Introduction
Optik sinir merkezi sinir sistemi (MSS) gibi optik nevrit, glokom ve travma olarak göz koşullar da dahil olmak üzere rejeneratif araştırma için ideal bir konum sağlar. Kök hücrelerin çeşitli enjeksiyonları ya aksonal sayısı artan ve / veya dejeneratif hastalıkların önlenmesi, etkinlik göstermiştir veya kayıp miyelin değiştirilmesi söz göstermiştir. 1,2
insan optik sinir yaklaşık 3.0-3.5 mm'lik bir çapa sahip kiazmada retinadan seyahat eden yaklaşık 1.200.000, paralel aksonlar içerir. 3 Laboratuarda insan hastalıklarının modellemek için, sıçan sık kullanılmaktadır. yetişkin sıçan optik sinir yaklaşık 0,5 mm çapında içinde yaklaşık 100.000 aksonlar içerir. MSS önemli sınırlamalar 4 biri rejeneratif araştırma direkt kemiksiz erişimi olduğunu. Hayvan komplikasyonlar ve cerrahi riskler kafatası veya omurlar kaldırıldığında yüksektir. Faydaları Benzeromurgada minimal invazif yaklaşımlar, kafatası teklif azaltılmış komplikasyonları ve daha hızlı bir toparlanma açmadan 5 direk optik sinir enjeksiyonları.
Bu teknik daha önceki çalışmalarda kullanılmıştır. 6 Bu yazıda ve beraberindeki video, sıçan optik sinir içine kök hücreler enjekte etmek için minimal invaziv prosedür göstermek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bütün hayvan prosedürleri Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Anestezi makineleri gerektiği şekilde yıllık muayene ve kalibrasyonu gerektirir.
1. Anestezi ve Konumlandırma
- Anestezi.
- % 2-3 isofluorane ile anestezi altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. Ayak tutam ve solunum hızı ile anestezi uygun seviyede onaylayın. Sıçan, bir ayak tutam yanıt korkmak olmadığını kontrol edin.
NOT: Bir 'deki kaçınma çok geç anestezi belirtir ve başlamadan önce uzun anestezi veya daha yüksek isofluorane konsantrasyon gerektirebilir. Her 2 sn anestezi gösteren çok yavaş 1 nefes az bir solunum hızı çok yüksek ve isofluorane konsantrasyon aydınlatma gerektirebilir. - İşlem sırasında baş hareketi önlemek için gerekli hayvan sabitleyin. Cerrahi göz lidokain bir damla yerleştirin. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için yapay gözyaşları her 10 dakikada kullanın. Vermek0.01 mg / kg SC Ameliyat öncesi ve daha sonra, her 6-8 saatte bir buprenorfin bir enjeksiyon gerektiği gibi.
- % 2-3 isofluorane ile anestezi altında tüm cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. Ayak tutam ve solunum hızı ile anestezi uygun seviyede onaylayın. Sıçan, bir ayak tutam yanıt korkmak olmadığını kontrol edin.
- Konumlama.
- Bir stereotaksik çerçeveye fareleri yerleştirin ve bir ısıtma yastığı ile sıcak tutmak. Gözleri maruz kalmaktan kaçınmak için alkol alarak özenle kafa derisi kürk ıslatın. Post-operatif enfeksiyon riskini en aza indirmek için steril alet ve steril tekniği kullanın.
2. Göz Kontrolü
- Lateral konjonktivada 4-0 dikiş yerleştirin ve nazik çekiş izin verecek yeterli sütür ile kravat.
3. Diseksiyon
- İlk Diseksiyon.
- . Şekil 1'de gösterildiği gibi bir boyutu 10 neşter kullanılarak orbita sırt örten deride ~ 1 inç kesi yapmak cilt ve altta yatan fasya çekin ve dikkatlice fasya uzak teşrih. Cerrahi içine aşırı kanama önlemek için, fasya diseksiyon sırasında kan damarları kesme kaçının. Pl stratejik kullanınaced pamuk ipuçları hemostazı sağlamak.
- Derin Diseksiyon.
NOT: Aşağı ve soketten göz çekerek konjonktiva nazik çekiş ile superior orbital kas görünümüne girecek. Optik sinir açığa çıkarmak amacıyla, bu kas kesilmiş ve retro-orbital yağ çıkarılmalıdır. yağ atılır ve enjeksiyondan sonra değiştirilmesi gerekir. Bu noktadan sonra, optik sinir kaplaması dura sarılmış kan damarları (Şekil 1) ile birlikte, optik sinir kendisi bir paket olarak görünür olmalıdır.- Daha az travmatik piercing yapmak için neşter veya 31 göstergesi Eğimli iğne kullanılarak dura küçük bir kesi yapmak.
