Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.
डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न मानचित्रण भारी सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों में अध्ययन किया है। तरीकों की एक किस्म की कोशिकाओं में साइटोसिन मिथाइलेशन पैटर्न से पूछताछ करने के लिए स्थापित किया गया है। पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण के कम प्रतिनिधित्व जीसी अमीर जीनोमिक loci में मात्रात्मक आधार जोड़ी संकल्प साइटोसिन मिथाइलेशन पैटर्न का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। इस bisulfite रूपांतरण के बाद प्रतिबंध एंजाइम के उपयोग के संयोजन से पूरा होता है। बढ़ी कम प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण (ERRBS) कवर जैविक रूप से प्रासंगिक जीनोमिक loci बढ़ जाती है और मानव, माउस और अन्य जीवों से डीएनए में साइटोसिन मेथिलिकरण प्रोफ़ाइल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ERRBS पुस्तकालय तैयारी के लिए उपयोग में कम आणविक भार टुकड़े उत्पन्न करने के लिए डीएनए के प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ शुरू की। इन टुकड़ों को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मानक पुस्तकालय निर्माण के अधीन हैं। अंतिम amplificati करने से पहले unmethylated cytosines के bisulfite रूपांतरणकदम पर कवर जीनोमिक loci में साइटोसिन मिथाइलेशन के स्तर के मात्रात्मक आधार संकल्प के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल चार दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। एक नामित अनुक्रमण नियंत्रण लेन का उपयोग करते समय अनुक्रम पहले तीन ठिकानों में कम जटिलता के बावजूद, ERRBS पुस्तकालयों उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उपज। मानचित्रण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तो किया जाता है और पैदावार डेटा आसानी से जीनोम चौड़ा प्लेटफार्मों की एक किस्म के साथ एकीकृत किया जा सकता है। ERRBS यह संभव अनुसंधान आवेदनों की एक रेंज में मानव नैदानिक नमूने और लागू संसाधित करने के लिए कर रही है छोटे इनपुट सामग्री मात्रा में उपयोग कर सकते हैं। उत्पादित वीडियो ERRBS प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम को दर्शाता है।
साइटोसिन (5 मिथाइलसिटोसाइन) में डीएनए मेथिलिकरण, जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण सहित, लेकिन Imprinting, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता, विकास, और जीन अभिव्यक्ति 1-8 के नियमन के लिए सीमित नहीं है और एक epigenetic निशान है। घातक और अन्य विकारों में डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न के अध्ययन के रोग विशिष्ट पैटर्न निर्धारित और रोग रोगजनन और संभावित बायोमार्कर खोजों 17/09 की समझ के लिए योगदान दिया है। डीएनए मेथिलिकरण स्थिति के लिए epigenome पूछताछ कि कई प्रोटोकॉल रहे हैं। ये समानता के आधार पर बांटा जा सकता है, प्रतिबंध एंजाइम आधारित है, और नीचे की ओर माइक्रोएरे या अनुक्रमण प्लेटफार्मों का उपयोग कि bisulfite रूपांतरण आधारित assays। इसके अलावा, इन सामान्य श्रेणियों सहित, लेकिन, संयुक्त Bisulfite प्रतिबंध विश्लेषण 18 तक ही सीमित और प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण (आरआरबी 19) से कम नहीं है कि पुल कुछ प्रोटोकॉल रहे हैं। </p>
क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों मूल Meissner एट अल। 19,20 द्वारा बताया गया था। प्रोटोकॉल लागत 21,22 प्रभावी है कि मात्रात्मक आधार जोड़ी संकल्प डेटा के परिणामस्वरूप जो bisulfite अनुक्रमण द्वारा पीछा जीसी अमीर जीनोमिक क्षेत्रों को समृद्ध करने के लिए एक कदम की शुरुआत की। जीसी अमीर क्षेत्रों MspI (सी ^ CGG) के प्रतिबंध एंजाइम द्वारा लक्षित कर रहे हैं, और साइटोसिन मेथिलिकरण पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रवर्धन द्वारा पीछा cytosines के bisulfite रूपांतरण (uracil को असंशोधित cytosines के deamination) द्वारा हल हो गई है। क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों जीन प्रमोटरों और एक पूरे जीनोम के लिए आवश्यक अनुक्रमण के एक अंश में CPG द्वीपों के बहुमत को कवर किया; हालांकि क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों CPG तटों और जैविक प्रासंगिकता के अन्य intergenic क्षेत्रों के सीमित कवरेज किया था। कई समूहों इन जीनोमिक क्षेत्रों 23-25 की कार्यप्रणाली और उसके एवज में कवरेज पर सुधार है कि मूल रिपोर्ट के बाद से क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों प्रोटोकॉल अद्यतन प्रकाशित किया है। बढ़ी कम प्रतिनिधित्व Bisulfite Sequencing (ERRBS) क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों की तुलना में जब पुस्तकालय तैयारी संशोधनों और एक वैकल्पिक डेटा संरेखण दृष्टिकोण 26 में शामिल हैं। ERRBS उत्पन्न डेटा में प्रतिनिधित्व CpGs के एक उच्च संख्या में हुई है और सभी जीनोमिक क्षेत्रों के कवरेज 26 से पूछताछ की वृद्धि हुई है। इस विधि मानव रोगी और अन्य पशु नमूनों 26-30 में डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
