Introduction
Le nerf optique offre un emplacement idéal pour le système nerveux central (SNC), y compris la recherche régénérative conditions ophtalmologiques tels que la névrite optique, le glaucome et les traumatismes. Les injections de diverses cellules souches ont démontré une efficacité ou soit montré prometteur pour remplacer la perte de myéline, ce qui augmente le nombre axonale et / ou prévenir les maladies dégénératives. 1,2
Le nerf optique humain contient environ 1,2 million d'axones parallèles voyageant de la rétine au chiasme avec un diamètre d'environ 3,0-3,5 mm. 3 Pour modéliser les maladies humaines en laboratoire, le rat a été utilisé fréquemment. Le nerf optique de rat adulte contient environ 100.000 axones au sein d'un diamètre d'environ 0,5 mm. 4 Une des limitations majeures dans la recherche régénérative CNS est l'accès désossé directe. Les complications et les risques chirurgicaux à l'animal sont plus élevés lorsque le crâne ou des vertèbres sont enlevés. Comme pour les avantages deapproches mini-invasives de la colonne vertébrale, 5 injections du nerf optique directs sans ouvrir le crâne offre réduite complications et une récupération plus rapide.
Cette technique a été utilisée dans les études précédentes. 6 Dans ce manuscrit et la vidéo qui l'accompagne, nous démontrons une procédure mini-invasive d'injecter des cellules souches dans le rat nerf optique.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux Johns Hopkins. machines d'anesthésie nécessitent une inspection annuelle et l'étalonnage nécessaire.
1. Anesthésie et de positionnement
- Anesthésie.
- Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous anesthésie avec 2-3% isofluorane. Confirmez niveau approprié de l'anesthésie par pincement de l'orteil et le taux de respiration. Vérifiez que le rat ne bronche pas en réponse à un pincement de l'orteil.
NOTE: Un tressaillement indique anesthésie qui est trop tard et peut nécessiter une anesthésie plus avant de commencer ou une concentration isofluorane supérieur. Un taux inférieur à 1 souffle toutes les 2 sec est trop lent indiquant l'anesthésie de respiration est trop élevé et peut exiger un éclaircissement de la concentration isofluorane. - Fixez l'animal comme nécessaire pour éviter les mouvements de la tête lors de la procédure. Déposer une goutte de la lidocaïne sur l'œil chirurgicale. Utilisez des larmes artificielles toutes les 10 min pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. Donnerune injection de buprénorphine de 0,01 mg / kg SC pré-opératoire, puis tous les 6-8 heures au besoin.
- Effectuer toutes les interventions chirurgicales sous anesthésie avec 2-3% isofluorane. Confirmez niveau approprié de l'anesthésie par pincement de l'orteil et le taux de respiration. Vérifiez que le rat ne bronche pas en réponse à un pincement de l'orteil.
- Positionnement.
- Placez rats dans un cadre stéréotaxique et garder au chaud avec un coussin chauffant. Mouiller la fourrure du cuir chevelu avec de l'alcool en prenant soin d'éviter l'exposition sur les yeux. Utiliser des outils stériles et technique stérile pour minimiser les risques d'infections post-opératoires.
2. Contrôle des yeux
- Placez une suture 4-0 dans la conjonctive latérale et attacher avec assez de suture pour permettre une légère traction.
3. Dissection
- Dissection initiale.
- Faire une incision pouces ~ 1 dans la peau recouvrant la crête orbitale en utilisant une taille 10 scalpel comme le montre la figure 1. Rentrer la peau et le fascia sous-jacent et soigneusement disséquer le fascia. Pour prévenir les saignements excessifs dans la chirurgie, éviter de couper les vaisseaux sanguins tout en disséquant le fascia. Utilisez stratégiquement plconseils de coton ACED pour fournir l'hémostase.
- Dissection profonde.
NOTE: Avec une légère traction sur la conjonctive de l'œil en tirant vers le bas et de la prise, le muscle orbitaire supérieure entrera en vue. Afin d'exposer le nerf optique, ce muscle doit être coupé et la graisse rétro-orbitaire retiré. La graisse peut être jeté et ne doit pas être remplacé après l'injection. De ce point, le nerf optique fascia doit être visible comme un faisceau de nerf optique lui-même, avec les vaisseaux sanguins enveloppés dans la dure-mère (Figure 1).- Faire une petite incision dans la dure-mère utilisant le scalpel ou une aiguille biseautée de calibre 31 pour faire percer moins traumatisante.
4. Pipette Injector
- Tirer une micropipette de verre à un diamètre de 50 à 100 um. Pour assurer la stabilité, la micropipette monter sur un micromanipulateur et le fixer à une seringue Hamilton reliée à une pompe à perfusion.
- Tirez les billes (ou cellules souches)reconstituée dans un volume de 0,5 à 1,0 ul dans la micropipette rétrograde avec 0,5 ul de volume de solution de bleu de méthyle avant et après.
NOTE: Un débit de perfusion réglé à 0,5-2 pi par min empêche traumatisme du nerf optique.
5. Injection
- Abaissez la pointe de la micropipette sur le nerf optique juste au-dessus de la dure entaillé.
REMARQUE: Un petit mouvement, mais rapide de la pointe de verre dans les résultats du nerf optique dans le moins de dommages. Comme la pompe à perfusion commence, le colorant bleu de méthyle devrait mettre en évidence la zone du nerf optique injecté. Le colorant doit rester localisée dans le nerf optique sans fuite dans l'espace sous-arachnoïdien. - Suivez la deuxième bande de bleu de méthylène pour déterminer quand l'injection de cellules souches est complète et tourner la pompe à perfusion off que la deuxième dose de bleu de méthylène est injectée. Gardez la micropipette toujours dans le nerf optique pendant 2 minutes pour chaque volume de 1 pl injecté dans de prévenir l'hypertensionéjection pression lors du retrait de la micropipette.
NOTE: Une approche alternative est de relier la pointe de la pipette à une seringue remplie d'air qui peut être manipulé manuellement. De toute façon, éviter une force excessive pour minimiser les dommages aux nerfs optiques. Nous vous recommandons d'injecter plus de 2 pi de volume dans chaque nerf optique.
6. Suivi
- Immédiate.
- Lorsque l'injection est terminée, retirez la micropipette avec des conseils de coton utilisés pour fournir l'hémostase. Suturer la peau avec soie 3-0 et enlever la suture conjonctivale.
- Gardez rats chaud sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'ils sortent de l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
- Si l'animal présente des signes de douleur excessive, y compris la léthargie, ataxie, ou breathin travaillég, administrer une analgésie appropriée avec la buprénorphine par voie intramusculaire (0,05 mg / kg) jusqu'à trois fois par jour.
- Long terme.
- Pour le 24-48 heures suivantes, observer le rat pour des complications de la chirurgie, y compris gonflement ou la décharge de la plaie ou d'autres signes de douleur tels que la vocalisation, l'apparence voûtée, non-toilettage, ou ne pas manger. Envisager une consultation avec un vétérinaire ou l'euthanasie éthique que nécessaire.
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Representative Results
A la fin de l'expérience, les rats ont été sacrifiés et perfusés avec 4% de paraformaldehyde. Les nerfs optiques ont été soigneusement disséqués et montés pour cryostat sectionnement. La figure 2 montre un exemple d'un rat ensemble nerf optique à faible puissance dans lequel colorant bleu Evans a été injecté afin de visualiser le site. La flèche indique l'emplacement précis de l'injection. Cette dissection a été fait en quelques minutes de l'injection, comme indiqué par la diffusion limitée du colorant sur le nerf. En d'autres injections, nous avons observé une lente diffusion de colorant vers le chiasme optique au cours de plusieurs heures.
Figure 1:. Champ de vue chirurgical Le rat est positionné avec pour accéder à l'œil gauche sur cette figure. Une incision est faite ci-dessus la crête orbitaire et le fasciale tissu est disséqué derrière l'œil. Une suture conjonctivale permet à l'opérateur d'appliquer une légère traction qui tire le nerf optique intracrânienne dans la vue sans ouvrir le crâne.
Figure 2:. Dissection brut du nerf optique injecté Utilisant colorant bleu Evans, le site d'injection dans le nerf optique peut être grossièrement visualisé sous un microscope de dissection. Dans cette image, le nerf optique a été coupé au niveau du site d'injection afin de faire apparaître le colorant incorporé dans le tissu du nerf optique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
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