Introduction
يوفر العصب البصري موقعا مثاليا للنظام العصبي المركزي (CNS) البحوث التجدد بما في ذلك شروط العيون مثل التهاب العصب البصري، والزرق والصدمات النفسية. حقن مجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية أثبتت إما فعالية أو أظهرت الوعد في استبدال المايلين المفقود، وزيادة عدد المحاور و / أو الوقاية من الأمراض التنكسية. 1،2
العصب البصري البشري يحتوي على ما يقرب من 1.2 مليون محاور متوازية متجهة من الشبكية إلى تصالبة التي يبلغ قطرها حوالي 3.0-3.5 مم. 3 لنموذج الأمراض التي تصيب الإنسان في المختبر، وقد تم استخدام الفئران في كثير من الأحيان. والعصب البصري الفئران الكبار يحتوي على حوالي 100،000 المحاور داخل يبلغ قطرها حوالي 0.5 مم. 4 واحدة من القيود الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي البحوث التجديدي هو الوصول العظم المباشر. المضاعفات والمخاطر الجراحية للحيوان أعلى عندما تتم إزالة الجمجمة أو الفقرات. وعلى غرار فوائدالنهج الحد الأدنى الغازية في العمود الفقري، 5 المباشر حقن العصب البصري دون فتح الجمجمة عرض تخفيض المضاعفات وانتعاش أكثر سرعة.
وقد استخدمت هذه التقنية في الدراسات السابقة. 6 وفي هذه المخطوطة والفيديو المصاحبة لها، علينا أن نظهر إجراء المناظير لحقن الخلايا الجذعية في العصب البصري الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز. آلات التخدير تتطلب التفتيش السنوي والمعايرة حسب الضرورة.
1. التخدير وتحديد المواقع
- التخدير.
- أداء جميع العمليات الجراحية تحت التخدير مع 2-3٪ isofluorane. تأكيد مستوى مناسب من التخدير من قرصة أخمص قدميها، ومعدل التنفس. تأكد من أن الفئران لا تتوانى في استجابة لقرصة أخمص قدميه.
ملاحظة: تتوانى يشير التخدير أن يفوت الأوان، وقد يتطلب تخدير أطول قبل بداية أو تركيز isofluorane العالي. معدل التنفس أقل من 1 التنفس كل 2 ثانية بطيئة جدا مما يدل على التخدير مرتفع جدا، وقد تتطلب البرق للتركيز isofluorane. - تأمين الحيوان عند الضرورة لتجنب حركة الرأس أثناء العملية. وضع قطرة من يدوكائين على العين الجراحية. استخدام الدموع الاصطناعية كل 10 دقيقة لمنع جفاف بينما تحت التخدير. منححقن البوبرينورفين 0.01 مغ / كغ SC ما قبل الجراحة وبعد ذلك كل 6-8 ساعة حسب الحاجة.
- أداء جميع العمليات الجراحية تحت التخدير مع 2-3٪ isofluorane. تأكيد مستوى مناسب من التخدير من قرصة أخمص قدميها، ومعدل التنفس. تأكد من أن الفئران لا تتوانى في استجابة لقرصة أخمص قدميه.
- تحديد المواقع.
- وضع الفئران في إطار التجسيمي والدفء مع وسادة التدفئة. الرطب الفراء فروة الرأس مع الكحول مع الحرص على تجنب التعرض على العينين. استخدام أدوات معقمة وتقنية معقمة للحد من خطر العدوى بعد العمليات الجراحية.
2. التحكم في العين
- وضع خياطة 4-0 في الملتحمة الجانبية وربط ذلك مع ما يكفي من خياطة للسماح الجر لطيف.
3. تشريح
- تشريح الأولي.
- جعل بوصة شق ~ 1 في الجلد المغطي التلال المداري باستخدام حجم 10 مشرط كما هو مبين في الشكل 1. يتراجع عن الجلد واللفافة الكامنة وتشريح بعناية بعيدا اللفافة. لمنع النزيف في العمليات الجراحية، وتجنب قطع الأوعية الدموية في حين تشريح اللفافة. استخدام استراتيجيا ررنصائح القطن ماجد لتوفير الارقاء.
- تشريح أعمق.
ملاحظة: مع الجر لطيف على الملتحمة سحب العين السقوط والخروج من مأخذ، وسوف يأتي عضلة المدارية متفوقة في طريقة العرض. من أجل فضح العصب البصري، يجب أن تقطع هذه العضلات وإزالة الدهون الرجعية المدارية. الدهون يمكن التخلص منها ويجب أن لا يتم استبدال بعد الحقن. من هذه النقطة، يجب أن يكون لفافة العصب البصري المرئي وكأنه مجموعة من العصب البصري في حد ذاته، جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية ملفوفة في الجافية (الشكل 1).- إجراء شق صغير في الجافية باستخدام مشرط أو 31 مقياس مشطوف إبرة لجعل ثقب أقل من صدمة.