ERRBS प्रोटोकॉल पूरा होने और प्रतिनिधि मानव डीएनए का उपयोग कर उत्पन्न किया गया डेटा के लिए आवश्यक सभी कदम पर ऑफर के विवरण में वर्णित (नमूने जैसा कि पहले बताया, डे-पहचान रोगी के नमूने 31 से प्राप्त की है, और एक सामान्य मानव दाता से एक CD34 + अस्थि मज्जा नमूना गया)। प्रोटोकॉल नमूना प्रति प्रसंस्करण समय कम कर देता है और पुस्तकालय आकार चयन में वृद्धि की सटीकता के लिए अनुमति देता है जो एक स्वचालित आकार के चयन की प्रक्रिया भी शामिल है। प्रोटोकॉल की स्थापना की आणविक जीव विज्ञान और तकनीक की एक श्रृंखला को जोड़ती है। उच्च आणविक भार डीएनए डब्ल्यू पच जाता हैअंत मरम्मत, ए-पीछा, और methylated एडेप्टर के बंधाव के बाद मेथिलिकरण-असंवेदनशील प्रतिबंध एंजाइम (MspI) रबर। जीसी अमीर टुकड़े का आकार चयन bisulfite रूपांतरण और अनुक्रमण के लिए पहले पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पीछा किया जाता है। Bisulfite रूपांतरण पहले किया गया 32 में वर्णित है और डेटा विश्लेषण और आवेदनों की विस्तृत समीक्षा की सिफारिशों और संदर्भ 'पाठकों के उपयोग के लिए शामिल किए गए हैं हालांकि इस पत्र के दायरे से परे है। प्रोटोकॉल चार दिनों में प्रदर्शन किया और छोटे इनपुट (50 एनजी या कम) सामग्री मात्रा में करने के लिए उत्तरदायी है किया जा सकता है। अंतर मेथिलिकरण साइट और क्षेत्र निर्धारण के लिए बल्कि epigenetic बहुरूपता का पता लगाने के लिए न केवल पर्याप्त CPG साइट प्रति उच्च कवरेज के साथ वर्णित पैदावार डेटा के रूप में प्रोटोकॉल, एट अल। 33 Landan द्वारा वर्णित के रूप में।
जैविक रूप से प्रासंगिक जीनोमिक क्षेत्रों में साइटोसिन मिथाइलेशन के प्रोटोकॉल प्रस्तुत पैदावार आधार जोड़ी संकल्प डेटा। सामग्री शुरू करने के 50 एनजी के लिए अनुकूलित है के रूप में लिखा प्रोटोकॉल, तथापि, यह इनपुट सामग्री की एक सीमा (5 एनजी या अधिक) 26 संभाल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 6 तालिका के रूप में देखा यह प्रोटोकॉल कदम से कुछ के समायोजन की आवश्यकता होगी। ERRBS पुस्तकालयों भी अनुक्रमण द्वारा पूरा किया जा सकता बनती अंत अनुक्रमण और आगे जीनोमिक कवरेज के लिए उत्तरदायी हैं अब 51 चक्र की तुलना में पढ़ता है। नमूना प्रति एक कम लागत प्रोटोकॉल की पेशकश करेगा मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण, हालांकि, इस डेटा (चित्रा 5 और टेबल 8) में प्रतिनिधित्व CPG साइट प्रति कम कवरेज में परिणाम होगा, और प्रति उच्च कवरेज की आवश्यकता होती है जो विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कवरेज के लिए पर्याप्त गहराई नहीं निकलेगा (Landan एट अल। 33 द्वारा वर्णित के रूप में जैसे) CPG साइट। अंत में, इस प्रोटोकॉल (या किसी भी bisulfite आधारित protocoएल) मिथाइल-साइटोसिन और hydroxymethyl-साइटोसिन 46,47 के बीच भेद नहीं कर सकते। हालांकि, अन्य प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत किया जा सकता उत्पन्न डेटा विभिन्न संशोधनों को चित्रित करने के लिए 48,49 परिणाम है, और अन्य साइटोसिन संशोधनों हाल ही में वे ब्याज की होनी चाहिए, 50 की सूचना दी।
चित्रा 3 जी (लाल ट्रेस) दोनों पुस्तकालय अंशों से बराबर दाढ़ योगदान का प्रतिनिधित्व के रूप में दिखाया चित्रा 3 ए-सी में दिखाया गया है, और एक बार अनुक्रमण के लिए जमा एक का पता लगाने की पैदावार के रूप में उच्च गुणवत्ता के पुस्तकालयों में दिखाई देगा। पुस्तकालय तैयारी विफलता प्रक्रिया के दौरान किसी भी कदम से परिणाम कर सकते हैं। अपमानित डीएनए संसाधित किया जाता है तो यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुक्रमण मापदंडों का उपयोग कम CPG कवरेज में इसलिए MspI टुकड़ों में समृद्ध और नहीं कर रहे हैं कि पुस्तकालयों में परिणाम होगा। एक एंजाइम गैर कार्यात्मक या अनजाने प्रतिक्रियाओं में से एक से बाहर रखा गया है, तो प्रोटोकॉल की उम्मीद पुस्तकालय नहीं निकलेगा। बंधाव इसकी वजह हैंction अक्षम