This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
तंत्रिका तंत्र संबंधी विकार के उपचार के लिए उपयोगी उपचारों को लागू करने के साथ एक प्रमुख मुद्दा आगे अध: पतन को रोकने के लिए और भी समारोह की वसूली की सुविधा है कि प्रभावी तरीकों को विकसित करने में है। एक अभिनव रणनीति पहले उनके प्रत्यारोपण के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों के उत्पादन के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्टेम कोशिकाओं पूर्व vivo के लिए है। जीन थेरेपी का एक प्रकार के साथ युग्मित सेल आधारित चिकित्सा के इस संयोजन, तंत्रिका तंत्र में बीमारी या चोट प्रेरित neuronal मौत के उपचार के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है।
Neurotrophic कारकों परिपक्व न्यूरॉन्स के विकास और विकासशील न्यूरॉन्स के अस्तित्व के साथ ही रखरखाव और plasticity के लिए आवश्यक हैं। अध्ययन का एक नंबर मध्य और परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स (सीएनएस और पीएन) के प्रारंभिक विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने में neurotrophic कारकों की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है और वे भी इन विट्रो में और एक में पुनर्जनन को प्रोत्साहित कर सकते हैंतंत्रिका चोट एक की निर्मल मॉडल। मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) अत्यधिक सीएनएस में व्यक्त किया और तंत्रिका विकास, अन्तर्ग्रथनी plasticity और मरम्मत 2 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Glial सेल लाइन व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF) डोपामिनर्जिक और motorneurons 3 सहित न्यूरॉन्स के कई प्रकार के अस्तित्व को बढ़ावा देता है। इस प्रकार, तंत्रिका की मरम्मत के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति के तंत्रिका तंत्र के घायल या रोगग्रस्त क्षेत्रों के लिए neurotrophic कारकों की बहिर्जात स्रोतों प्रदान करना है।
Multipotent अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) क्षतिग्रस्त या रोगग्रस्त तंत्रिका तंत्र के इलाज के लिए चिकित्सकीय प्रोटीन की डिलीवरी के लिए महान क्षमता पकड़। वे, 2) multipotential क्षमता, 3) थोड़ा नैतिक चिंताओं, 4 अलगाव और रखरखाव का 1) रिश्तेदार आसानी सहित लाभ के एक नंबर है के बाद से MSCs की ट्रांसप्लांटेशन रोगी संगत सेल आधारित चिकित्सा के विकास के प्रयासों में काफी ध्यान आकर्षित किया है) और जीवित रहने के ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण 4,5 के लिए प्रत्यारोपण और 5) संभावित निम्नलिखित विस्थापित करने की क्षमता। आशाजनक परिणाम रीढ़ की हड्डी में चोट 6,7, स्ट्रोक 8,9, माइलिन कमी 10, और रेटिना अध: पतन 11-13 सहित विभिन्न neurodegenerative शर्तों के एक नंबर के लिए पशु मॉडल में भोले और अनुवांशिक इंजीनियर MSCs के उपयोग के साथ सूचित किया गया है। अनुवांशिक इंजीनियर स्टेम सेल से neurotrophic कारकों के वितरण के साथ कोशिका प्रत्यारोपण युग्मन एक उपन्यास और महत्वपूर्ण तंत्रिका मरम्मत की रणनीति है।
सेल आधारित चिकित्सीय कारक वितरण प्रणाली विकसित करने में एक आवश्यक कदम इंजीनियर कोशिकाओं के सामान्य स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए है। जैसे, इस अध्ययन के प्रमुख उद्देश्य अनुवांशिक इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं की सामान्य वृद्धि मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। तेजी से कई सेल मानकों का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण सेलुलर छवि आधारित उच्च के माध्यम से screenin को रोजगार के लिए हैजी (एचटीएस), अक्सर के रूप में उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) प्रक्रियाओं 14 के लिए भेजा। यह तकनीक स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की अनुमति देता है और इस दृष्टिकोण स्टेम सेल अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है। इस परियोजना में हम अनुवांशिक इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं को एक HCS के सिस्टम को रोजगार के साथ सेल सब्सट्रेट वरीयताओं को और सेलुलर कार्यों के तेजी से लक्षण वर्णन और अनुकूलन के लिए अनुमति देता है कि एक रूपरेखा प्लेटफार्म विकसित की है।