4. ماصة الحاقن
- سحب micropipette الزجاج ليبلغ قطرها 50-100 ميكرون. لتوفير الاستقرار وتركيب micropipette على micromanipulator ونعلق على حقنة هاميلتون متصلة مضخة التسريب.
- سحب ما يصل حبات (أو الخلايا الجذعية)أعيد في حجم 0،5-1،0 ميكرولتر في micropipette الوراء جنبا إلى جنب مع 0.5 حجم ميكرولتر من حل الميثيل الأزرق قبل وبعد.
ملاحظة: ان معدل ضخ المقرر أن 0،5-2 ميكرولتر لكل دقيقة يمنع الصدمات في العصب البصري.
5. حقن
- خفض غيض من micropipette على العصب البصري فقط فوق الجافية رصدت.
ملاحظة: حركة صغيرة، ولكن انتعش من طرف زجاج في نتائج العصب البصري في أقل الأضرار. كما تبدأ مضخة التسريب، ينبغي للالميثيل صبغة زرقاء تسليط الضوء على منطقة العصب البصري حقن. ينبغي أن تظل الصبغة المحلية داخل العصب البصري دون تسرب في الفضاء تحت العنكبوتية. - اتبع الفرقة الثانية للأزرق الميثيل للوقوف عند حقن الخلايا الجذعية اكتمال وتشغيل مضخة التسريب قبالة كما يتم حقن الجرعة الثانية من اللون الأزرق الميثيل. الحفاظ على micropipette لا يزال داخل العصب البصري لمدة 2 دقيقة لكل وحدة تخزين 1 ميكرولتر حقنها لمنع ارتفاعضغط طرد على الانسحاب من micropipette.
ملاحظة: هذا أسلوب بديل لتوصيل طرف ماصة لشغل حقنة الهواء التي يمكن التلاعب بها يدويا. وفي كلتا الحالتين، وتجنب استخدام القوة المفرطة للحد من الأضرار التي لحقت الأعصاب البصرية. ونحن نوصي حقن لا يزيد عن 2 ميكرولتر من حجم في كل العصب البصري.
6. متابعة
- فوري.
- عندما حقن اكتمال، وإزالة micropipette جنبا إلى جنب مع أي نصائح القطن المستخدمة لتوفير الارقاء. خياطة الجلد مع 3-0 الحرير وإزالة خياطة الملتحمة.
- الحفاظ على الفئران دافئة على وسادة التدفئة حتى خروجها من التخدير. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- إذا كان الحيوان هو اظهار علامات الألم بما في ذلك الخمول المفرط، وترنح، أو يتنفس جاهدز، إدارة التسكين المناسب مع البوبرينورفين العضلي (0.05 ملغ / كلغ) ما يصل إلى ثلاث مرات يوميا.
- طويل الأمد.
- لساعة 24-48 المقبلة، ومراقبة الفئران لمضاعفات الجراحة بما في ذلك تورم أو إفرازات من الجرح أو غيرها من علامات الألم مثل اللفظ، والمظهر منحنية، وعدم النظافة الشخصية، أو لا يأكل. النظر في التشاور مع طبيب بيطري أو القتل الرحيم الأخلاقي عند الضرورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في ختام التجربة، تم التضحية الفئران ومع perfused 4٪ لامتصاص العرق. تم الأعصاب البصرية تشريح بعناية والتي شنت لناظم البرد باجتزاء الشكل 2 يوضح مثال على الفئران العصب البصري كله في الطاقة المنخفضة التي تم حقن صبغة زرقاء ايفانز من أجل رؤية الموقع. السهم يحدد الموقع الدقيق للحقن. وقد تم ذلك تشريح داخل دقيقة قليل من الحقن كما يدل على ذلك انتشار محدود من الصبغة أسفل العصب. في الحقن أخرى، لاحظنا انتشار بطيء للصبغ نحو chiasm البصرية على مدى عدة ساعات.
الشكل 1: المجال الجراحي لعرض يتم وضع الفئران مع الوصول إلى عينه اليسرى في هذا الرقم. يتم إجراء شق فوق التلال المداري وفافييتم تشريح الأنسجة أسفل وراء العين. A خياطة الملتحمة يسمح للمشغل لتطبيق الجر لطيف التي تشد العصب البصري داخل الجمجمة في الرأي دون فتح الجمجمة.
الشكل 2: تشريح الإجمالي من العصب البصري حقن الاستفادة ايفانز صبغة زرقاء، موقع الحقن في العصب البصري يمكن تصور بشكل فاضح تحت المجهر تشريح. في هذه الصورة، وقطع العصب البصري في موقع الحقن لإظهار صبغ جزءا لا يتجزأ من داخل أنسجة العصب البصري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
