеток в поле может быть определено путем подсчета количества DAPI окрашенных ядер. Как показано на фиг.2В, хотя было изменение в процентах пролиферирующих МСК, тем не менее, все субстраты поддерживается значительное пролиферацию клеток для каждого из подтипов MSC.
Рисунок 2: Ki67 анализа клеточной пролиферации. () Объединить, дважды флуоресцентное изображение Ki67 иммунноокрашивания (красный) и DAPI (синий) ядерного окрашивания. Многие из МСК были immunolabeled с антителом Ki67 (красный). Шкала бар = 50 мкм. (B), гистограмму, иллюстрирующую процент Ki67 immunolabeled MSC подтипы, выращенных на полистирол (PS), поли-L-лизин (PLL), фибронектин, коллагенТип I, ламинин, или энтактин коллагена IV ламинина (ECL) субстраты для 5 дней в пробирке (DIV). N = один эксперимент. Каждый бар представляет в среднем объединенных данных 8 изображаемых объектов из 2 скважин для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Пропидийиодидом окрашивание (PI) был использован для оценки влияет ли различные субстраты выживаемость клеток (рисунок 3). Йодид Пропидиум является широко используется красно-флуоресцентный ядерной и хромосомы контрастирующая. Йодида пропидия является мембранный impermeant и в целом исключены из жизнеспособных клеток, и, таким образом, является полезным для обнаружения мертвых клеток в популяции. Доля погибших клеток в пределах данного состояния может быть определена при сочетании с общей ядерной этикетке, таких как DAPI, чтобы идентифицировать все клетки в пределах поля. Процент PI-позитивных клеток была низкой на всех субстратах, рассмотренных (Рисунок 3). В качестве положительного контроля для PI реагента, несколько лунки, содержащие МСК инкубировали в 70% -ном этаноле, состояние, известное, чтобы убить большинство клеток, в результате чего высокий процент PI-меченых клеток, как показано на фиг.3В и 3С (этанол обрабатывают положительным контроль).
Рисунок 3: пропидийиодидом гибель клеток анализа. () Объединить, дважды флуоресцентное изображение для пропидийиодидом (красный) и DAPI (синий) окрашивания. Хотя ядра все жизнеспособных клеток окрашивали DAPI (синий), не окрашивание пропидий йодида не было обнаружено в MSC. (B) Практически все МСК были окрашивали пропидийиодидом после воздействия на 70% этанола. Scale бары в А и В = 100 мкм. (С) столбчатую диаграмму, иллюстрирующую процент пропидийиодидом (PI) окрашивали MSC подтипаы выращивают на полистирол (PS), поли-L-лизин (PLL), фибронектин, коллаген типа I, ламинин или энтактин-коллагена IV ламинина (ECL) субстратов в течение 5 дней в пробирке (DIV). Этанол управления: Это условие подается в качестве положительного контроля для окрашивания PI реагента. Большинство клеток подвергаются PI пятно после лечения этанола мертвы и, таким образом, положительно окрашенных для PI реагента. N = один эксперимент. Каждый бар представляет в среднем объединенных данных 8 изображаемых объектов из 2 скважин для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Для исследования возможного влияния различных субстратов на поведение инженерных МСК, миграция клеток была проанализирована с помощью ЗАМЕДЛЕННАЯ Цифровая микроскопия и проходящего света / системы экологического палаты по системе ЖКХ (см Дополнительный видео 1). Несколько сайтов / лунку в заданный промежуток времени изображаетсяи используются для расчета цены миграцию клеток для различных субпопуляций МСК, растущие на различных подложках с использованием программного обеспечения для сбора и анализа изображения. В общем, как показано на фиг.4С, все подтипы МСК показывает самую высокую скорость миграции на внеклеточного матрикса покрытием поверхностей (фибронектин, коллаген, ламинин и ECL) и медленным на не покрытых поверхностей полистирола.
