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Immunology and Infection

परिधीय रक्त से मानव Alloantigen विशेष टी कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52257
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pathology, University of California, San Diego

Introduction

टी लिम्फोसाइट अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण घटक हैं. टी कोशिकाओं को न केवल सीधे प्रेरक तंत्र की एक किस्म के माध्यम से रोगज़नक़ों को रक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया mediating, लेकिन यह भी सक्रिय रूप से प्रतिरक्षात्मक स्व-सहिष्णुता बनाए रखने और प्रतिरक्षा प्रणाली में अन्य कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के निर्देशन के लिए जिम्मेदार हैं. इन कार्यों टी सेल रिसेप्टर (TCR) बंधाव, साइटोकिन्स और chemokines, और चयापचयों 1 सहित एकीकृत संकेतों के एक नंबर के माध्यम से निर्देशित कर रहे हैं. यह अनुकूली उन्मुक्ति में टी सेल की भूमिका को परिभाषित करता है कि विशेषता विशिष्टता प्रदान करता है के रूप में इन संकेतों के, TCR, विशेष महत्व का है. एक TCR टी सेल प्रेरक समारोह आरंभ संकेत है कि उपलब्ध कराने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील तरीके से एमएचसी (मानव ortholog एचएलए) अणु (pMHC परिसरों) द्वारा प्रस्तुत रैखिक पेप्टाइड एंटीजन के साथ सूचना का आदान प्रदान. pMHC ligands के साथ TCR बातचीत की जैव रासायनिक मापदंडों टी के लिए विशिष्टता न केवल प्रदानसेल सक्रियण, लेकिन यह भी बाद में टी सेल समारोह 2 पर एक गुणात्मक प्रभाव पड़ता है. इस प्रकार, का अध्ययन टी सेल समारोह अक्सर परिभाषित प्रतिजनी विशिष्टता के साथ प्रतिरूप टी कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं की जांच की आवश्यकता है.

10 8 अलग αβTCRs 3-4 - लगभग 10 से 12 αβ टी कोशिकाओं से युक्त मानव टी सेल डिब्बे, एक अनुमान के अनुसार 10 7 में शामिल है. यह विविध प्रदर्शनों की सूची रक्षात्मक प्रतिरक्षा के लिए एक टी सेल प्रतिक्रिया की जरूरत होगी कि संभावित रोगज़नक़ों से पेप्टाइड्स के विशाल सरणी की मान्यता के लिए अवसर प्रदान करता है. कि प्रतिजन 5 से पहले प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अभाव में 10 -7 - यह आत्म-एमएचसी द्वारा प्रस्तुत एक दिया विदेशी प्रतिजन का जवाब देने के टी कोशिकाओं की आवृत्ति 10 -4 के आदेश पर है कि अनुमान है. भोले टी सेल प्रदर्शनों की सूची पेप्टाइड एंटीजन और सीमा प्रतिक्रिया पेश स्व-एमएचसी पहचान करने की क्षमता सुनिश्चित करने के लिए Thymic चयन के आकार का हैआत्म-पेप्टाइड एंटीजन के खिलाफ ivity, रक्षात्मक प्रतिरक्षा 2 मध्यस्थता के लिए संभावित उपयोगिता को अधिकतम. इस के उल्लंघन जेट, एक अपेक्षाकृत बड़े आवृत्ति, 10 -3 से डिजाइन में हालांकि, - immunologically अनुभवहीन व्यक्तियों से टी कोशिकाओं की 10 -4, विदेशी MHC अणुओं के रूप में भी वे उपस्थित अंतर्जात पेप्टाइड्स दोनों को पहचानने, एलोजेनिक कोशिकाओं के साथ उत्तेजना का जवाब 6. एलोजेनिक pMHC ligands के मान्यता स्व-एमएचसी द्वारा प्रस्तुत विदेशी एंटीजन की मान्यता के लिए संरचनात्मक रूप समान है; TCR एलोजेनिक MHC अणु के रूप में अच्छी तरह से प्रस्तुत पेप्टाइड 7 दोनों के साथ महत्वपूर्ण जैव रासायनिक बातचीत में आता है. pMHC की विविधता से एलोजेनिक उत्तेजना परिणाम के लिए टी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की मजबूत प्रकृति एलोजेनिक कोशिकाओं 8 की सतह पर मौजूद परिसरों. यह प्रत्येक एमएचसी लगभग 2 एक्स 10 4 अलग अंतर्जात पेप्टाइड एंटीजन 9 प्रस्तुत अनुमान है. इस खएलोजेनिक उत्तेजना के जवाब के readth टी सेल alloreactivity से उत्पन्न, इस तरह मेजबान रोग (GVHD) बनाम allograft अस्वीकृति या भ्रष्टाचार के रूप में नैदानिक ​​प्रासंगिक विकृति का एक महत्वपूर्ण पहलू है.

मानव टी सेल alloreactive प्रतिक्रियाओं का अध्ययन परंपरागत एलोजेनिक कोशिकाओं के साथ उत्तेजना के बाद भोले टी कोशिकाओं की पॉलीक्लोनल प्रतिक्रियाओं की जांच पर भरोसा किया है. कमजोर पड़ने सीमित के साथ संयुक्त उसी एलोजेनिक सेल लाइन के साथ दोहराया उत्तेजना एलोजेनिक एचएलए 10 से परिभाषित मान्यता के साथ प्रतिरूप टी कोशिकाओं पैदा करने में सक्षम है का विश्लेषण करती है. अंतर्जात pMHC के बड़े और विविध प्रदर्शनों की सूची एचएलए टी कोशिकाओं की एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची को उत्तेजित करता है एक दिया एलोजेनिक के लिए वर्तमान परिसरों के रूप में हालांकि, इस दृष्टिकोण, व्यक्तिगत एलोजेनिक pMHC ligands के लिए प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए समस्याग्रस्त है. यह थोक आबादी उत्तेजना और सीमित कमजोर पड़ने दृष्टिकोण वांछित reacti साथ टी कोशिकाओं को अलग करने के क्लोन की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग की आवश्यकता होगीएक भी pMHC ligand के खिलाफ vity. इसके अतिरिक्त, एक व्यक्ति एलोजेनिक pMHC ligand का जवाब देने के टी कोशिकाओं की आवृत्ति एक दिया प्रतिजन के लिए उत्तरदायी मानव टी सेल क्लोन के कुशल पीढ़ी के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है, जो भोले टी सेल आबादी के बीच अपेक्षाकृत कम है.

पहचान और पॉलीक्लोनल आबादी से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का अलगाव फ्लोरोफोरे लेबल pMHC multimers 11 के विकास से सक्षम किया गया है. यह दृष्टिकोण एक streptavidin लेबल फ्लोरोफोरे के बंधन से चिह्नित कर रहे हैं जो पुनः संयोजक घुलनशील biotinylated MHC अणुओं में लोड विशिष्ट पेप्टाइड एंटीजन का इस्तेमाल करता. PMHC की Multimerization घुलनशील pMHC ligands के लिए TCR का आंतरिक रूप से कम (माइक्रोन) आत्मीयता के लिए मुआवजा, उत्सुकता बढ़ जाती है. लेबल कोशिकाओं की पहचान की और फ्लो से अलग किया जा सकता है. हालांकि, इस दृष्टिकोण अभी भी आम तौर पर कर रहे हैं, जो भोले टी सेल आबादी के बीच प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के कम आवृत्ति द्वारा सीमित हैसबसे प्रवाह cytometers पर सटीक पहचान और मात्रा का ठहराव की सीमा से कम परिमाण के आदेश. इस सीमा को संबोधित करने के लिए, टेट्रामर लेबल कोशिकाओं के लिए pMHC टेट्रामर लेबलिंग और बाद में चुंबकीय मनका संवर्धन की एक विधि 12 विकसित किया गया है. इस विधि विश्वसनीय पहचान, गणना, और कम आवृत्ति प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का अलगाव का प्रदर्शन किया है.

इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से व्यक्तिगत एलोजेनिक pMHC ligands के लिए जवाब है कि मानव टी सेल क्लोन की पीढ़ी के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. प्रोटोकॉल एकल सॉर्ट किया गया कोशिकाओं से टी सेल क्लोन का उत्पादन (सक्षम करने के लिए सेल छँटाई प्रवाह cytometry और मानव टी कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति के लिए एक मजबूत विधि के साथ alloantigen-विशिष्ट मानव टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए multimer लेबलिंग और संवर्धन pMHC (एचएलए) लागू होता है चित्रा 1 में सिंहावलोकन).

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल मानव स्वयंसेवकों से परिधीय रक्त के नमूनों के उपयोग की आवश्यकता है. मानव विषयों के साथ सभी शोध की समीक्षा की और हेलसिंकी की घोषणा (2013) और स्वास्थ्य बीमा पोर्टेबिलिटी और 1996 की जवाबदेही अधिनियम का अनुपालन सुनिश्चित करने के लिए एक मानव अध्ययन संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए.

पूरे रक्त से टी कोशिकाओं की 1. अलगाव

  1. शुरू करने से पहले कमरे के तापमान के घनत्व ढाल मध्यम गर्म है. विभाज्य 2-4 बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों में घनत्व ढाल माध्यम की 4 मिलीलीटर (1 ट्यूब प्रत्येक 10 मिलीलीटर पतला खून की कुल मात्रा के लिए इस्तेमाल किया जाएगा).
  2. 1-2 सोडियम हेपरिन स्प्रे में रक्त का 10-20 मिलीलीटर लेपित (हरा टॉप) शिरापरक रक्त संग्रह ट्यूबों प्राप्त करते हैं. प्रशिक्षित व्यक्तियों की देखरेख में मानव नमूनों को इकट्ठा करने और एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के अनुसार प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी.
  3. 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब के बाहर साफ कर लें. ध्यान फाई के सबसे ऊपर हटानेसंग्रह ट्यूबों lled और एक बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रक्त छानना.
  4. प्रत्येक रक्त संग्रह ट्यूब को 10 मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें. , पीबीएस लीजिए decanted पूरे रक्त को जोड़ने के लिए, और धीरे मिश्रण.
  5. 25 μl मानव टी सेल संवर्धन कॉकटेल / 2 मिलीलीटर कुल मात्रा में जोड़ें. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  6. धीरे घनत्व ढाल माध्यम के शीर्ष पर 1 पतला खून: एक 10 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, 1 की 10 एमएल के लिए ऊपर परत. घनत्व ढाल माध्यम की सतह को बाधित नहीं करने के लिए सावधान रहें.
  7. 20 ओ सी पर अपकेंद्रित्र स्तरित रक्त और घनत्व ढाल मध्यम 20 मिनट के लिए 1200 XG पर
  8. घनत्व ढाल मध्यम और घनत्व ढाल मध्यम और पतला प्लाज्मा के बीच इंटरफेस में leukocytes की परत के बीच इंटरफेस को बाधित नहीं करने के ख्याल रख रही है, अपकेंद्रित्र से ट्यूबों निकालें. एक 5 मिलीलीटर विंदुक का प्रयोग, ध्यान ल्युकोसैट परत जमा है और एक नया बाँझ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार टब के लिए स्थानांतरणई.
  9. 50 मिलीलीटर को एकत्र PBL की मात्रा लाने और धीरे मिश्रण करने के लिए पीबीएस जोड़ें.
  10. 20 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र छानना.
  11. Resuspend बफर (बाँझ फ़िल्टर पीबीएस 1% BSA युक्त) छँटाई cytometry के 10 मिलीलीटर बाँझ प्रवाह में कोशिकाओं pelleted. नमूना सेल निलंबन के 10 μl, 01:10 पतला एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए trypan नीले (90 μl को जोड़ने) (उम्मीद की उपज 1 - 4 x 10 6 कोशिकाओं पूरे रक्त का / ट्यूब).
    1. 5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण, 1 मिलीलीटर विभाज्य निकालें, और टेट्रामर द्वारा लेबल नहीं टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए बर्फ पर रहते हैं. बर्फ पर सेल निलंबन रखें.

Alloantigen विशेष टी कोशिकाओं की 2. चुंबकीय संवर्धन

  1. 1 को alloantigen pMHC टेट्रामर पतला: 100 बाँझ प्रकार का बफर में.
  2. अपकेंद्रित्र सेल निलंबन 20 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर (कदम 1.11 से 9 मिलीलीटर) छानना.
  3. Pelleted को pMHC टेट्रामर alloantigen पतला के 50 μl जोड़ेंकोशिकाओं (10 7 कोशिकाओं तक). कोमल pipetting द्वारा मिक्स. एक बाँझ 5 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. क्रमबद्ध बफर 2 मिलीलीटर जोड़ें. 20 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र छानना.
  5. 100 μl प्रकार का बफर में कोशिकाओं Resuspend. 10 μl बायोटिन चयन कॉकटेल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. 5 μl चुंबकीय नैनोकणों जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. 2.5 मिलीलीटर प्रकार का बफर और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण जोड़ें. 5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण, 100 μl विभाज्य निकालें, और पूर्व संवर्धन कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए बर्फ पर रहते हैं.
  8. सेल जुदाई चुंबक में सेल निलंबन युक्त 5 मिलीलीटर ट्यूब रखें. टोपी ट्यूब के ऊपर शिथिल होना चाहिए. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  9. धीरे ट्यूब से टोपी को हटा दें. एक साथ ट्यूब और चुंबक होल्डिंग, एक ताजा 5 मिलीलीटर ट्यूब में ट्यूब सामग्री छानना. नल या ट्यूब सामग्री को हिला न करेंतरल के अंतिम ड्रॉप हटा दें.
  10. चुंबक से ट्यूब निकालें. 2 मिलीलीटर ठंड प्रकार का बफर जोड़ें और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण. 2 एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए trypan नीले (10 μl को जोड़ने): नमूना सेल निलंबन के 10 μl, 1 पतला.

एकल कोशिका फ्लो सेल छँटाई के लिए टी कोशिकाओं की 3. तैयारी

  1. कोशिकाओं के सभी ट्यूबों को ठंड प्रकार का बफर जोड़ें (टेट्रामर लेबल हटाया गया, टेट्रामर लेबल समृद्ध संयुक्त राष्ट्र, और टेट्रामर लेबल समृद्ध) 3 मिलीलीटर मात्रा लाने के लिए.
  2. 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र और निथारना बफर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
  3. 25 μl ठंड प्रकार का बफर में pelleted कोशिकाओं Resuspend. 5 μl मानव एफसी ब्लॉक जोड़ें. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  4. फ्लो छँटाई के लिए एंटीबॉडी तैयार करें. 15 μl प्रकार का बफर, 15 μl विरोधी CD5, 15 μl विरोधी CD14, और 15 μl विरोधी CD19 मिलाएं.
  5. कोशिकाओं के प्रत्येक ट्यूब एंटीबॉडी मिश्रण के 20 μl जोड़ें. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  6. प्रत्येक ट्यूब ठंड प्रकार का बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. 4 ओ सी पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र और निथारना बफर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए.
  8. क्रमबद्ध बफर में 1 -2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में कोशिकाओं Resuspend.
  9. मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम से विभाज्य 100 μl (Iscove के DMEM के 2 मिमी Glutamax, 10 मिमी HEPES, 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / gentamycin, 50 माइक्रोन 2-मर्केप्टोइथेनाल, 10% गर्मी निष्क्रिय मानव अटल बिहारी सीरम, और 2.5 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव के साथ पूरक आईएल -2) एक 96 अच्छी तरह से गोल नीचे सेल संस्कृति प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए. बर्फ पर रखें.

एकल कोशिका फ्लो निम्न द्वारा tetramer लेबल टी कोशिकाओं की 4. अलगाव

  1. Alloantigen-pMHC टेट्रामर लेबल टी कोशिकाओं (चित्रा 2.) की पहचान करने के लिए gating के मापदंडों प्रवाह cytometry स्थापित करना. बी कोशिकाओं और CD14 व्यक्त CD19 बहिष्कृत, लिम्फोसाइटों पर दोहरी, गेट को खत्म करने के लिए रणनीति gating की स्थापना के लिए पूर्व संवर्धन टेट्रामर लेबल अंश का प्रयोग करेंmonocytes व्यक्त, और CD5 अभिव्यक्ति द्वारा टी कोशिकाओं की पहचान. (टेट्रामर द्वारा लेबल नहीं नमूना से कोशिकाओं को इस फाटक के भीतर गिर चाहिए - - CD19 CD5 + CD14 के 0%) के साथ टेट्रामर बाध्यकारी टी कोशिकाओं की पहचान के लिए gating स्थापित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति रूप टेट्रामर शून्य से एक नियंत्रण के साथ लेबल नहीं नमूना का प्रयोग करें .
    नोट: पीढ़ी प्रतिबंधात्मक gating रणनीतियों पृथक टी कोशिकाओं की संख्या कम हो जाएगा, जबकि विशिष्ट प्रतिजन नहीं कर रहे हैं कि गैर-टी कोशिकाओं या टी कोशिकाओं का अलगाव में परिणाम होगा पर्याप्त रूप से सख्त नहीं हैं कि रणनीतियों Gating.
  2. एकल कोशिका प्रकार के लिए थाली मापदंडों कार्यक्रम. CD19 - - प्रत्येक कुएं में टेट्रामर + सेल 1 CD5 + CD14 स्थान के लिए सॉर्टर प्रत्यक्ष. प्रत्येक पंक्ति में (चित्रा 2.B अच्छी तरह से (कोशिकाओं - CD19 - - टेट्रामर 100 CD5 + CD14) अच्छी तरह से 1 नकारात्मक नियंत्रण (कोई कोशिकाओं अच्छी तरह से में हल) और 1 सकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए स्थापित की थाली प्रत्यक्ष
  3. Gating रणनीति और प्लेट सेटअप cytometry स्थापित प्रवाह का उपयोग करना, सीधे एक प्रवाह cytometric सेल सॉर्टर का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली में व्यक्तिगत टेट्रामर बाध्यकारी टी कोशिकाओं को अलग.

5. संस्कृति और Alloantigen विशेष टी सेल क्लोन का विस्तार

  1. 20 ओ सी पर सेल छँटाई, 5 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र थाली के पूरा होने के बाद एक 6% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में जगह संस्कृति थाली.
  2. 30 सेकंड के लिए भंवर उत्तेजक विरोधी CD3 / विरोधी CD28 microbeads मोती resuspend.
  3. एकत्र टी कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए आवश्यक उत्प्रेरक मोतियों की मात्रा (उत्प्रेरक microbeads / अच्छी तरह से 0.5 μl) की गणना. एक बाँझ 5 मिलीलीटर ट्यूब को उत्तेजक मोतियों की गणना की मात्रा स्थानांतरण. 1 मिलीलीटर मानव टी सेल संस्कृति मध्यम और भंवर जोड़ें.
  4. चुंबक में microbead निलंबन के साथ ट्यूब रखें. टोपी ट्यूब के ऊपर शिथिल होना चाहिए. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. धीरे हटानेट्यूब से टोपी. एक ताजा 5 मिलीलीटर ट्यूब में, एक साथ निथारना ट्यूब सामग्री ट्यूब और चुंबक पकड़े. नल या ट्यूब सामग्री को हिला नहीं करते.
  6. चुंबक से ट्यूब निकालें. मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम जोड़ें (microbeads की 100 μl मध्यम / 0.5 μl शुरू में जोड़ा).
  7. विभाज्य 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए उत्प्रेरक मनका निलंबन की 100 μl. एक 6% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में संस्कृति की थाली सेते हैं.
  8. सूक्ष्म परीक्षा द्वारा दैनिक सेल के विकास की निगरानी. संस्कृति के 7 दिनों (चित्रा 3.) - proliferating कोशिकाओं के छोटे समूहों 5 के बाद microscopically देखा जा सकता है.
    नोट: इस बिंदु पर टी सेल संस्कृतियों का दृश्य मुश्किल हो सकता है, और इस स्तर पर नमूदार सेल समूहों की अनुपस्थिति से बढ़ टी कोशिकाओं की कमी का संकेत नहीं हो सकता है.
  9. सेल अलगाव के बाद 14 दिनों में, ध्यान से संस्कृति के ऊपर से दूर और मीडिया के 100 μl को हटाने के द्वारा फ़ीड संस्कृतियों 100 μ साथ की जगह; एल ताजा मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम से. एक 6% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में संस्कृति की थाली incubating जारी रखें.
  10. सूक्ष्म परीक्षा और संस्कृति के माध्यम से रंग का मूल्यांकन द्वारा दैनिक सेल के विकास की निगरानी. 3 दिन मध्यम परिवर्तन के बाद - बड़े सेल समूहों microscopically 2 दिखाई जानी चाहिए. Macroscopically, सेल छर्रों मध्यम बदलाव के बाद 14 दिनों के दौरान दिखाई बन जाना चाहिए.
  11. सेल अलगाव निम्नलिखित 28 दिनों में, सूक्ष्म परीक्षण से बढ़ रही क्लोन की पहचान. 200 μl मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम से युक्त एक 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की व्यक्तिगत कुओं के विकास पॉजिटिव 96 अच्छी तरह से थाली संस्कृतियों के 200 μl मात्रा स्थानांतरण.
  12. उत्तेजक विरोधी CD3 / विरोधी CD28 microbeads की 12.5 μl युक्त 100 μl जोड़ें (- 5.6 वर्गों 5.2 में वर्णित के रूप में तैयार). एक 6% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी में संस्कृति की थाली सेते हैं.
  13. सूक्ष्म पूर्व से दैनिक संस्कृति विकास मॉनिटरamination और संस्कृति के माध्यम से रंग का मूल्यांकन. टी सेल संस्कृति> 2x10 6 / एमएल तक पहुँच जाता है (आम तौर पर 3-5 दिनों फिर से उत्तेजना के बाद, मीडिया शुरू होता है उस दिन से अनुमान लगाया जा सकता पुआल पीले मोड़) एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की एक अच्छी तरह से करने के लिए, स्थानांतरण संस्कृति और 500 μl मानव टी सेल मध्यम जोड़ें.
  14. 10-14 दिनों में pMHC टेट्रामर का विश्लेषण बंधन (धारा 3 और 4.1 में वर्णित लेबलिंग और gating रणनीति का प्रयोग करके) प्रवाह cytometry द्वारा alloantigen विशिष्टता का आकलन करने के लिए टी सेल संस्कृति की 200 μl इकट्ठा, फिर से उत्तेजना का पालन करें.

6. लंबे समय तक फिर से उत्तेजना और संस्कृति टी सेल क्लोन की

  1. लगातार हर 14 दिन हो सकता वांछित विशिष्टता के साथ प्रतिरूप टी सेल संस्कृतियों फिर से उत्तेजित और विस्तार. पिछले विरोधी CD3 / CD28 microbead उत्तेजना अगले दिन 14 पर एक बाँझ 5 मिलीलीटर ट्यूब में टी सेल संस्कृतियों लीजिए. ऊपर 2.5 मिलीलीटर की मात्रा के लिए, एक एकल ट्यूब में एक ही टी सेल क्लोन के कई कुओं का मिश्रण. 2.5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा लाने और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण करने के लिए मध्यम जोड़ें.
  2. संस्कृति से पुराने microbeads दूर करने के लिए सेल जुदाई चुंबक में टी सेल संस्कृति युक्त 5 मिलीलीटर ट्यूब रखें. टोपी ट्यूब के ऊपर शिथिल होना चाहिए. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. धीरे ट्यूब से टोपी को हटा दें. एक साथ ट्यूब और चुंबक होल्डिंग, एक ताजा 5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन छानना. नल या तरल के अंतिम ड्रॉप दूर करने के लिए ट्यूब सामग्री को हिला नहीं करते.
  4. 4 मिलीलीटर अंतिम मात्रा लाने के लिए मध्यम जोड़ें. नमूना 10 μl एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती करने के लिए.
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा टी कोशिकाओं को ठीक.
  6. छानना सतह पर तैरनेवाला. 10 6 कोशिकाओं / एमएल मानव टी सेल संस्कृति माध्यम में resuspend टी कोशिकाओं. स्थानांतरण 1 एक 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से मिलीलीटर aliquots.
  7. उत्तेजक विरोधी CD3 / एक की 12.5 μl युक्त 100 μl मीडिया जोड़कर टी कोशिकाओं को उत्तेजित पुनःNTI-CD28 microbeads (- 5.6 के रूप में वर्गों 5.2 में वर्णित). एक 6% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ओ सी सेते हैं.

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Representative Results

रणनीति छँटाई cytometry के एक चुंबकीय मनका संवर्धन और एकल कोशिका प्रवाह के माध्यम से विशिष्टता alloantigen परिभाषित साथ इस प्रोटोकॉल प्रतिरूप मानव टी सेल संस्कृतियों की पीढ़ी का वर्णन करता है. 1 प्रक्रिया की एक रूपरेखा प्रदान करता है चित्रा.

चित्रा 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल सिंहावलोकन प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित परिधीय रक्त से alloantigen-विशिष्ट मानव टी सेल क्लोन की पीढ़ी के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है.. एक टी सेल अलगाव और सेल संस्कृति की स्थापना की प्रक्रिया लगभग 4.5 घंटा लेने की उम्मीद है. टी सेल क्लोन का विस्तार गैर विशिष्ट टी सेल उत्तेजना और संस्कृति, प्रत्येक लेने के 14 दिनों के कई दौर की आवश्यकता है. प्रतिरूप संस्कृतियों 28 दिनों के अलगाव के बाद alloantigen विशिष्टता के लिए परीक्षण किया जा सकता है, और संस्कृतियों आगे दोहराया roun द्वारा अतिरिक्त परीक्षण के लिए विस्तारित किया जा सकताउत्तेजना के डी एस.

alloantigen विशेष टी कोशिकाओं की उम्मीद की उपज दाता, इस्तेमाल किया alloantigen, और दाता में प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की इसी आवृत्ति पर निर्भर करेगा. एक औसत स्वस्थ दाता होगा 4.5-10.0 एक्स 10 6 ल्यूकोसाइट्स लगभग 20% टी lymphocytes के साथ रक्त का / एमएल, 2 * एक एचएलए DR4 (एचएलए-DRB1 से 04 टी कोशिकाओं के बंधन को मापने के परिणाम दिखाता चित्र: 01. एक विशिष्ट alloantigen के लिए) -negative दाता, अमीनो एसिड के अवशेष वर्ग द्वितीय अणु एचएलए DR4 13 द्वारा प्रस्तुत एचएलए-ए 2 प्रोटीन (DTQFVRFDSDAASQRMEPR, ए 2 30-48) के 30-48.

चित्रा 2
चित्रा 2: एकल कक्ष संस्कृतियों पैदा करने के लिए alloantigen टेट्रामर लेबल कोशिकाओं की छँटाई प्रवाह cytometry. ए 2 30-48 / एचएलए DR4 tetrame की ए प्रवाह cytometric पहचान और अलगावएक एचएलए DR4 नकारात्मक दाता से टी कोशिकाओं आर लेबल. सचित्र रूप टेट्रामर + लिम्फोसाइटों - CD19 - चुंबकीय मनका चयन से टेट्रामर लेबल कोशिकाओं के लिए समृद्ध टी कोशिकाओं स्वेटर CD5 + CD14 पर gating, प्रवाह cytometry द्वारा हल किया गया. Tetramer-unlabeled कोशिकाओं टेट्रामर + कोशिकाओं के लिए gating स्थापित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति-शून्य से एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. बी tetramer + टी कोशिकाओं 100 μl मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम से युक्त एक 96 अच्छी तरह से दौर नीचे टिशू कल्चर प्लेट में हल किया गया. संकेत के रूप में थाली सेट अप सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण कुओं शामिल थे.

2.0 10 x 7 leukocytes के एक प्रारंभिक नंबर से हम 1/4776 टी कोशिकाओं की alloantigen-विशिष्ट कोशिकाओं की एक आवृत्ति पाया:

(- CD19 - CD5 + CD14) एक्स .0034 (टेट्रामर + टी कोशिकाओं) / 2.0 एक्स 1.1x10 6 टेट्रामर समृद्ध कोशिकाओं एक्स .992 (singlets) 0.744 (लिम्फोसाइटों) 0.477 X X10 7 परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स (पूर्व संवर्धन CD3 +) 0.314 x

शुरू करने 2.0x10 7 ल्यूकोसाइट्स से हम संस्कृति के लिए 88 अलग-अलग टेट्रामर लेबल टी कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम थे. के रूप में वर्णित विरोधी CD3 / CD28 microbead उत्तेजना और संस्कृति के 2 दौर के बाद हम सूक्ष्म परीक्षा (10 दिन चित्रा 3. में दिखाया एकल कक्ष अलगाव और संस्कृति के बाद विकास के प्रतिनिधि उदाहरण) द्वारा 2 विकास पॉजिटिव संस्कृतियों की पहचान की. प्रतिरूप संस्कृतियों वर्णित के रूप में 1 मिलीलीटर के लिए विस्तार किया गया है, और alloantigen विशिष्टता ए 2 30-48 / एचएलए DR4 टेट्रामर (चित्रा 3.B) के बंधन का परीक्षण करके मूल्यांकन किया गया था.

चित्रा 3
टी सेल संस्कृतियों की चित्रा 3. मूल्यांकन. 96 अच्छी तरह से थाली टी सेल संस्कृतियों के ए सूक्ष्म परीक्षण. टी सेल संस्कृति 10 के प्रतिनिधि उदाहरणछँटाई प्रवाह cytometry द्वारा व्यक्तिगत टी कोशिकाओं के अलगाव के बाद दिन. कोशिकाओं 200 μl मानव टी सेल संस्कृति के माध्यम से एक मात्रा में (नोक ने संकेत उदाहरण) / अच्छी तरह से 0.5 μl विरोधी CD3 / CD28 microbeads के साथ प्रेरित किया गया. PMHC का प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन प्रतिरूप टी सेल संस्कृतियों का बी टी सेल alloantigen विशिष्टता टेट्रामर लेबलिंग. CD19 - - पृथक CD5 + CD14 प्रवाह cytometry का प्रतिरूप टी सेल संस्कृतियों ए 2 30-48 / एचएलए DR4 टेट्रामर + लिम्फोसाइटों में इन विट्रो संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद बाध्यकारी ए 2 30-48 / एचएलए DR4 टेट्रामर के लिए जांच की गई. Tetramer-unlabeled कोशिकाओं टेट्रामर + कोशिकाओं के लिए gating स्थापित करने के लिए एक प्रतिदीप्ति-शून्य से एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm Becton, Dickenson and Company 366480
Lymphoprep Stemcell Technologies 7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit Stemcell Technologies 15061
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg Corning 21-031-CV
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
EDTA Sigma-Aldrich E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer NIH Tetramer Facility NA
EasySep Biotin Selection Kit Stemcell Technologies 18553
EasySep Selection magnet Stemcell Technologies 18000
TruStain FcX Human Fc blocking solution Biolegend 422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) Biolegend 300621
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) Biolegend 325603
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) Biolegend 302205
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine Corning 15-016-CV
HEPES Corning 25-060-CI
b-Mercaptoethanol  Life Technologies 21985-023
Glutamax Life Technologies 35050061
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) Omega Scientific GT-50
Human AB serum, male donor Omega Scientific HS-30
Recombinant human IL-2 Peprotech AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 Life Technologies 11131D
Media
Cell sorting buffer
PBS, pH 7.4 1 L
BSA 10 g
EDTA (0.5 M) 2 ml
Human T Cell Culture Medium
Iscove's DMEM 351.6 ml
Heat-inactivated human AB serum 40 ml
HEPES (1 M) 4 ml
Glutamax (100x) 4 ml
Gentamicin (50 mg/ml) 0.4 ml
b-mercaptoethanol (14.3 M) 1.4 ml
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) 1 ml

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 93 टी सेल इम्यूनोलॉजी मानव सेल संस्कृति प्रत्यारोपण प्रवाह cytometry alloreactivity
परिधीय रक्त से मानव Alloantigen विशेष टी कोशिकाओं की पीढ़ी
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Jama, B. P., Morris, G. P.… More

Jama, B. P., Morris, G. P. Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (93), e52257, doi:10.3791/52257 (2014).

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