है, एडेप्टर उम्मीद की तुलना में एक उच्च एकाग्रता में कर रहे हैं, और / या इस्तेमाल किया प्राइमरों एकाग्रता अंतिम प्रवर्धन कदम के लिए एक सीमित अभिकर्मक है, पुस्तकालय विफलता हो सकता है। कारण पुस्तकालय और अतिरिक्त एडेप्टर दोनों के अंधाधुंध क्लस्टरिंग को भी अनुक्रमण के साथ हस्तक्षेप करेगा पुस्तकालय में, (चित्रा 3 डी एफ Bioanalyzer परिणामों में ~ 150 बीपी पर एक चोटियों के रूप में देखा) अतिरिक्त एडेप्टर। इस तरह के एक पुस्तकालय जाहिरा तौर पर सामान्य रूप से अनुक्रम सकता है, के एक महत्वपूर्ण हिस्से महज एडाप्टर दृश्यों होगा पढ़ता है। अतिरिक्त एडेप्टर एक पुस्तकालय में मनाया जाता है, यह सामग्री मात्रा अनुपात एडाप्टर के लिए इष्टतम इनपुट सामग्री का उपयोग उपलब्ध है अगर पुस्तकालय तैयारी दोहराने के लिए सबसे अच्छा है। अंत में, पुस्तकालयों के कुशल पीसीआर प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए कम और उच्च पुस्तकालय अंशों bisulfite रूपांतरण और पीसीआर संवर्धन कदम भर में अलग नमूने के रूप में रखा जाता है। ऐसा करने में विफलता पी दौरान प्रवर्धन का अंतर दक्षता पैदावारसीआर (चित्रा 3 जी नीले रंग का पता लगाने के रूप में देखा) उच्च और निम्न अंशों की प्रतिक्रिया और अनुक्रमण के दौरान प्रत्येक पुस्तकालय अंश में कवर संबंधित जीनोमिक loci के असमान प्रतिनिधित्व के लिए संभावित। उपयोगकर्ता पुस्तकालयों उत्पन्न किया जा रहा बढ़ाना करने की जरूरत है इष्टतम पीसीआर चक्र के आगे अनुमापन के लिए bisulfite रूपांतरण के बाद तुरंत एक मात्रात्मक पीसीआर कदम को शामिल करने का विकल्प चुन सकते हैं।
ERRBS पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल विशिष्ट अभिकर्मकों सिफारिश कर रहे हैं, जिसमें कई महत्वपूर्ण कदम है। अंत मरम्मत कदम पर, एक चार न्यूक्लियोटाइड dNTP मिश्रण का उपयोग ऐसे MspI एंजाइमी स्टार गतिविधि और मूल डीएनए नमूने में मौजूद sheared डीएनए टुकड़े से उत्पन्न उन के रूप में तटरक्षक की अधिकता, युक्त नहीं किसी भी उत्पाद के अंत की मरम्मत के लिए अनुमति देता है। इस परिणाम में सुधार CPG प्रतिनिधित्व में यह परिणाम है। बंधाव कदम पर सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च एकाग्रता ligase (2000000 इकाइयों / एमएल) और methylated एडाप्टर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है कि बंधाव reactiपर कुशल है और bisulfite रूपांतरण सटीक डाटा संरेखण के लिए आवश्यक एडाप्टर दृश्यों को प्रभावित नहीं करता है। पीसीआर कदम पर, bisulfite इलाज जीसी अमीर डीएनए टुकड़े amplifying में सक्षम एक पोलीमर्स का उपयोग कर उच्च विशिष्टता के लिए आवश्यक है। अंत में, अतिरिक्त एडेप्टर और प्राइमरों के उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए, (उदाहरण के लिए: Agencourt AMPure एक्सपी) SPRI मनका शुद्धि बंधाव और पीसीआर उत्पाद isolations के लिए स्तंभ आधारित assays के बजाय सिफारिश की है।
उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए आदेश में, यह बहुत ही कुशल bisulfite रूपांतरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तुत नियंत्रण उपयोगकर्ता अनुक्रमण करने से पहले रूपांतरण दक्षता का निर्धारण करने की क्षमता प्रदान करता है। एक विकल्प के रूप में, इस तरह के लैम्ब्डा डीएनए के रूप में एक गैर मानव डीएनए एक आंतरिक नियंत्रण (कील में) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कारण प्रजातियों में अंतर करने के लिए, एक नियंत्रण के इस प्रकार के सीधे नीचे की ओर अनुक्रमण में शामिल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए यू द्वारा इस्तेमाल किया, एट अल। 34)। हालांकि, कील-में मैं अगरउपयोग किया है, यह विशिष्ट प्रवर्धित और स्वतंत्र रूप से पुस्तकालय अनुक्रमण के लिए पहले अनुक्रम जब तक पुस्तकालय अनुक्रमण करने से पहले रूपांतरण दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। निर्धारित रूपांतरण दर गैर CPG स्थलों पर मेथिलिकरण स्थिति पर आधारित हैं। यह (उदाहरण के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं) गैर CPG संदर्भ और समानांतर नमूने या इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जा सकता रूपांतरण दक्षता के लिए आकलन के अन्य साधनों में उच्च साइटोसिन मिथाइलेशन के संदर्भ में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।
