Introduction
Der Sehnerv ist ein idealer Ort für das zentrale Nervensystem (ZNS) regenerative Forschung einschließlich ophthalmologische Erkrankungen wie Sehnervenentzündung, Glaukom und Trauma. Injektionen mit einer Vielzahl von Stammzellen wurden entweder Wirksamkeit gezeigt oder als vielversprechend bei der Ersetzung verlorener Myelin Erhöhung axonalen Zahl und / oder Prävention von degenerativen Erkrankungen. 1,2
Der menschliche Sehnerv enthält etwa 1,2 Millionen parallel Axone Weg von der Netzhaut zum chiasm mit einem Durchmesser von etwa 3,0-3,5 mm. 3 bei Erkrankungen des Menschen im Labor Modell wurde die Ratte häufig verwendet worden. Erwachsene Ratten Sehnerv enthält ungefähr 100.000 Axone innerhalb eines Durchmessers von etwa 0,5 mm. 4 eine der Hauptbeschränkungen bei der ZNS-regenerative Forschung direkten Zugriff ohne Knochen. Komplikationen und Operationsrisiken für das Tier sind höher, wenn der Schädel oder Wirbeln entfernt werden. Ähnlich zu den Vorteilenminimalinvasive Ansätze in der Wirbelsäule, 5 direkte Sehnerv Injektionen ohne Öffnen der Schädel Angebot reduziert Komplikationen und eine schnellere Erholung.
Diese Technik wurde in früheren Studien verwendet worden. 6 In diesem Manuskript und begleitende Video zeigen wir eine minimal-invasives Verfahren zur Gewinnung von Stammzellen in der Ratte Sehnerv injizieren.
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Protocol
HINWEIS: Alle tierischen Verfahren wurden von der Johns Hopkins Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Anästhesiegeräte erfordern jährliche Inspektion und Kalibrierung nach Bedarf.
1. Anästhesie und Lagerung
- Anästhesie.
- Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Narkose mit 2-3% Isofluran. Bestätigen angemessene Höhe der Anästhesie durch toe Prise und Atemfrequenz. Überprüfen Sie, dass die Ratte nicht in Reaktion auf eine Zehe Prise zusammenzucken.
HINWEIS: Ein Zucken zeigt Anästhesie, die zu spät ist und kann mehr Anästhesie vor Beginn oder eine höhere Isofluoran Konzentration erfordern. Ein Atemfrequenz weniger als 1 Atemzug alle 2 Sek zu langsam ist, die die Narkose ist zu hoch und kann Aufhellung der Isofluoran Konzentration erfordern. - Sichern Sie das Tier wie nötig, um die Kopfbewegung während des Verfahrens zu verhindern. Geben Sie einen Tropfen von Lidocain auf der chirurgischen Augen. Verwenden Sie künstliche Tränen alle 10 min bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Gebeneine Injektion von Buprenorphin 0,01 mg / kg SC präoperativ und dann alle 6-8 h je nach Bedarf.
- Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter Narkose mit 2-3% Isofluran. Bestätigen angemessene Höhe der Anästhesie durch toe Prise und Atemfrequenz. Überprüfen Sie, dass die Ratte nicht in Reaktion auf eine Zehe Prise zusammenzucken.
- Positionierung.
- Zeigen Ratten in einen stereotaktischen Rahmen und warm halten mit einem Heizkissen. Befeuchten Sie die Kopfhaut Pelz mit Alkohol kümmert, um die Exposition der Augen zu vermeiden. Verwenden Sie sterile Instrumente und sterile Technik, um das Risiko von postoperativen Infektionen zu minimieren.
2. Eye Control
- Legen Sie eine 4-0 Naht in der seitlichen Bindehaut und binden Sie es mit genügend Naht auf sanfte Traktion ermöglichen.
3. Dissection
- Initial Dissection.
- Machen Sie eine ~ 1 Zoll Schnitt in der Haut über der Orbital Grat mit einer Größe 10 Skalpell, wie in Abbildung 1 gezeigt. Ziehen Sie die Haut und das darunter liegende Faszie und sorgfältig sezieren entfernt die Faszie. Um starke Blutungen in das Operations vermeiden, vermeiden, schneiden die Blutgefäße während sezieren die Faszie. Verwenden Sie strategisch placed Baumwolle Tipps, um Hämostase bereitzustellen.
- Deeper Dissection.
HINWEIS: Bei leichten Zug auf der Bindehaut zieht das Auge nach unten und aus der Steckdose, wird der Muskel orbitalis superior in den Blick geraten. Um den optischen Nerv freizulegen, muss dieser Muskel geschnitten werden und die retroorbitalen Fett entfernt. Das Fett kann verworfen werden und nicht nach der Injektion ersetzt. Ab diesem Zeitpunkt sollte der Sehnerv Faszien als ein Bündel des Sehnerven selbst sichtbar sein, zusammen mit Blutgefäßen in Dura verpackt (Abbildung 1).- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Dura mit dem Skalpell oder eine 31 Gauge Nadel abgeschrägt, um piercing weniger traumatisch.
4. Pipettieren Injector
- Ziehen einer Glasmikropipette mit einem Durchmesser von 50-100 um. Um Stabilität zu gewährleisten, montieren Sie die Mikropipette auf einem Mikromanipulator und heften sich an einer Hamilton-Spritze mit einer Infusionspumpe angeschlossen.
- Ziehen Sie die Perlen (oder Stammzellen)in einem 0,5-1,0 ul Volumen in der Mikropipette zusammen mit 0,5 & mgr; l Volumen der Methylenblaulösung vor und nach Retrogradation rekonstituiert.
HINWEIS: Eine Infusionsrate auf 0,5 bis 2 & mgr; l pro min eingestellt verhindert Trauma des Sehnervs.
5. Injection
- Senken Sie die Spitze der Mikropipette auf den Sehnerv direkt über der Dura geklaut.
HINWEIS: Eine kleine, aber rege Bewegung der Glasspitze in den Sehnerv Ergebnisse im geringsten Schaden. Da die Infusionspumpe beginnt, sollte die Methylenblau-Farbstoff den Bereich des Sehnervs injiziert markieren. Der Farbstoff sollte innerhalb des Sehnervs ohne Austreten in den Subarachnoidalraum lokalisiert bleiben. - Folgen Sie dem zweiten Band von Methylenblau, um festzustellen, wenn die Stammzellinjektion abgeschlossen ist und schalten Sie die Infusionspumpe aus, wenn die zweite Dosis von Methylenblau eingespritzt wird. Halten Sie die Mikropipette immer noch innerhalb des Sehnerven für 2 Minuten für jeweils 1 & mgr; l Volumen eingespritzt, um zu verhindern HochDruckausstoß beim Zurückziehen der Mikropipette.
HINWEIS: Ein alternativer Ansatz ist, um die Pipettenspitze mit einer Luftspritze, die manuell bearbeitet werden kann angeschlossen werden. So oder so, dass kein übermäßiger Kraft, um Schäden an den Sehnerven zu minimieren. Wir empfehlen, die Injektion nicht mehr als 2 & mgr; l Volumen in jedem Sehnerv.
6. Folgen Sie up
- Unmittelbar.
- Wenn die Injektion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Mikropipette zusammen mit allen Baumwollspitzen verwendet werden, um die Blutstillung bereitzustellen. Naht der Haut mit 3-0 Seide und entfernen Sie den Bindehautnaht.
- Halten Ratten warmen auf einem Heizkissen, bis sie aus der Narkose hervorgehen. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er wieder zu sich kam, um ausreichende Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück.
- Wird das Tier Anzeichen von Schmerzen, einschließlich übermäßige Lethargie, Ataxie, oder arbeiteten breathin Ausstellerg, zu verwalten angemessenen Schmerzmitteln mit intramuskulären Buprenorphin (0,05 mg / kg) bis zu dreimal täglich.
- Langfristig.
- Für die nächsten 24-48 Stunden, beobachten die Ratte für Komplikationen der Operation, einschließlich Schwellung oder Entlassung aus der Wunde oder anderen Anzeichen von Schmerzen, wie vocalizing, gebeugt Aussehen, nicht-Pflege, oder nicht essen. Betrachten Sie Rücksprache mit einem Tierarzt oder ethische Euthanasie wie nötig.
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Representative Results
Am Ende des Experiments wurden die Ratten getötet und mit 4% Paraformaldehyd perfundiert. Die Sehnerven wurden sorgfältig seziert und für Kryostat Schnitte angebracht. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel einer Ratte ganzen Sehnerven bei geringer Leistung, bei dem Evans-Blau-Farbstoff wurde, um die Website zu visualisieren injiziert. Der Pfeil bezeichnet die genaue Lage der Injektion. Diese Präparation wurde in wenigen Minuten von der Injektion durchgeführt, wie durch die beschränkte Diffusion des Farbstoffes durch das Nerven angegeben. Anderer Injektionen, haben wir eine langsame Diffusion von Farbstoff in Richtung Chiasma über den Verlauf von mehreren Stunden beobachtet.
Abb. 1: Chirurgische Gesichtsfeld Die Ratte wird mit dem linken Auge in dieser Figur zugreifen positioniert. Ein Schnitt über dem Orbital Kamm und der Faszien gemachtGewebe nach unten hinter dem Auge seziert. Eine Bindehautnaht kann der Bediener leichten Zug, der die Hirn Sehnerv in Sicht zieht ohne Öffnen des Schädels an.
Abb. 2: Gross Präparation injiziert Sehnerv Verwendung Evans blauen Farbstoff kann der Injektionsstelle in den Sehnerv stark unter einem Dissektionsmikroskop visualisiert werden. In diesem Bild wurde der Sehnerv an der Injektionsstelle zu schneiden, um den Farbstoff innerhalb des Sehnerven Gewebe eingebettet zu zeigen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
