Introduction
El nervio óptico es un lugar ideal para el sistema nervioso central (SNC) la investigación regenerativa incluyendo condiciones oftalmológicas tales como neuritis óptica, glaucoma y el trauma. Las inyecciones de una variedad de células madre han demostrado la eficacia o mostrado promesa en la sustitución de la mielina perdida, aumentar el conteo de axonal y / o la prevención de enfermedades degenerativas. 1,2
El nervio óptico humano contiene aproximadamente 1,2 millones de axones paralelas que viajan desde la retina hasta el quiasma con un diámetro de aproximadamente 3,0-3,5 mm. 3 Para modelar enfermedades humanas en el laboratorio, la rata se ha usado con frecuencia. El nervio óptico de la rata adulta contiene aproximadamente 100.000 axones dentro de un diámetro de aproximadamente 0,5 mm. 4 Una de las principales limitaciones en el SNC investigación regenerativa es el acceso sin hueso directa. Las complicaciones y riesgos quirúrgicos para el animal son más altas cuando se quitan el cráneo o vértebras. Similar a los beneficios deabordajes mínimamente invasivos en la columna vertebral, 5 inyecciones nervio óptico directos sin necesidad de abrir las oferta reducida complicaciones cráneo y una recuperación más rápida.
Esta técnica se ha utilizado en estudios previos. 6 En este manuscrito y vídeo que acompaña, se demuestra un procedimiento mínimamente invasivo para inyectar células madre en el nervio óptico de la rata.
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Protocol
NOTA: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Johns Hopkins. Máquinas de anestesia requieren inspección anual y calibración según sea necesario.
1. Anestesia y Posicionamiento
- Anestesia.
- Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con anestesia con isofluorano 2-3%. Confirmar nivel adecuado de anestesia por pizca dedo del pie y ritmo respiratorio. Compruebe que la rata no se inmuta en respuesta a una pizca dedo del pie.
NOTA: Un estremecimiento indica la anestesia que es demasiado tarde y puede requerir anestesia más largos antes de comenzar o una concentración isofluorano superior. Una tasa de respiración menos de 1 respiración cada 2 seg es demasiado lento que indica la anestesia es demasiado alta y puede requerir aligeramiento de la concentración de isofluorano. - Asegure el animal si es necesario para evitar el movimiento de la cabeza durante el procedimiento. Coloque una gota de lidocaína en el ojo quirúrgico. Use lágrimas artificiales cada 10 minutos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Daruna inyección de buprenorfina de 0,01 mg / kg SC pre-operativamente y luego cada 6-8 horas según sea necesario.
- Realizar todos los procedimientos quirúrgicos con anestesia con isofluorano 2-3%. Confirmar nivel adecuado de anestesia por pizca dedo del pie y ritmo respiratorio. Compruebe que la rata no se inmuta en respuesta a una pizca dedo del pie.
- Posicionamiento.
- Coloque las ratas en un marco estereotáxico y mantenga caliente con una almohadilla térmica. Humedezca la piel del cuero cabelludo con el cuidado de alcohol para evitar la exposición en los ojos. Utilice herramientas estériles y una técnica estéril para minimizar el riesgo de infecciones postoperatorias.
2. Control de los ojos
- Coloque una sutura 4-0 en la conjuntiva lateral y lo atan con suficiente sutura para permitir una tracción suave.
3. Disección
- Disección inicial.
- Hacer una incisión ~ 1 pulgada en la piel que cubre la cresta orbital utilizando un tamaño de 10 bisturí como se muestra en la Figura 1. Retraer la piel y la fascia subyacente y cuidadosamente diseccionar la fascia. Para prevenir el sangrado excesivo en el quirúrgico, evitar cortar los vasos sanguíneos, mientras que la disección de la fascia. Utilizar estratégicamente plconsejos de Aced algodón para proporcionar hemostasia.
- Disección más profundo.
NOTA: Con tracción suave en la conjuntiva del ojo tirando hacia abajo y fuera de la cuenca, el músculo orbital superior vendrá a la vista. Con el fin de exponer el nervio óptico, este músculo se debe cortar la grasa y retro-orbital retira. La grasa puede ser desechado y no debe ser sustituido después de la inyección. Desde este punto, la fascia nervio óptico debe ser visible como un haz del nervio óptico en sí, junto con los vasos sanguíneos envueltos en la duramadre (Figura 1).- Hacer una pequeña incisión en la duramadre utilizando el bisturí o una aguja biselada de calibre 31 para hacer la perforación menos traumática.