वयस्क mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) एक सेलुलर और जीन डिलीवरी आधारित चिकित्सा के संयोजन एक प्रयोगात्मक रणनीति के विकास के लिए एक आकर्षक सेल प्रकार के होते हैं। MSCs 17,18 लद / फर्क उपयुक्त प्रेरण के साथ neuronal और glial प्रजातियों में transdifferentiating, mesodermal वंश की कोशिकाओं में फर्क करने में सक्षम multipotent हैं, और काफी plasticity के प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, MSCs प्रत्यारोपित और neurodegenerative शर्तों 19 सहित विकारों के एक नंबर, के लिए पूर्व नैदानिक अध्ययन में प्रभावी सिद्ध किया गया है। MSCs की चिकित्सीय प्रभावकारिता अच्छी तरह से उनके लिए फायदेमंद विरोधी प्रफलन, विरोधी भड़काऊ और विरोधी apoptotic गतिविधियों में 20 की वजह से जाना जाता है। MSCs की संभावना भी चोट या बीमारी से 21 की साइटों पर प्रत्यारोपण निम्नलिखित भोले MSCs के साथ जुड़े न्यूरोप्रोटेक्टिव गुणों के लिए योगदान देता है, जो विभिन्न neurotrophic और वृद्धि कारकों, उत्पादन और स्रावित करने के लिए जाना जाता है। जन्मदिनrtantly, MSCs आनुवंशिक रूप से संयुक्त सेलुलर और जीन थेरेपी आधारित अनुप्रयोगों के लिए neurotrophic कारकों की निरंतर वितरण के लिए संशोधित किया जा सकता है और सीएनएस 11,19,22 को चोट या बीमारी के पशु मॉडल की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है।
एक संयुक्त सेलुलर और जीन थेरेपी आधारित रणनीति विकसित करने में, यह कोशिकाओं के स्वास्थ्य को ध्यान से इन विट्रो के लिए उनके व्यापक उपयोग करने से पहले, और विशेष रूप से विवो अनुप्रयोगों में मूल्यांकन किया है कि महत्वपूर्ण है। अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) दृष्टिकोण का उपयोग सेल स्वास्थ्य और फिटनेस पर आनुवंशिक संशोधनों के परिणामों का अध्ययन करने के क्रम में इंजीनियर और नियंत्रण एमएससी लाइनों के कई आबादियों की जांच की। सामान्य में, HCS के सेलुलर छवि आधारित उच्च throughput प्रदर्शन 14 को दर्शाता है। इस स्क्रीनिंग दृष्टिकोण स्थानिक के कई स्तरों (दिनों के लिए मिसे) (subcellular के लिए सेल) और लौकिक रेस में सेलुलर phenotypes की एक मात्रात्मक आकलन परमिटविभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों भर olution। सेल प्रसार, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFP), कोशिका मृत्यु, और सेल गतिशीलता / माइग्रेशन: हम निम्नलिखित मानकों पर सब्सट्रेट वरीयता में संभव मतभेद पहुँचा इस दृष्टिकोण का उपयोग करना। प्रयोगों से 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली प्रारूप में डिजाइन किए गए थे। एक ही थाली के भीतर हम नियमित तौर पर lentiviral-transduced कोशिकाओं के विभिन्न एमएससी आबादी के लिए प्रत्येक पैरामीटर के लिए सम्मान के साथ संभव सब्सट्रेट संबंधी मतभेद की जांच की और मूल के साथ इंजीनियर MSCs, गैर transduced MSCs की तुलना में। यह सीधे समय चूक डिजिटल इमेजिंग प्रदर्शन से एक propidium आयोडाइड धुंधला का उपयोग Ki67 immunolabeling, जी / मृत सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग इस तरह के सेल प्रसार के रूप में इन विट्रो assays के बैटरी, और सेल व्यवहार के साथ अलग एमएससी उपप्रकार के लिए परिणामों की तुलना करने के लिए एक साधन प्रदान की । एक भी व्यक्ति w से एकत्र वातानुकूलित मीडिया नमूनों पर ELISAs प्रदर्शन कर सकते हैं इस HCS का एक विस्तार के रूप मेंएल मात्रात्मक neurotrophic कारकों का स्राव निर्धारित करने के लिए। अलग एमएससी उपप्रकार से वातानुकूलित मीडिया भी secreted कारकों 11,23 के जैविक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो bioassays में इस्तेमाल किया जा सकता है। HCS के मंच से इस प्रकार का भी प्राथमिक neuronal संस्कृतियों और