ERRBS पुस्तकालयों का अनुक्रमण के लिए अद्वितीय हैं कि पता करने के लिए कुछ निरंतर कर रहे हैं। अनुक्रम पुस्तकालय अंशों की पहली तीन ठिकानों की वजह MspI मान्यता कटौती साइट के लिए लगभग समान रूप से गैर यादृच्छिक हैं (सी ^ सीजीजी, चित्रा 4 बी, सी देखें)। कारण कम गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण डेटा हानि के लिए क्षमता में यह परिणाम अनुक्रमण के दौरान स्पष्ट उच्च क्लस्टर घनत्व के बावजूद गरीब क्लस्टर स्थानीयकरण से उत्पन्न पढ़ता है। इस बाधा को दूर करने के लिए,एक समर्पित नियंत्रण लेन के रूप में एक स्वतंत्र लेन (PhiX नियंत्रण या अन्य पुस्तकालय प्रकार) में एक उच्च जटिलता पुस्तकालय शामिल हैं। उच्च जटिलता पुस्तकालयों अनुक्रम पहले चार अड्डों में ए, सी, टी और जी का एक संतुलित प्रतिनिधित्व युक्त समाप्त होता है। उपयुक्त नियंत्रण गलियों ऐसे आरएनए-सेक, चिप-सेक, पूरे जीनोम अनुक्रमण, या अनुक्रमण मशीन निर्माता (जैसे PhiX नियंत्रण V3) द्वारा की पेशकश की एक नियंत्रण के रूप में पुस्तकालयों में शामिल हैं। संबंधित अनुक्रमण चलाने के लिए एक नियंत्रण लेन के रूप में नामित करते हैं, तो यह क्लस्टर पदों का पता लगाने के लिए अनुक्रमण के पहले चार ठिकानों के दौरान उपयोग किया जाता है जो मैट्रिक्स पीढ़ी के लिए आधार के रूप में सेवा कर सकते हैं। उच्च गुणवत्ता द्वारा CPG साइट प्रति मतलब कवरेज बढ़ा देंगे पर कब्जा कर लिया पढ़ता 5.2 (एन = 4)। वैकल्पिक रूप से, इस तकनीकी कठिनाई भी पहले 23 में वर्णित के रूप में एक अंधेरे अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग कर दूर किया जा सकता है। अन्य अनुक्रमण मापदंड निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें। CPG ग प्रति अंत में, कवरेजडेटा विश्लेषण के लिए होसेन ब्याज की जैविक सवालों से उपयोगकर्ता द्वारा और भाग में निर्देशित किया जाएगा। 10x कवरेज दहलीज एक उच्च कवरेज विश्लेषण दृष्टिकोण, हालांकि इस सीमा है कि ब्याज की होनी चाहिए उतारा जा सकता है देता है।
ERRBS डेटा विश्लेषण की एक पूरी चर्चा हालांकि, विभिन्न methylated cytosines और क्षेत्रों खुला स्रोत उपकरण 31,51-53 का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, इस लेख के दायरे से परे है। अतिरिक्त विश्लेषण विचार और दृष्टिकोण 54,55 अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, और पाठक की योजना बनाई विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त उपकरणों के लिए साहित्य खोज करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।
अन्य प्रकाशित तरीकों की तुलना में, ERRBS reproducibility के वर्णित पैदावार उच्च दर के रूप में प्रदर्शन किया है, जो जब एक चार दिवसीय प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह MassARRAY EpiTYPER 26 मानक सोने की तुलना में मान्य किया गया है, लागत प्रभावी उच्च कवरेज डेटा के लिए है, और विभिन्न इनपुट सामग्री के लिए अनुकूलनीय हैऔर अनुक्रमण दृष्टिकोण (कम आवृत्ति के नैदानिक नमूना प्रसंस्करण और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूल) के बराबर है। यह जीनोम चौड़ा बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक, क्रोमेटिन remodeling, epigenetic के निशान और हित के अन्य साइटोसिन संशोधनों की रूपरेखा अन्य तकनीकों के साथ विश्लेषण करती जैविक रूप से प्रासंगिक loci में आधार जोड़ी संकल्प प्रदान करता है और एकीकृत में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन में ERRBS डेटा का उपयोग एक व्यापक आणविक दृष्टिकोण के लिए योगदान और आयामी जैविक मॉडल और मानव रोग के अध्ययन के विश्लेषण में उच्च के लिए अनुमति दे सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | URL |
MspI | New England Biolabs | R0106M | 100,000 units/ml | https://www.neb.com/products/r0106-mspi |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2 | https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2 |
Phenol solution | Sigma-Aldrich | P4557 | Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432 |
Glycogen | Sigma-Aldrich | G1767 | 19-22 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767 |
NaOAc | Sigma-Aldrich | S7899 | 3M pH 5.2 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023 |
Buffer EB | Qiagen | 19086 | 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb |
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | prepare a 1M pH 8.5 solution | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503 |