4. Pipetear Inyector
- Tire de una micropipeta de vidrio de un diámetro de 50-100 micras. Para proporcionar estabilidad, montar la micropipeta en un micromanipulador y adjuntar a una jeringa Hamilton conectado a una bomba de infusión.
- Tire hacia arriba de los granos (o células madre)reconstituida en un volumen de 0,5-1,0 l en la micropipeta retrógrado junto con 0,5 l de volumen de solución de azul de metilo antes y después.
NOTA: Una tasa de infusión de 0,5 a 2 l por minuto impide traumatismo en el nervio óptico.
5. Inyección
- Baje la punta de la micropipeta en el nervio óptico justo encima de la duramadre mellado.
NOTA: Una pequeña, pero a paso ligero movimiento de la punta de vidrio en los resultados del nervio óptico en el menor daño. Cuando comienza la bomba de infusión, el colorante azul de metilo debe resaltar el área del nervio óptico inyectado. El tinte debe permanecer localizada dentro del nervio óptico sin fugas en el espacio subaracnoideo. - Sigue la segunda banda de azul de metilo para determinar cuando la inyección de células madre es completa y girar la bomba de infusión fuera como se inyecta la segunda dosis de azul de metilo. Mantenga la micropipeta todavía dentro del nervio óptico durante 2 min para cada volumen 1 l se inyecta en alta para evitareyección de presión tras la retirada de la micropipeta.
NOTA: Un enfoque alternativo es para conectar la punta de la pipeta a una jeringa llena de aire que puede ser manipulado manualmente. De cualquier manera, evitar una fuerza excesiva para minimizar el daño a los nervios ópticos. Se recomienda la inyección de no más de 2 l de volumen en cada nervio óptico.
6. Seguimiento
- Inmediato.
- Cuando la inyección, retire la micropipeta junto con las puntas de algodón utilizados para proporcionar la hemostasia. Suturar la piel con seda 3-0 y saque la sutura conjuntival.
- Mantenga ratas caliente en una almohadilla eléctrica hasta que emergen de la anestesia. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere totalmente.
- Si el animal está mostrando signos de dolor, incluyendo excesiva letargo, ataxia, o respirando trabajadog, administrar analgesia adecuada con buprenorfina intramuscular (0,05 mg / kg) hasta tres veces diarias.
- A largo plazo.
- Para el próximo 24 a 48 horas, se observe la rata de complicaciones de la cirugía, incluyendo inflamación o secreción de la herida u otros signos de dolor como la vocalización, la apariencia encorvada, sin preparación, o no comer. Considere la posibilidad de consultar con un veterinario o la eutanasia ética como sea necesario.
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Representative Results
A la conclusión del experimento, las ratas se sacrificaron y se perfundieron con 4% de paraformaldehído. Los nervios ópticos fueron cuidadosamente disecados y montados para seccionamiento criostato. La figura 2 muestra un ejemplo de un nervio óptico de rata entero a baja potencia en el que se inyectó colorante azul de Evans con el fin de visualizar el sitio. La flecha identifica la ubicación precisa de la inyección. Esta disección se realiza dentro de unos pocos minutos de la inyección, como se indica por la difusión restringida del colorante por el nervio. En otras inyecciones, hemos observado una lenta difusión de tinte hacia el quiasma óptico en el transcurso de varias horas.
Figura 1:. Campo de vista quirúrgico La rata se coloca para acceder con el ojo izquierdo en esta figura. Se hace una incisión por encima de la cresta orbital y la fasciael tejido se diseca hacia abajo detrás del ojo. Una sutura conjuntival permite que el operador aplica una suave tracción que tira del nervio óptico intracraneal a la vista sin necesidad de abrir el cráneo.
Figura 2:. Disección bruto de nervio óptico inyectado Utilizando colorante azul de Evans, el sitio de inyección en el nervio óptico puede ser groseramente visualizó bajo un microscopio de disección. En esta imagen, el nervio óptico se cortó en el sitio de inyección para mostrar el colorante incrustado dentro del tejido del nervio óptico.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