4. Pipet Enjektör
- 50-100 um bir çapa, bir cam mikropipet çekin. Stabilite temin etmek için, bir mikromanipülatör mikropipet mount ve bir enfüzyon pompasına bağlı bir Hamilton şırınga ekleyin.
- Boncuk yukarı çekin (veya kök hücreleri)önce ve sonra metil mavi çözelti, 0.5 ul hacim ile birlikte retrograd mikropipet bir 0.5-1.0 ul hacim içinde yeniden.
NOT: min başına 0.5-2 ul ayarlanmış bir infüzyon hızı optik sinir travma engeller.
5. Enjeksiyon
- Sadece tırtıklı dura üstünde optik sinir üzerine mikropipet ucu düşürün.
NOT: En az hasara optik sinir sonuçlarına cam ucu bir küçük, ama tempolu hareket. Infüzyon pompası başlarken, metil mavi boya enjekte optik sinir alanını vurgulamak gerekir. boya subaraknoid dışarı sızdıran olmadan optik sinir içinde lokalize kalmalıdır. - Kök hücre enjeksiyonu tamamlandığında belirlemek ve metil mavisi ikinci doz enjekte edilir olarak infüzyon pompası kapatmak için metil mavisi ikinci grup takip edin. Yüksek önlemek için enjekte her 1 ul hacmi için 2 dakika süreyle optik sinir içinde hala mikropipet tutunmikropipet geri çekilmesi üzerine basınç ejeksiyon.
NOT: Alternatif bir yaklaşım elle manipüle edilebilir bir hava dolu şırınga pipet bağlamaktır. Her iki şekilde de, optik sinirlere zararı en aza indirmek için aşırı güç kaçının. Her optik sinir hacminin en fazla 2 ul enjekte öneririz.
6. Takip
- Hemen.
- Enjeksiyon tamamlandığında, hemostaz sağlamak için kullanılan herhangi bir pamuk ipuçları ile birlikte mikropipet çıkarın. 3-0 ipek ile cildi dikin ve konjonktiva dikiş çıkarın.
- Anestezi ortaya kadar ısıtma yastığı sıcak sıçan tutun. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
- Hayvan, aşırı uyuşukluk, ataksi, ya da yorucu nefes dahil ağrı belirtileri sergileyen iseg, günde üç kereye kadar kas içi buprenorfın (0.05 mg / kg) ile ilgili analjezi yönetmek.
- Uzun dönem.
- Gelecek 24-48 saat için, şişlik veya akıntı yara veya vokalli, kambur bir görünüm, sigara damat ya da yemek olarak değil ağrı diğer belirtileri de dahil olmak üzere cerrahi komplikasyonlar için sıçan gözlemleyin. Gerektiği gibi bir veteriner ya da etik ötanazi ile istişare düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneyin sonunda, sıçanlar kurban edilmiş ve% 4 paraformaldehit ile perfüze. Optik sinirler dikkatli bir şekilde kesilir ve kriyostat bölümlere ayırma için monte edilmiştir. 2 Evans mavisi sitesi görselleştirmek için enjekte edilmiş, düşük güçte bir fare, tüm optik sinirin bir örneğini göstermektedir. ok enjeksiyon kesin konumunu tanımlar. Sinirden boya sınırlı difüzyon ile gösterildiği gibi bu diseksiyon enjeksiyonu bir kaç dakika içinde yapıldı. Diğer enjeksiyon olarak, birkaç saatlik bir süre boyunca kiazmada doğru boyanın yavaş difüzyonu gözlemledik.
Şekil 1:. Görüş cerrahi alan sıçan bu rakamın sol gözü erişmek için birlikte konumlandırılmıştır. Bir kesi orbital sırt ve fasiyal üzerinde yapılırDoku göz arkasında aşağı disseke edilir. Bir konjonktiva sütür operatör kafatası açılmadan görünümüne intrakranial optik sinir çeker nazik traksiyon uygulamak için izin verir.
Şekil 2:. Enjekte optik sinirin Brüt diseksiyon Evans mavi boya kullanarak, optik sinir enjeksiyon sitesi fena halde bir diseksiyon mikroskop altında görülebilir. Bu resimde, optik sinir, optik sinir dokusu içinde gömülü boya göstermek için enjeksiyon yerinde kesildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
