This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP).
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed.
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates.
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.
En viktig fråga med att genomföra användbara terapier för behandling av störningar i nervsystemet är i att utveckla effektiva metoder som förhindrar ytterligare degeneration och även underlättar återhämtning av funktionen. En innovativ strategi är att genetiskt tillverka stamceller ex vivo, för produktion av neuroprotektiva faktorer, innan deras transplantation. Denna kombination av cellbaserad terapi, i kombination med en typ av genterapi, ger en kraftfull metod för behandling av sjukdom eller skada-inducerad nervcellsdöd i nervsystemet.
Neurotrofa faktorer är avgörande för tillväxt och överlevnad i utvecklings nervceller samt underhåll och plasticitet av mogna nervceller. Ett antal studier har visat signifikanta roller neurotrofiska faktorer för att främja initial tillväxt och differentiering av nervceller i det centrala och perifera nervsystemet (CNS och PNS) och de kan också stimulera förnyelse in vitro och in enNimal modeller av nervskada 1. BDNF (BDNF) uttrycks starkt i CNS och spelar en viktig roll i regleringen av neural utveckling, synaptisk plasticitet och reparation 2. Gliacellinje neurotrofisk faktor (GDNF) främjar överlevnaden av många typer av nervceller, inklusive dopaminerga och motorneurons 3. Således är en viktig strategi för neural reparation för att ge exogena källor av neurotropa faktorer till de skadade eller sjuka områden i nervsystemet.
Multibenmärgsderiverade mesenkymala stamceller (MSC) håller stor potential för leverans av terapeutiska proteiner för att behandla den skadade eller sjuka nervsystemet. Transplantation av MSC har rönt stor uppmärksamhet i arbetet med att utveckla patientens kompatibla cellbaserade terapier, eftersom de har ett antal fördelar, inklusive, 1) relativt lätt isolering och underhåll, 2) multipotentiell kapacitet, 3) små etiska betänkligheter, 4) Förmåga att överleva och migrera efter transplantation och 5) potential för autolog transplantation 4,5. Lovande resultat har rapporterats vid användning av naiva och genetiskt modifierade MSCs i djurmodeller för ett antal olika neurodegenerativa tillstånd, inklusive ryggmärgsskada 6,7, stroke 8,9, myelinbrist 10, och retinal degeneration 11-13. Koppling celltransplantation med leverans av neurotrofiska faktorer från genetiskt manipulerade stamceller är en ny och viktig neural reparationsstrategi.
Ett viktigt steg i utvecklingen av cellbaserade terapeutisk faktor leveranssystem är att bestämma den normala hälsa förändrade cellerna. Som sådan, det huvudsakliga syftet med denna studie var att utvärdera generella tillväxtparametrar av genetiskt modifierade vuxna stamceller. En viktig metod för att snabbt bedöma flera cellparametrar är att anställa cellulär bildbaserade hög genom screening (HTS), ofta kallad hög halt screening (HCS) förfaranden 14. Denna teknik gör automatiserad bild förvärv och analys och detta tillvägagångssätt är särskilt väl lämpad för stamcellsforskningsansökningar. I det här projektet har vi utvecklat en profilering plattform som möjliggör snabb karaktärisering och optimering av cellsubstrat preferenser och cellulära funktioner med genetiskt manipulerade adulta stamceller anställa en HCS-system.
Vuxna mesenkymala stamceller (MSC) är en attraktiv celltyp för utveckling av en experimentell strategi som kombinerar en cellulär och genavgivning baserad terapi. MSC är multi, förmåga att differentiera till celler av mesodermal härstamning, och visa stor plasticitet, differentiering / transdifferentiating i neuronala och gliaceller härstamningar med lämplig induktionsparadigm 17,18. Dessutom har MSC transplanterats och visat sig effektiv i prekliniska studier för ett antal sjukdomar, inklusive neurodegenerativa tillstånd 19. Den terapeutiska effekten av MSC är välkänt på grund av deras välgörande anti-proliferativa, antiinflammatoriska och anti apoptotiska aktiviteter 20. MSC är också kända för att producera och utsöndra olika neurotrofa och tillväxtfaktorer, vilket sannolikt bidrar till de nervskyddande egenskaper som förknippas med naiva MSCs efter transplantation vid ställen för skada eller sjukdom 21. Importantly, kan MSC vara genetiskt modifierad för förlängd leverans av neurotrofa faktorer för kombinerade cellulära och genterapibaserade applikationer och har använts i ett antal djurmodeller av skada eller sjukdom till CNS 11,19,22.
Vid utvecklingen av en kombinerad cellulär och genterapi baserad strategi, är det viktigt att noggrant bedöms hälsan av cellerna före deras omfattande användning för in vitro och speciellt in vivo applikationer. Som ett proof of concept, undersökte vi flera populationer av konstruerade och kontroll MSC linjer för att studera konsekvenserna av de genetiska modifieringar på cell hälsa och fitness med hjälp av en hög halt screening (HCS) tillvägagångssätt. I allmänhet hänvisar HCS till cellulär bildbaserade högkapacitetsscreening 14. Denna screening medger en kvantitativ bedömning av cellulära fenotyper på flera nivåer av rumsliga (cell till subcellulär) och temporala (millisekunder till dagar) resolution över olika experimentella betingelser. Med hjälp av denna metod som vi åt eventuella skillnader i substratpreferens på följande parametrar: cell spridning, uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP), celldöd och cellrörlighet / migration. Experiment utformades i 96-brunnars cellodlingsplatta format. Inom en enda skylt som vi rutinmässigt undersökt möjliga substrat relaterade skillnader med avseende på varje parameter för de olika MSC populationer av lentivirala-omvandlade celler och jämförde de tekniska MSCs med den ursprungliga, icke-omvandlade MSC. Detta gav en möjlighet att direkt jämföra resultaten för de olika MSC subtyper med ett batteri av in vitro-analyser såsom celltillväxt med hjälp Ki67 immunomärkning, levande / döda cellviabiliteten analys med hjälp propidiumjodidfärgning och cellens beteende genom att utföra tidsförlopp digital bildbehandling . Som en förlängning av detta HCS kan man också utföra ELISA på rade medie prover som tagits från individ walnar att kvantitativt bestämma utsöndringen av neurotrofiska faktorer. Konditionerat medium från olika MSC subtyper kan även användas i in vitro bioanalyser för att bestämma biologisk aktivitet av utsöndrade faktorer 11,23. Denna typ av HCS-plattformen kan också användas för in vitro-mätningar av neuritutväxt från primära neuronala kulturer och neurala stamcellslinjer 24. Sammantaget visade våra resultat att subpopulationer av de genetiskt modifierade MSCs visade liknande beteenden i förhållande till de icke-modifierade MSCs. Inverkan av olika kultursubstrat på celltillväxt och cellmigration var inte dramatiskt annorlunda mellan MSC subtyper, såväl som odlingssubstrat. Som sådan hade de extracellulära matrixsubstrat testade inte tycks spela en avgörande roll för att modulera dessa aspekter av cellens beteende för dessa olika Engineered MSC.
Denna studie demonstrerar användningen av en HCS-system för analys different aspekter av cellbeteende. Det är dock inte ovanligt att stöta på begränsningar förknippade med bildanalys. Ibland samtidigt analysera fluorescens bilder, det var lite svårt att bestämma rätt tröskelvärde över vilket immunolabeled eller färgade celler skulle räknas som positivt märkta / färgas. Således, för att minimera subjektiva fördomar, fastställandet av tröskelvärden var beroende av en jämförelse med kontroller (negativa kontroller för fluorescens avbildning utfördes parallellt under all behandling av utelämnandet av de primära eller sekundära antikroppar). En annan begränsning påträffades under analysen av cellmigration använder tids lapse digital bildbehandling. I vissa fall, det bildprogram inte kunde skilja mellan slumpmässig Brownsk rörelse av en cell kontra en cell faktiskt migrera bara en mycket kort sträcka. Ytterligare begränsningar var tydliga i situationer där analysprogram kunde inte urskilja förekomsten av multiple celler i mycket nära anslutning till en annan. För att övervinna denna begränsning krävs val manuell cell under analysen snarare än en helt automatiserad analys. Cell plätering densitet kan också resultera i skeva datacell migration mellan populationer av celler som uppvisar högre preferens för att växa i klumpar kontra celler som växer i isolerade från varandra. Dessa typer av skillnader är delvis sannolikt en återspegling av cellsubstrat kontra cell-cell preferenser.
Använda en HCS system för att få bilder och utföra analys av data är ett effektivt och snabbt sätt att bedöma flera cellparametrar. Dessutom har time-lapse digital video i 30 olika förhållanden (6 substrat och 5 olika MSC subtyper) rutinmässigt förvärvats under perioder från timmar till dagar (48 timmar) när du använder miljökammaren. Dessa data användes därefter för att beräkna och bestämma skillnader i cellmigrationshastigheter över olika cellinjer på olika ECMmolekyler.
I denna rapport har vi lyft fram genomförandet av en hög halt screening plattform för att bedöma cell hälsa och funktion. Denna typ av analys är användbart för att utveckla rationella strategier för att designa celltyper, såväl som polymersubstrat för att underlätta riktad celltillväxt och neural regenerering. Detta är ett viktigt steg mot tillämpning av stamcellsbaserad leverans av terapeutiska faktorer före omfattande in vivo prekliniska studier med celltransplantationsstrategier.
The authors have nothing to disclose.
Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).
96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1M PO4 buffer |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
Trypsin 0.05% (EDTA 1X) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |