Introduction
T-lymfocyten zijn kritische componenten van het adaptieve immuunsysteem. T-cellen zijn verantwoordelijk voor niet alleen direct bemiddelen beschermende immuunresponsen tegen pathogenen via verschillende effector mechanismen, maar ook actief handhaven immunologische zelftolerantie en richten van de reacties van andere cellen in het immuunsysteem. Deze functies worden doorheen een aantal geïntegreerde signalen, waaronder T-cel receptor (TCR) ligatie, cytokines en chemokines en metabolieten 1. Van deze signalen, het TCR is van bijzonder belang, omdat de kenmerkende specificiteit die rol van de T cel definieert adaptieve immuniteit. Een TCR interactie met lineaire peptide antigenen door MHC (HLA humane ortholoog) moleculen (pMHC complexen) dat in een zeer specifieke en gevoelige wijze de signalen die T cel effectorfunctie initiëren. De biochemische parameters van TCR interactie met pMHC liganden niet alleen de specificiteit voor Tcel activatie, maar ook een kwalitatieve invloed op daaropvolgende T-celfunctie 2. Aldus bestuderen T-celfunctie vereist vaak behandeling de reacties van klonale T-cellen met gedefinieerde antigene specificiteit.
De humane T-cel compartiment, die ongeveer 10 12 αβ T-cellen bevat naar schatting 10 juli - 10 augustus afzonderlijke αβTCRs 3-4. Dit divers repertoire biedt gelegenheid voor de erkenning van de enorme serie van peptiden uit potentiële ziekteverwekkers die een T-cel respons voor beschermende immuniteit zouden vereisen. Geschat wordt dat de frequentie van T-cellen reageren op een bepaald vreemd antigeen door zelf-MHC in de orde van 10 -4 - 10 -7 bij ontstentenis van voorafgaande immuunrespons tegen dat antigeen 5. De naïeve T-cel repertoire wordt gevormd door thymus selectie die zichzelf herkennen MHC-peptide-antigenen presenteren en beperken reageren verzekerentiviteit tegen zelf-peptide-antigenen, het maximaliseren van het potentieel nut voor het bemiddelen van beschermende immuniteit 2. In strijd met deze ontworpen reactiviteit, een relatief grote frequentie, 10 -3 - 10 -4, van T-cellen uit immunologisch naïeve individuen reageren op stimulatie met allogene cellen, en zowel het vreemde MHC-moleculen en de endogene peptiden zij opleveren 6. De erkenning van allogene pMHC liganden is structureel vergelijkbaar met de erkenning van buitenlandse antigenen gepresenteerd door zelf-MHC; de TCR maakt kritische biochemische interacties met zowel allogene MHC-molecuul en het gepresenteerde peptide 7. De robuuste karakter van de respons van T-cellen allogene stimulatie gevolg van de diversiteit van pMHC complexen aanwezig op het oppervlak van allogene cellen 8. Geschat wordt dat elk MHC geeft ongeveer 2 x 10 4 verschillende endogene peptide antigenen 9. Deze breadth respons op allogene stimulatie is een belangrijk aspect van de klinisch relevante pathologie, zoals transplantaatafstoting of graft versus host disease (GVHD) als gevolg van T cel alloreactiviteit.
Studie van humane T cel responsen alloreactieve traditioneel vertrouwd op behandeling polyklonale responsen van naïeve T-cellen na stimulatie met allogene cellen. Herhaalde stimulatie met dezelfde allogene cellijn gecombineerd met beperkende verdunning analyses kan genereren klonale T-cellen met gedefinieerde erkenning van allogene HLA 10. Deze benadering is problematisch voor de behandeling reacties op individuele allogene pMHC liganden, zoals de grote en diverse repertoire van endogene pMHC complexen voor een bepaalde allogene HLA onderhavige stimuleert een breed repertoire van T-cellen. Deze massapopulatie stimulatie en beperkende verdunning aanpak screening van grote aantallen klonen vereisen om T-cellen te isoleren met de gewenste Reactivity tegen een enkele pMHC ligand. Bovendien is de frequentie van T-cellen reageren op een individuele allogene pMHC ligand relatief laag bij naïeve T-cel populaties die een belemmering voor efficiënte productie van humane T cel klonen die reageren op een bepaald antigeen presenteert.
Identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen van polyklonale populaties zijn ingeschakeld door de ontwikkeling van fluorofoor gelabeld pMHC multimeren 11. Deze benadering maakt gebruik van specifiek peptide antigenen in recombinante oplosbare gebiotinyleerde MHC moleculen die gelabeld door binding aan een met streptavidine gemerkt fluorofoor geladen. Multimerizatie van pMHC verhoogt de gretigheid, het compenseren van de intrinsiek lage (uM) affiniteit van TCR voor oplosbare pMHC liganden. Gelabelde cellen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd door flowcytometrie. Echter, deze benadering nog steeds beperkt door de lage frequentie van antigeen-specifieke T-cellen bij naïeve T-celpopulaties, die typischordes van grootte kleiner dan de limiet van nauwkeurige identificatie en kwantificatie van de meeste flowcytometers. Om deze beperking te pakken, is een werkwijze pMHC tetrameer labeling en daaropvolgende magnetische bead verrijking voor tetrameer gelabelde cellen 12 ontwikkeld. Deze methode betrouwbare detectie, telling en isolatie van laagfrequente antigeen-specifieke T-cellen aangetoond.
Dit protocol beschrijft een effectief protocol voor het genereren van humane T cel klonen die specifiek reageren op afzonderlijke allogene pMHC liganden. Het protocol geldt pMHC (HLA) multimeer etikettering en verrijking voor de isolatie van allogeen-specifieke menselijke T-cellen met flowcytometrie celsortering en een robuuste werkwijze voor in vitro kweek van humane T-cellen om de productie van T-celklonen uit één gesorteerde cellen (inschakelen overzicht in figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol vereist het gebruik van perifere bloedmonsters van menselijke vrijwilligers. Al het onderzoek met menselijke proefpersonen moet worden beoordeeld en goedgekeurd door een Human Studies Institutional Review Board goedgekeurd om de naleving van de Verklaring van Helsinki (2013) en het Health Insurance Portability en Accountability Act van 1996 te verzekeren.
1. Isolatie van T-cellen uit volbloed
- Voorafgaand aan het starten, warm de dichtheidsgradiënt medium tot kamertemperatuur. Aliquot 4 ml dichtheidsgradiënt medium in 2-4 steriele 15 ml conische centrifugebuizen (1 buis gebruikt voor elke 10 ml totaal volume verdund bloed).
- Verkrijgen van 10-20 ml bloed in 1-2 natriumheparine gespraycoat (groen-top) veneuze bloedafname buizen. Verzamel menselijke specimens onder toezicht van opgeleide individuen en volgens een Institutional Review Board goedgekeurde protocol.
- Veeg de buitenkant van de buizen met 70% ethanol. Verwijder voorzichtig de toppen van de figevuld verzamelbuizen en decanteer het bloed in een steriele 50 ml centrifugebuis.
- Voeg 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan elke bloedafname. Verzamel de PBS, toe te voegen aan de afgegoten volbloed, en meng voorzichtig.
- Voeg 25 ul Human T Cell Verrijking Cocktail / 2 ml totaal volume. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Pipetteer 10 ml, laag tot 10 ml van de 1: 1 verdund bloed voorzichtig bovenop de dichtheidsgradiënt medium. Let op het oppervlak van de dichtheidsgradiënt medium niet verstoren.
- Centrifuge gelaagde bloed en dichtheidsgradiënt medium bij 1200 xg gedurende 20 min bij 20 ° C
- Haal de buizen uit de centrifuge, zorg om de interface tussen de dichtheidsgradiënt medium en de laag van leukocyten aan het grensvlak tussen de dichtheidsgradiënt medium en verdund plasma niet verstoren. Met behulp van een pipet 5 ml, zorgvuldig verzamelen van de leukocyten laag en over te dragen aan een nieuwe steriele 50 ml conische tube.
- Voeg PBS om het volume van de verzamelde PBL om 50 ml te brengen en meng voorzichtig.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren.
- Resuspendeer celpellets in 10 ml steriele flowcytometrie sorteren buffer (steriel gefiltreerd PBS bevattende 1% BSA). Steekproef 10 pi celsuspensie, verdunnen 1:10 (toe te voegen aan 90 pi) trypanblauw om cellen met behulp van een hemocytometer tellen (verwachte opbrengst 1-4 x 10 6 cellen / buis van volbloed).
- Verwijder 1 ml aliquot, over te brengen naar 5 ml tube, en blijf op ijs voor de analyse van T-cellen niet gelabeld door tetrameer. Houd celsuspensie op ijs.
2. Magnetische Verrijking van allogeen-specifieke T-cellen
- Verdun allogeen pMHC tetrameer tot 1: 100 in steriele soort buffer.
- Centrifugeer celsuspensie (9 ml van stap 1.11) bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren.
- Voeg 50 pl verdund allogeen pMHC tetrameer te gepelleteerdecellen (tot 10 7 cellen). Meng door zachtjes te pipetteren. Transfer naar een steriele 5 ml tube. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2 ml soort buffer. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Decanteren.
- Resuspendeer cellen in 100 ul soort buffer. Voeg 10 ul biotine Selectie Cocktail en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ul Magnetische nanodeeltjes en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 2,5 ml soort buffer en meng voorzichtig door pipetteren. Verwijder 100 ul aliquot, over te brengen naar 5 ml tube, en blijf op ijs voor de analyse van pre-verrijking cellen.
- Plaats de buis met 5 ml van de celsuspensie in de celscheiding magneet. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig de dop van de buis. Houd de tube en magneet bij elkaar, giet de inhoud buis in een verse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buisverwijder de laatste druppels van de vloeistof.
- Haal de buis uit het magneet. Voeg 2 ml koud soort buffer en meng voorzichtig door pipetteren. Monster 10 ui celsuspensie, verdund 1: 2 (aan 10 ul) trypan blauw om cellen te tellen met een hemocytometer.
3. Voorbereiding van de T-cellen voor Single-cell flowcytometrie Cell Sorting
- Voeg koud soort buffer om alle buizen van cellen (tetramer ongelabelde, tetrameervrij gelabeld un-verrijkt, en tetrameervrij gelabeld verrijkte) om het volume tot 3 ml te brengen.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en decant buffer cellen herstellen.
- Resuspendeer afgedraaid cellen in 25 ul koude soort buffer. Voeg 5 ul humaan Fc blok. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Bereid antilichamen voor flowcytometrie sorteren. Meng 15 pl soort buffer, 15 pl anti-CD5, 15 pl anti-CD14, en 15 pl anti-CD19.
- Voeg 20 ul van antilichaam mengsel aan elke buis cellen. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
- Voeg 2 ml koude soort buffer aan elke buis.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en decant buffer cellen herstellen.
- Resuspendeer cellen bij een concentratie van 1 -2 x 10 6 cellen / ml in een soort buffer.
- Aliquot 100 pl menselijke T celkweek medium (Iscove's DMEM aangevuld met 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 ug / ml gentamycine, 50 pM 2-mercaptoethanol, 10% door warmte geïnactiveerd humaan AB serum, en 2,5 ng / ml recombinant humaan IL-2) aan elk putje van een 96 putjes met ronde bodem celcultuurplaat. Houden op het ijs.
4. Isolatie van Tetrameer gelabelde T-cellen door Single-cell flowcytometrie Sorting
- Vaststellen flowcytometrie gating parameters allogeen-pMHC tetrameer gelabelde T-cellen (Figuur 2.A) identificeren. Gebruik de pre-verrijking tetramer gelabeld fractie vast te stellen gating strategieën om wambuizen, poort op lymfocyten elimineren, uitsluiten CD19 uitdrukken van B-cellen en CD14expressie monocyten en T-cellen herkennen door CD5 expressie. Gebruik het monster niet gelabeld met tetrameer als fluorescentie min één controle om de gating voor de identificatie van tetrameervrij binding T-cellen te vestigen (met 0% van CD5 + CD14 - CD19 - cellen uit het monster niet gelabeld door tetramer binnen deze poort zou moeten vallen) .
OPMERKING: Gating strategieën die niet voldoende streng resulteert in isolatie van niet-T-cellen of T-cellen die niet specifiek zijn antigeen, terwijl te beperkte gating strategieën het aantal T-cellen geïsoleerd reduceert. - Programmeer de plaat parameters voor de enkele cel soort. Richt de sorter aan 1 CD5 + CD14 plaatsen - CD19 - tetramer + cel in elk putje. Richt de set-up te bevatten 1 negatieve controle goed (geen cellen gesorteerd in de put) en 1 positieve controle goed (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramer - cellen) plaat in elke rij (Figuur 2 B
- Het reeds flowcytometrie gating strategie en plaat configuratie, isoleren individuele tetrameer binding T-cellen direct in de 96-well plaat met een flowcytometrische cell sorter.
5. Cultuur en uitbreiding van allogeen-specifieke T-cel klonen
- Na voltooiing van celsortering, centrifuge plaat bij 600 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C Plaats cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator.
- Vortex stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microbolletjes gedurende 30 seconden om de korrels te hersuspenderen.
- Bereken hoeveelheid activator parels vereist voor het stimuleren van T-cellen verzameld (0,5 pl activator microkorrels / putje). Overdracht berekende hoeveelheid stimulator kralen een steriele 5 ml buis. Voeg 1 ml humaan T-cel kweekmedium en vortex.
- Plaats buis met microbead suspensie in magneet. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtighet dopje van de tube. Houd de tube en magneet samen, decanteren buisinhoud in een frisse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buis.
- Haal de buis uit het magneet. Voeg humane T-cel kweekmedium (100 ul medium / 0,5 pi van microbolletjes in eerste instantie toegevoegd).
- Aliquot 100 pl activator kralensuspensie aan elk putje van de 96-well plaat. Incubeer cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator.
- Monitor celgroei dagelijks door microscopisch onderzoek. Kleine clusters van prolifererende cellen kunnen microscopisch worden waargenomen na 5-7 dagen van de cultuur (Figuur 3.A).
OPMERKING: Visualisatie van T-cel kweken op dit punt kan moeilijk zijn, en de afwezigheid van waarneembare celgroepen in dit stadium niet wijzen op een gebrek aan groeiende T cellen. - 14 dagen na celisolatie, voer kweken door zorgvuldig verwijderen van 100 pl media van de bovenkant van de cultuur en vervangen door 100 μ; L verse humane T-cel kweekmedium. Doorgaan incuberen cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator.
- Monitor celgroei dagelijks door microscopisch onderzoek en evaluatie van de kleur van het kweekmedium. Grote cel clusters zichtbaar microscopisch 2-3 dagen na de mediumverversing. Macroscopisch, moet cel pellets zichtbaar tijdens de 14 dagen volgend op de medium verandering geworden.
- Op 28 dagen na celisolatie, identificeren groeiende klonen door microscopisch onderzoek. Breng 200 pi volume van de groei-positieve 96-well plaat kweken individuele putjes van een 48-well weefselkweek plaat met 200 gl humane T cel kweekmedium.
- Voeg 100 ul bevattende 12,5 ul stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microparels (bereid zoals beschreven in paragrafen 5,2-5,6). Incubeer cultuur plaat bij 37 o C in een 6% CO 2 incubator.
- Monitor cultuur groei dagelijks door microscopische examinering en evaluatie van de kleur van het kweekmedium. Bij T-cel cultuur bereikt> 2x10 6 / ml (meestal 3-5 dagen na de re-stimulatie, kan worden geschat door de dag dat de media begint te draaien stro-geel), de overdracht van cultuur om een putje van een 24-well weefselkweek plaat en voeg 500 ul humane T-celmedium.
- Op 10-14 dagen te volgen re-stimulatie, verzamel 200 ul van T-cel-cultuur tot alloantigeen specificiteit beoordelen door flowcytometrieanalyse van pMHC tetramer binding (met behulp van de etikettering en gating strategie in de hoofdstukken 3 en 4.1 beschreven).
6. Langdurig opnieuw stimuleren en cultuur van T cel klonen
- Voortdurend opnieuw stimuleren en vergroten klonale T cel kweken met de gewenste specificiteit kan elke 14 dagen. Verzamel T celculturen in een steriele 5 ml tube op dag 14 na de laatste anti-CD3 / CD28 microbead stimulatie. Combineer meerdere putjes van dezelfde T-cel kloon in een enkele buis, tot een volume van 2,5 ml. Voeg medium naar het uiteindelijke volume op 2,5 ml te brengen en meng voorzichtig door pipetteren.
- Plaats de 5 ml buis met de T-cel-cultuur in de cel scheiding magneet naar oud microbolletjes uit de cultuur te verwijderen. De dop moet losjes zijn boven op de buis. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig de dop van de buis. Houd de tube en magneet bij elkaar, giet de celsuspensie in een verse 5 ml tube. Tik niet op of schud de inhoud buis om de laatste druppels van de vloeistof te verwijderen.
- Voeg medium naar het uiteindelijke volume op 4 ml te brengen. Monster 10 pi cellen met een hemocytometer tellen.
- Herstel T cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteren supernatant. Hersuspenderen T-cellen bij 10 6 cellen / ml humane T cel kweekmedium. Breng 1 ml porties aan elk putje van een 24-well weefselkweek platen.
- Opnieuw stimuleren T-cellen door het toevoegen van 100 ul medium dat 12,5 pl stimulerende anti-CD3 / anti-CD28 microbolletjes (zoals beschreven in secties 5,2-5,6). Incubeer bij 37 ° C in een 6% CO2 incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft de productie van klonale menselijke T celculturen met gedefinieerde specificiteit allogeen via een magnetische kraal verrijking en eencellige flowcytometrie sortering strategie. Figuur 1 geeft een overzicht van het proces.
Figuur 1: Protocol overzicht Het protocol beschreven hier biedt een betrouwbare methode voor het genereren van allogeen-specifieke menselijke T-cel klonen uit perifeer bloed.. Het proces van één T cel isolatie en instellen van de celkweek verwachting ongeveer 4,5 uur duren. Uitbreiding van de T-celklonen vereist meerdere ronden van niet-specifieke T-cel stimulatie en cultuur, waarbij ze elk 14 dagen. Klonale culturen kan worden getest op alloantigeen specificiteit 28 dagen na isolatie, en culturen kan verder worden uitgebreid voor een extra test door herhaalde ronde fods van stimulatie.
De verwachte opbrengst van allogeen-specifieke T-cellen is afhankelijk van de donor, de alloantigeen gebruikt en de bijbehorende frequentie van reactieve T-cellen in de donor. Een gemiddelde gezonde donor moet 4,5-10,0 x 10 6 leukocyten / ml bloed, met ongeveer 20% T-lymfocyten Figuur 2 illustreert de resultaten van het meten van de binding van T-cellen van een HLA-DR4 (HLA-DRB1 * 04: 01. ) -negatieve donor een specifieke allogeen, aminozuurresiduen 30-48 van de HLA-A2 eiwit (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, A2 30-48) door de klasse II molecuul HLA-DR4 13.
Figuur 2: Flow cytometrie sorteren van allogeen-tetrameer gemerkte cellen voor het genereren van één celculturen. A. Flowcytometrische identificatie en isolatie van A2 30-48 / HLA-DR4 tetramer-gelabelde T-cellen van een HLA-DR4-negatieve donor. T-cellen verrijkt voor tetrameer gemerkte cellen door magnetische korrels selectie werden gesorteerd door flow cytometrie, gating op singlet CD5 + CD14 - CD19 - tetrameer + lymfocyten zoals afgebeeld. Tetrameervrij ongelabelde cellen werden gebruikt als een fluorescentie-minus element naar vast gating voor tetrameer + cellen. B. tetrameer + T-cellen werden gesorteerd in een 96-putjes met ronde bodem weefselkweek plaat met 100 gl humane T cel kweekmedium. De plaat set-up opgenomen positieve en negatieve controle putten zoals aangegeven.
Van een startnummer van 2,0 x 10 7 leukocyten vonden we een frequentie van allogeen-specifieke cellen van 1/4776 T-cellen:
1.1x10 6 tetrameervrij verrijkte cellen x 0,992 (singlets) x 0,744 (lymfocyten) x 0,477 (CD5 + CD14 - CD19 -) x 0,0034 (tetrameer + T-cellen) / 2,0 x10 7 perifeer bloed leukocyten x 0,314 (pre-verrijking CD3 +)
Vanaf de start 2.0x10 7 leukocyten waren we in staat om 88 individuele tetrameervrij gelabelde T-cellen te isoleren voor cultuur. Na 2 rondes van anti-CD3 / CD28 microbead stimulatie en cultuur zoals beschreven identificeerden we 2 groei-positieve kweken door microscopisch onderzoek (representatief voorbeeld van de groei van 10 dagen na enkelvoudige isolatie en kweek cel weergegeven in Figuur 3.A). Klonale kweken werden uitgebreid met 1 ml beschreven en allogeen specificiteit werd bepaald door het onderzoeken van binding van het A2 30-48 / HLA-DR4 tetrameer (Figuur 3.B).
Figuur 3. Evaluatie van T-cel kweken. A. Microscopisch onderzoek van 96-well plaat T-celkweken. Representatief voorbeeld van T-cel cultuur 10dagen na isolatie van individuele T-cellen door flowcytometrie sorteren. Cellen werden gestimuleerd met 0,5 pi anti-CD3 / CD28 microparels / putje (voorbeelden aangegeven door pijlpunt) in een volume van 200 gl humane T cel kweekmedium. B. T-cellen allogeen specificiteit van klonale T cel cultures beoordeeld door flowcytometrie analyse van pMHC tetrameer labeling. Klonale T cel cultures flowcytometrie geïsoleerd CD5 + CD14 - CD19 - A2 30-48 / HLA-DR4 tetrameer + lymfocyten werden onderzocht op A2 30-48 / HLA-DR4 tetrameer bindend na 4 weken in vitro kweek. Tetrameervrij ongelabelde cellen werden gebruikt als een fluorescentie-minus element naar vast gating voor tetrameer + cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10 g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
References
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