तंत्रिका स्टेम सेल लाइनों 24 से neurite परिणाम की इन विट्रो मापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम आनुवंशिक रूप से संशोधित MSCs की उप-जनसंख्या गैर संशोधित MSCs की तुलना में समान व्यवहार प्रदर्शित कि प्रदर्शन किया। सेल के विकास और सेल प्रवास पर विविध संस्कृति substrates के प्रभाव नाटकीय रूप से एमएससी उपप्रकार के बीच अलग है, साथ ही संस्कृति substrates नहीं था। जैसे, परीक्षण किया बाह्य मैट्रिक्स substrates के इन विभिन्न इंजीनियर MSCs के लिए सेल व्यवहार के इन पहलुओं नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रकट नहीं किया था।
इस अध्ययन एडवेंचर्स विश्लेषण करने के लिए एक HCS प्रणाली के उपयोग को दर्शाता हैसेल व्यवहार की टी पहलुओं। हालांकि, यह छवि विश्लेषण के साथ जुड़े सीमाओं मुठभेड़ करने के लिए असामान्य नहीं है। प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करते हुए इस अवसर पर, यह immunolabeled या दाग कोशिकाओं के रूप में सकारात्मक दाग / लेबल किया गिना जाएगा जो ऊपर सही दहलीज मूल्य निर्धारित करने के लिए कुछ हद तक मुश्किल था। इस प्रकार, व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह को कम से कम करने के लिए, दहलीज मूल्यों के निर्धारण नियंत्रण के साथ एक तुलना (प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी की चूक से सभी प्रसंस्करण के दौरान समानांतर में किए गए थे) पर निर्भर था। एक और सीमा समय व्यतीत हो जाने के डिजिटल इमेजिंग का उपयोग सेल प्रवास के विश्लेषण के दौरान सामना करना पड़ा था। कुछ मामलों में, इमेजिंग सॉफ्टवेयर वास्तव में केवल एक बहुत ही कम दूरी पलायन एक सेल बनाम एक सेल के यादृच्छिक ब्राउनियन गति के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं था। विश्लेषण सॉफ्टवेयर multip की उपस्थिति भेद करने में सक्षम नहीं था, जहां अतिरिक्त सीमाओं स्थितियों में स्पष्ट किया गयाएक-दूसरे के बहुत करीब निकटता में Le कोशिकाओं। विश्लेषण के बजाय एक पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण के दौरान इस सीमा आवश्यक मार्गदर्शन सेल चयन पर काबू पाने के लिए। सेल चढ़ाना घनत्व भी एक दूसरे से अलगाव में बढ़ने कोशिकाओं है कि बनाम clumps में विकसित करने के लिए अधिक से अधिक वरीयता प्रदर्शित कि कोशिकाओं की आबादी के बीच सेल प्रवास डेटा skewing में परिणाम कर सकते हैं। मतभेद के इन प्रकार के भाग जाने की संभावना सेल सेल वरीयताओं बनाम सेल सब्सट्रेट का एक प्रतिबिंब में हैं।
छवियों को प्राप्त और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक HCS के सिस्टम का प्रयोग एक कुशल और तेजी से मतलब है कई सेल मानकों का आकलन करने के लिए प्रदान करता है। इसके अलावा, 30 अलग अलग परिस्थितियों (6 substrates और 5 अलग अलग एमएससी उपप्रकार) के लिए समय चूक डिजिटल वीडियो नियमित तौर पर पर्यावरण कक्ष का उपयोग करते समय घंटे से दिन (48 घंटे) को लेकर अवधि के लिए हासिल किया गया। इस डाटा को बाद में अलग ईसीएम पर विभिन्न सेल लाइनों के पार सेल प्रवास की दरों में अंतर की गणना करने और निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाअणुओं।
इस रिपोर्ट में हम सेल स्वास्थ्य और समारोह का आकलन करने के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच के कार्यान्वयन पर प्रकाश डाला है। विश्लेषण के इस प्रकार निर्देशित सेल के विकास और तंत्रिका पुनर्जनन को सुविधाजनक बनाने के लिए सेल-प्रकार, साथ ही बहुलक substrates के डिजाइन करने के लिए तर्कसंगत रणनीति विकसित करने के लिए उपयोगी है। इस कोशिका प्रत्यारोपण रणनीतियों का उपयोग विवो पूर्व नैदानिक अध्ययन में पूर्व व्यापक करने के लिए उपचारात्मक कारकों में से स्टेम सेल आधारित वितरण के आवेदन करने की दिशा में एक आवश्यक कदम है।
The authors have nothing to disclose.
Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).
96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1M PO4 buffer |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |