Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.
DNA甲基化模式的映射是大量研究在正常和病变组织。各种方法已被建立,以询问胞嘧啶甲基化模式中的细胞。全基因组测序的亚硫酸氢减少代表性的开发是为了定量检测碱基对分辨率的胞嘧啶甲基化模式在GC丰富的基因位点。这是通过结合使用一种限制性内切酶,随后通过亚硫酸氢盐转化的完成。增强精简表示亚硫酸氢盐测序(ERRBS)增加的生物相关的基因组基因座盖,并已用于分析胞嘧啶甲基化,从人,小鼠和其它生物的DNA。 ERRBS启动与DNA产生低分子量的碎片在文库制备使用限制性内切酶消化。这些片段进行标准库建设下一代测序。前的最后amplificati未甲基化的胞嘧啶的亚硫酸氢盐转化在步骤允许在有盖的基因组位点胞嘧啶甲基化水平的定量基本分辨率。该协议能在四天内完成。尽管低排序的前三个基地的复杂性,ERRBS库产生使用指定的顺序控制车道时,高质量的数据。然后,进行测绘和生物信息学分析和产率数据,可以与各种基因组范围的平台来容易地集成。 ERRBS可以利用小的输入材料数量使其可行处理人类临床样品和适用的范围内的研究应用。产生的视频演示了ERRBS协议的关键步骤。
在胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)DNA甲基化是一个后生标记为各种生物过程中哺乳动物细胞至关重要的,包括但不限于印记,X染色体失活,发展和基因表达1-8的调节。的DNA甲基化模式在恶性和其它病症的研究已经确定疾病特定图案,并有助于疾病的发病机制和可能的生物标志物的发现9-17的理解。有迹象表明,询问表观基因组DNA甲基化状态的许多协议。这些可以分为基于亲和力的,限制性内切酶为基础的,而利用微阵列或测序平台下游重亚硫酸盐转化为基础的分析。此外,也有弥补这些一般类别,包括但不限于,结合亚硫酸氢盐限制性分析18和精简表示亚硫酸氢盐测序(RRBS 19)几个协议。 </P>
RRBS最初由迈斯纳等人 19,20说明。该协议引入了一个步骤,以丰富随后亚硫酸氢盐测序,结果定量碱基对分辨率的数据是符合成本效益21,22富含GC的基因组区域。所述富含GC的区域由MspI酶切位点(C ^ CGG)限制性内切酶有针对性的,和胞嘧啶甲基化是由胞嘧啶的亚硫酸氢盐转化率(未修饰的胞嘧啶到尿嘧啶脱氨),随后通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到解决。 RRBS覆盖大多数基因的启动子和CpG岛中所需的全基因组测序的一小部分;然而RRBS的CpG了海岸和生物相关的其他间隔区的覆盖范围有限。因为这改善后,这些基因组区域23-25 的方法和产生的覆盖原始报表几组已发布更新RRBS协议。增强的减少代表色曲亚硫酸氢接近开关就是嵌入式(ERRBS)包括相比RRBS库准备修改和替代数据对齐方式26。 ERRBS导致数生成的数据所代表的CpG更高,增加了覆盖范围的所有基因组区域的审问26。这种方法已被用来解决在人类患者和其它动物标本26-30 DNA甲基化模式。
所述ERRBS协议上描述所需完成和使用代表人类的DNA所产生的数据的所有步骤提供的信息(样品从先前报道,去识别患者样品31得到的,并从一个正常人供体的CD34 +骨髓样品)。该协议包括一个自动大小选择过程,从而降低了处理时间,每个样品,并允许在文库大小选择提高精度。该协议结合了一连串的既定的分子生物学技术。高分子量DNA被消化瓦特第i个甲基化敏感限制性内切酶(MspI酶切位点),其次是年底修复,A-拖尾,以及甲基化的适配器连接。所述富含GC的片段的大小选择之后是亚硫酸氢盐转化率和之前测序PCR扩增。亚硫酸氢盐转化一直是前面所述32和数据分析和应用程序的详细审查超出了本文的范围,但是建议和参考文献包含了读者使用。该协议可以四天执行,并且是适合于小输入(50毫微克或更少)的材料的量。该协议为每个CpG位点不仅对于差分甲基化位点和区域确定而且对后生多态性检测足够高覆盖率描述产量数据所描述的Landan 等人 33。
胞嘧啶甲基化在生物相关的基因组区域的协议收益率呈现碱基对分辨率的数据。作为写入的50纳克原料优化的协议,但是,它可以适用于处理各种输入材料(5纳克或多个)26。这将需要的一些协议的步骤的调整,如表6所示。该ERRBS库适合于配对末端测序和进一步的基因组的覆盖,也可通过测序完成读长于51个周期。多路复用测序将提供每个样品以较低的成本协议,然而,这将导致每个中的数据( 图5和表8)表示CpG部位减少的覆盖范围,并且不会产生覆盖足够的深度来执行需要每高覆盖率的分析CpG部位( 如所描述的Landan 等人33)。最后,这个协议(或任何亚硫酸氢基protocoL)不能甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶46,47之间的区别。然而,生成可与其它协议被集成的数据结果48,49划定的不同的修改,以及其他的胞嘧啶修饰最近报道50,它们应的兴趣。
高品质的库将出现如图3A-C,以及一旦合并用于测序产生了跟踪, 如图3G(红色迹线),代表来自两个文库的馏分等摩尔贡献。文库制备故障可导致在操作过程中的任何步骤。如果降解的DNA进行处理,将导致在使用在此协议中描述的测序参数不富含MspI酶切位点的片段,从而在低的CpG覆盖库。如果一种酶是无功能的或无意排除在反应之一,该协议将不会产生预期的库。如果结扎意图ction是低效的,适配器是在更高的浓度比预期的,和/或使用的引物浓度是限制性试剂的最终扩增步骤,库可能会发生故障。过量适配器(视为在生物分析结果的峰在〜150bp的图 ; 图3D-F),在库中还会干扰测序由于既库和过量的适配器的滥聚类。而这样的库可能顺序显然通常,的一个显著部读出将是仅仅接头序列。如果过量适配器库中观察到的,这是最好的,以重复文库制备,如果使用优化的输入材料到适配器数量比率的材料是可用的。最后,为了确保库的有效的PCR扩增,所述较低和较高文库级分被保持在整个重亚硫酸盐转化和PCR富集步骤分离的样品。如果不这样做会产生扩增的P期间差分效率较高和较低的级分的CR反应(如在图3G蓝色迹线所示)和用于各个基因组位点的测序过程中涉及的每个库馏分不等代表性的潜力。用户可以选择包括亚硫酸氢盐转化为以扩增而产生的库需要最佳PCR循环进一步滴定后定量PCR立即步骤。
ERRBS文库制备协议有其特定的试剂推荐几个关键步骤。在最终修复工序中,使用了四核苷酸dNTP混合物的允许端修复的不含CG突出端,如那些从MspI酶切位点的酶星活性和存在于原始DNA样品中剪切的DNA片段得到的任何产品。这导致在结果改进的CpG表示。在连接步骤,以确保关键是要使用高浓度的连接酶(2000000单位/ ml)和甲基适配器结扎reacti上是有效的,该亚硫酸氢盐转化不影响对于准确的数据对准所必需的接头序列。在PCR步骤中,使用能够扩增的亚硫酸氢处理的富含GC的DNA片段的聚合酶是必要的高特异性。最后,为了保证消除多余适配器和引物,SPRI珠粒纯化(例如:Agencourt AMPure XP)被推荐,而不是基于列的测定法用于连接和PCR产物隔离。
为了生成高质量的数据时,它以确保有效的亚硫酸氢盐转化是重要的。提出的控制提供了用户确定测序前的转换效率的能力。作为替代,非人类的DNA,例如λ噬菌体DNA可以用作内部对照(尖峰式)。由于品种的差异,这种类型的控件,可以直接计入下游测序( 如所使用的玉等人。34)。然而,如果尖峰在我š利用,它不能被用来确定前文库测序转换效率,除非唯一地放大,并独立地为之前文库测序测序。确定的转换率是基于在非CpG位点的甲基化状态。这可能不适合于在高的胞嘧啶甲基化非CpG上下文(例如胚胎干细胞)和平行的样品或评估可以用于此目的的转换效率的其它手段的情况下使用。
有几个注意事项,以地址是唯一的ERRBS库的顺序。测序的文库级分的前三个碱基为几乎均匀地非随机由于MspI酶切位点的识别剪切位点(C ^ CGG;参见图4B,C)。这导致了显著数据丢失的可能性,由于低质量读取从排序过程中,尽管明显高集群密度差集群的定位所致。为了克服这个障碍,包括一个独立的车道(PhiX管制或其他库型)作为专用车道控制在一个高度复杂的图书馆。高度复杂的图书馆有包含在测序的前四个基地的A,C,T和G均衡的代表性结束。合适的对照泳道包括例如RNA-SEQ,芯片起,全基因组测序,或通过测序机床制造商( 例如 PhiX控制V3)提供一个控制库。当被指定为一个对照泳道用于各个测序运行,它可以作为基础,它在测序前四个碱基用来检测簇的位置的矩阵生成。高品质的读取捕获将提高每个CpG位点的平均覆盖5.2(N = 4)。可替代地,本技术难度也可以使用暗测序方法如先前所述23克服。其他测序标准遵循每制造商的协议标准操作程序。最后,每个CpG的C中的覆盖面Hosen的用于数据分析将被用户和部分被引导通过感兴趣的生物的问题。 10倍覆盖范围的阈值提供了一个高覆盖率的分析方法,但是这个门槛可以降低应该是这样的兴趣。
ERRBS数据分析的完整讨论超出了本文的范围,但是,差异甲基化的胞嘧啶和地区可以使用开源工具31,51-53确定。额外的分析考虑和方法已被充分描述54,55,读者被鼓励以搜索文献为最适合于计划 的分析工具。
相比其他公布方法,ERRBS提供,当为可重复性的描述产量高利率进行了为期四天的协议。相比黄金标准MassARRAY EpiTYPER 26已经验证,具有成本效益的高覆盖率的数据,并适用于各种输入材料量(有利低频的临床样品的处理和其他类型的细胞)和测序的方法。它提供了碱基对分辨率在生物学相关基因座,可以在综合可用于其它技术分析基因组范围的转录因子结合,染色质重塑,表观遗传标记和其他感兴趣的胞嘧啶修饰的分析。在这些研究中ERRBS数据利用可以向一个全面的分子的方法,并允许在生物模型和人类疾病的研究高维分析。
The authors have nothing to disclose.
We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | URL |
MspI | New England Biolabs | R0106M | 100,000 units/ml | https://www.neb.com/products/r0106-mspi |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2 | https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2 |
Phenol solution | Sigma-Aldrich | P4557 | Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 |
Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | 19-22 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767 |
NaOAc | Sigma-Aldrich | S7899 | 3M pH 5.2 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023 |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb |
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | prepare a 1M pH 8.5 solution | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503 |
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) | Sigma-Aldrich | T9285 | Dilute to 1X buffer solution per manufacturer's recommendations | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285 |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | 10X concentration | https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each nucleotide | https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | 3,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | 10,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Used for DNA product purification in protocol step 2.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit |
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) | Promega | U1201 | 100 mM | http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/ |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs | M0212L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Used for DNA product purification in protocol step 3.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202M | 2,000,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase |
Methylation Adapter Oligo Kit | Illumina | ME-100-0010 | ||
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/ |
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free | Sage Science | CDF2010 | with internal standards | http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f |
Certified Low Range Ultra Agarose | Bio-Rad | 161-3106 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose | |
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415 | |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510 |
50 bp DNA Ladder | NEB | N3236S | https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder | |
100 bp DNA Ladder | NEB | N3231S | https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder | |
Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x | |
Scalpel Blade No. 11 | Fisher Scientific | 3120030 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&tab=Items&productId=11876776 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit | |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | Used in protocol step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit |
EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo Research | D5030 | Alternative for step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit |
Universal Methylated Human DNA Standard | Zymo Research | D5011 | Used as bisulfite conversion control | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard |
FastStart High Fidelity PCR System | Roche | 03553426001 | http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854 |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&tabId=AG-PR-1069 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&tabId=AG-PR-1001 | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn | |
HiSeq 2500 | Illumina | http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn | ||
Pippin Prep | Sage Science | http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/ | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872 | |
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS | Illumina | GD-401-3001 | http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn | |
TruSeq SBS Kit v3-HS | Illumina | FC-401-3002 | http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn | |
TruSeq RNA Sample prep | Illumina | RS-122-2001 | Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol | http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn |
Microcentrifuge | ||||
Vortex Mixer | ||||
Dry Block Heater | ||||
Thermal Cycler | ||||
Water Bath | ||||
Gel electrophoresis system | ||||
Electrophoresis power supply | ||||
Gel doc | ||||
UV or blue light transilluminator |