Рисунок 4:. Отслеживания и миграции клеток МСК отслеживается с приобретением изображения и программного обеспечения для анализа. Накладываемая изображения в проходящем свете и флуоресценции изображений из (а) в начале покадровой съемки и (б) по 29 ч позже в конце сессии покадровой обработки изображений (см Дополнительный видео 1). Миграцию клеток дорожки, обозначенный цветной LiNES. Шкала бар:. 50 (С) Бар мкм график, иллюстрирующий среднюю скорость миграции (выраженное в мкм / ч) в течение подтипы MSC, выращенных на полистирол (PS), поли-L-лизин (PLL), фибронектин, коллаген типа I, ламинин, или энтактин-коллагена IV-ламинин (ECL) подложки в течение 2 дней в пробирке (DIV). N = один эксперимент. Каждый бар представляет собой среднее по меньшей мере, 10 отображенных клеток из 2 скважин для каждого условия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Взятые вместе, эти результаты дают предварительные данные, что эти субпопуляции генетически модифицированных МСК отображения аналогичные свойства роста. Эти результаты дают убедительные доказательства того, что лентивирусный опосредованной генетических модификаций этих МСК не вызван никакой драматические обнаружению вредное воздействие на параметры роста исследованных с помощью этого скрининга платформы.
Справочная Видео 1. Покадровый цифрового видео слежения MSC использования программного обеспечения для сбора и анализа изображения. Путь миграции в течение двух МСК [указанных в 1 (зеленая линия отслеживания) и 2 (синий поводок)] проиллюстрированы. Видео снятое в период 29 ч. Изображения были получены каждые 5 минут. Флуоресцентные изображения GFP-экспрессирующих МСК был использован для покадровой обработки изображений в подготовке видео. Калибровка бар = 50 мкм. Этот тип анализа полезен для исследования клеточных поведения, в том числе миграции клеток и клеточного деления.
Discussion
Взрослые мезенхимальные стволовые клетки (МСК), являются привлекательным типом клеток для развития экспериментальной стратегии, сочетающей сотовый и генной терапии, основанной доставки. МСК мультипотентны, способны дифференцироваться в клетки мезодермального происхождения, а также отображать заметной пластичностью, дифференциации / transdifferentiating в нейрональных и глиальных линий с соответствующим индукции парадигмы 17,18. Кроме того, МСК были пересажены и доказали свою эффективность в доклинических исследований в течение многих расстройств, в том числе нейродегенеративных условий 19. Терапевтическая эффективность МСК известно из-за их полезными антипролиферативным, противовоспалительным и анти-апоптотических деятельности 20. МСК, как известно, продуцируют и секретируют различные нейротрофические факторы роста и, что, вероятно, вносит свой вклад в нейропротекторное качеств, связанных с наивных МСК после трансплантации в местах травмы или болезни 21. Importantly, МСК может быть генетически модифицированы для длительной доставки нейротрофических факторов для совместного применения терапии на основе клеточной и генной и были использованы в ряде моделей животных травм или болезней ЦНС 11,19,22.
При разработке комбинированного клеточного и генной терапии на основе стратегии, важно, что здоровье клеток тщательно оценивать до их широкому использованию для ин витро, и особенно в естественных условиях применения. Как доказательство концепции, мы исследовали несколько популяций инженерных и управления MSC линий с целью изучения последствий генетических модификаций на здоровье клеток и фитнес помощью высокопроизводительного скрининга содержание (HCS) подход. В общем, относится к HCS сотовой изображении на основе высокопроизводительного скрининга 14. Этот скрининг подход позволяет дать количественную оценку клеточных фенотипов на многих уровнях пространственной (клеток к внутриклеточной) и временные (до миллисекунды до нескольких дней) разрешениемolution в различных экспериментальных условиях. Используя этот подход, мы обращались возможные различия в предпочтении подложки по следующим параметрам: пролиферации клеток, экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP), клеточной гибели, и подвижность клеток / миграции. Эксперименты были разработаны в формате клеточной культуры 96-луночного планшета. В одной пластине мы регулярно исследовали возможные различия подложки, связанных с по каждому параметру для различных групп населения MSC лентивирусных трансдуцированных клеток и сравнили инженерии МСК с оригиналом, без трансдуцированные МСК. Это обеспечило средства напрямую сравнивать результаты для различных подтипов MSC с батареей анализов в пробирке, таких как пролиферация клеток с использованием Ki67 иммунноокрашивания, живой / мертвый жизнеспособность клеток анализ с использованием окрашивания пропидийиодидом и поведения клеток, выполняя цифровой покадровой обработки изображений , В продолжение этой ЖКХ можно также выполнять ИФА на