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) | Sigma-Aldrich | T9285 | Dilute to 1X buffer solution per manufacturer's recommendations | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285 |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | 10X concentration | https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | 10 mM each nucleotide | https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | 3,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment |
T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | 10,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Used for DNA product purification in protocol step 2.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit |
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) | Promega | U1201 | 100 mM | http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/ |
Klenow Fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs | M0212L | 5,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Used for DNA product purification in protocol step 3.3 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202M | 2,000,000 units/ml | https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase |
Methylation Adapter Oligo Kit | Illumina | ME-100-0010 | ||
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use | https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/ |
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free | Sage Science | CDF2010 | with internal standards | http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f |
Certified Low Range Ultra Agarose | Bio-Rad | 161-3106 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose | |
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415 | |
Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510 |
50 bp DNA Ladder | NEB | N3236S | https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder | |
100 bp DNA Ladder | NEB | N3231S | https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder | |
Gel Loading Dye, Orange (6X) | NEB | B7022S | https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x | |
Scalpel Blade No. 11 | Fisher Scientific | 3120030 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&tab=Items&productId=11876776 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit | |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | Used in protocol step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit |
EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo Research | D5030 | Alternative for step 6.2 | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit |
Universal Methylated Human DNA Standard | Zymo Research | D5011 | Used as bisulfite conversion control | http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard |
FastStart High Fidelity PCR System | Roche | 03553426001 | http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854 |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D | |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&tabId=AG-PR-1069 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&tabId=AG-PR-1001 | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn | |
HiSeq 2500 | Illumina | http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn | ||
Pippin Prep | Sage Science | http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/ | ||
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872 | |
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS | Illumina | GD-401-3001 | http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn | |
TruSeq SBS Kit v3-HS | Illumina | FC-401-3002 | http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn | |
TruSeq RNA Sample prep | Illumina | RS-122-2001 | Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol | http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn |
Microcentrifuge | ||||
Vortex Mixer | ||||
Dry Block Heater | ||||
Thermal Cycler | ||||
Water Bath | ||||
Gel electrophoresis system | ||||
Electrophoresis power supply | ||||
Gel doc | ||||
UV or blue light transilluminator |