кондиционированной среды образцов, собранных от человека Wлоктей для количественного определения секреции нейротрофических факторов. Кондиционированные среды из различных подтипов MSC также могут быть использованы в биологических анализов в пробирке, чтобы определить биологическую активность секретируемых факторов 11,23. Этот тип платформы HCS также может быть использован для измерений в пробирке нейритов из первичных нейрональных культур и нейронных стволовых клеточных линий 24. В целом, наши результаты показали, что субпопуляции генетически модифицированных МСК отображается подобные поведения по сравнению с немодифицированных МСК. Влияние различных культуральных субстратах на рост клеток и миграции клеток не существенно отличается между MSC подтипов, а также культуральные субстраты. Таким образом, внеклеточный матрикс субстраты проверенные, казалось, не играют критическую роль в модуляции этих аспектов поведения клеток для этих различных инженерными МСК.
Это исследование демонстрирует использование системы ЖКХ для анализа дифферет аспекты поведения клеток. Тем не менее, это не редкость встретить ограничения, связанные с анализом изображений. В отдельных случаях, при анализе флуоресцентные изображения, это было довольно трудно определить правильное пороговое значение, выше которого immunolabeled или окрашенные клетки будут считаться положительно маркированная / окрашенных. Таким образом, чтобы свести к минимуму субъективизма, определение пороговых значений зависело от сравнению с контрольной группой (отрицательный контроль для флуоресцентной томографии были проведены параллельно в течение всего процесса обработки путем пропуска первичных или вторичных антител). Еще одно ограничение была обнаружена в ходе анализа миграции клеток с использованием цифровых изображений съёмке с интервалами. В некоторых случаях, обработки изображений был не в состоянии различать случайное броуновское движение клетке по сравнению с клеткой самом деле миграции только очень короткое расстояние. Дополнительные ограничения были очевидны в тех случаях, когда программное обеспечение для анализа не смог выделить наличие MULTIPле клетки в непосредственной близости к одному-другому. Чтобы преодолеть это ограничение необходимо ручной выбор клеток в ходе анализа, а не полностью автоматизированного анализа. Плотность клеток покрытие может также привести к перекоса данных о миграции клеток между популяциями клеток, которые отображают большее предпочтение, чтобы расти в сгустки по сравнению с клетками, которые растут в изоляции друг от друга. Эти типы различий в части вероятного отражение клеток-подложке по сравнению с клетка-клетка предпочтений.
Использование системы HCS, чтобы получить изображения, выполнять анализ данных обеспечивает эффективный и быстрый способ создания для оценки нескольких параметров ячейки. Кроме того, были обычно приобрели ЗАМЕДЛЕННАЯ цифровые видео для 30 различных условиях (6 подложек и 5 различных подтипов MSC) на срок от нескольких часов до нескольких дней (48 часов) при использовании на окружающую камеру. Впоследствии Эти данные были использованы для расчета и определения различий в темпах миграции клеток через различных клеточных линий на различных ECMМолекулы.
В этом докладе мы выделили реализацию высоким содержанием скрининга платформы для оценки здоровья и функции клеток. Этот тип анализа полезен для разработки рациональных стратегий для разработки типов клеток, а также полимерные субстраты для облегчения направленную на рост клеток и нервной регенерации. Это важный шаг на пути применения стволовых клеток на основе доставки терапевтических факторов до обширной в естественных условиях доклинических исследований с использованием стратегии клеточной трансплантации.
Disclosures
Публикация плата за это видео статьи были поддержаны Molecular Devices, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1x) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
References
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
- Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
- Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
- Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
- Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
- Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
- Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
- Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
- Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
- Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
- Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
- Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
- Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
- Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
- Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
- Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
- Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).
