补偿性增长龙鼠标肺切除型号

Introduction

肺的主要功能是提供一个有机体和大气之间的氧气和二氧化碳交换。在人类中，一台主机的先天和后天条件导致降低的肺表面面积导致肺功能受损。虽然宿主疗法，如吸入皮质类固醇，支气管扩张剂，补充氧气和慢性机械通气用于减轻肺功能受损^1-3的后果，提供了理想的治疗，这些条件将促进功能的肺组织的再生- 即，肺再生。

哺乳动物组织再生已经有据可查。非洲刺鼠可再生大面积皮肤无疤痕形成^4。在人类的末节指骨可再生损伤后或截肢^5-7。继肺（PNX），肺代偿出现增长小鼠⁸只^9，做GS ¹⁰和人类^11。根据定义，补偿性肺生长包括现有的空域与扩展相关的微循环¹²不仅扩大这些扩大空域，但重新septation。基因表达分析表明，这种模式概括很多肺发育¹³的信号事件。四周后小鼠PNX，肺泡表面面积相当于假手术的动物^14。在这个手稿中，我们描述鼠标PNX和假PNX程序。

Protocol

注：动物使用声明：在本研究中的所有程序均经批准，并按照机构动物使用及护理委员会（IACUC）在辛辛那提儿童医院的指导方针进行。八周龄C57BL / 6J雄性小鼠从Jackson实验室（巴港，ME）中获得，并使其适应环境，使用前一个星期。直到手术，将动物饲养在无病原体的阻挡设施，并提供高压灭菌食物和过滤水的广告libdium。每个鼠笼用专用的空气和水的供给，并提供维持在12小时昼夜周期。以下从手术中恢复，小鼠保持在笼子里与过滤上衣，提供蒸压州城广告libidum，并提供了从一瓶水过滤水。

1.准备仪器

1. 使用曲别针和大头针6皮肤拉钩。扭曲拉直回形针在纸张的针柄，升屋檐5cm的直钢丝的一端，使单个0.5厘米“U”形钩在导线的末端。
2. 使用保鲜膜约15×15厘米见方的手术单。准备每只小鼠1敷料。把一纸塔在每个包装之间。
3. 消毒所有的手术工具以及一叠12×12英寸的软木砖，纱布，棉花拭子。

2.鼠标准备

1. 诱导麻醉，用2％异氟醚。称量动物。
2. 在一个专门的手术准备区刮胡子左胸部和颈部电气剃须刀。
3. 申请一滴人工泪液软膏鼠标的眼睛。
4. 净化颈部和左胸部与洗必泰和异丙醇。重复两次以上。

3.鼠标奥罗气管插管和机械通气

1. 有一个非无菌手术技术人员代替鼠标仰卧在预热手术区。
2. 通过记录缺乏爪子掐的响应确认麻醉深度。
3. 洗手，并穿上手术装束，口罩，帽子后，穿上无菌手术手套。
4. 立体裁剪，并使用无菌技术后，使超过前中期的脖子，露出喉部有1厘米的垂直切口。轻轻缩回带状肌与弯曲的，锯齿10厘米钳，并通过与一个直剪刀的前端扩展的带状肌暴露喉和气管。
5. 口服插入一个22克钝尖血管导管插入中期气管（ 图1A）和目视确认放置（ 图1B）。维持麻醉和通风用1-3％异氟醚通过啮齿动物呼吸机（225微升每冲程;每分钟200斯托克斯）。采用15厘米H ₂ O的压力极限

4.鼠标肺切除

1. 莱鼠标在右侧卧位，用鼠标的背面朝上操作员（左侧上）。用自密封的保鲜膜作为无菌的悬垂性。切割通过悬垂性好，用钝尖剪子弯，使长切割平行于肋骨2厘米，在^第 4和^第 5肋间。将钝头剪刀弯曲和底层的肋骨和肋间肌肉解剖皮肤了。
2. 缩回四个拉钩皮肤暴露正方形1.5×1.5cm的外科窗口（ 图2A）。固定拉钩，以软木板上。
3. 解剖下来使用弯钳肋，并使用弯钳之一尖端进入胸腔。
4. 使用钝头微型剪刀，使用下刀片进入胸腔。使肋和重复在相反的方向之间为0.5厘米的切口。
5. 使用剩下的两个拉钩，在前后轴和安全的拉钩到软木板上（ 图2B）打开胸腔。
<李>使用在左手弯曲钝尖镊子，把握左肺和置换左肺的上部横向和下方通过开胸直到左肺动脉与支气管露出（ 图3A，B）。
6. 持在右手装入钛血管microclip敷贴与涂抹在手掌和弯曲尖端从手掌（ 图3C）背向的主体中，沿左侧的后方面的曲率滑动施用尖端进入胸腔肺和剪辑左支气管和肺动脉（ 图3D）。
7. 取下敷贴但保留左肺缩回。抓住钝尖微型剪刀用右手切支气管和肺动脉远端剪辑，删除左肺（ 图3E）。
8. 拆下肋骨拉钩。
9. 使用弯曲钝钳捏起来1厘米皮肤逊色于incisi上，但上述隔膜的水平，并插入穿过皮肤并进入左胸腔（ 图4A，B）的一个24克血管导管。
10. 使用5-0 prolene线缝合周围放置^第 4 ^次 2间断缝合和^第 5肋关闭胸腔。
11. 去除皮肤拉钩。使用两套镊子来近似沿切口的长度皮肤和粘在皮肤闭合。
12. 一个3毫升路厄锁注射器连接到血管导管和通过施加轻柔抽吸抽出血管导管除去残留的空气。
13. 胶颈部切口闭合使用镊子两套像以前一样。

5.鼠标深水肺切除

1. 暴露左肺如“老鼠肺切除”协议指出。提起肋笼具有弯曲钝钳，以允许空气进入左胸腔（ 图5A，B）。
2. 放置一个24克血管导管插入左寿拉契奇腔上面，小心不要弄伤左肺。
3. 使用5-0普理灵缝合小心不要刺破肺（ 图5C），将两个长度的缝合材料到3 ^次 / 4和^第 5/6 ^次肋骨间隙（ 图5D）。绑减轻左肺症的风险之前，将缝合材料的两个长度。领带的缝合材料，以使2中断线圈（ 图5E）。
4. 胶上的皮肤胸切开，除去残留的空气与血管导管，和胶水颈部切口如上。

6.复苏，镇痛和恢复

1. 关掉异氟烷，并管理0.1毫克/公斤丁丙诺啡和0.5生理盐水皮下注射毫升。
2. 当自主呼吸恢复，取出气管插管。
3. 观察鼠标，直到它再次走动。通常走resum上课除去气管导管后几分钟。
4. 放置在27℃培养箱（加湿，25％氧气）鼠标恢复O / N。
   注意：我们放置食物与水润湿的上箱地板为手术后的第一个24小时的几个粒料。
5. 手术后每日三天两次施用0.1毫克/千克丁丙诺啡腹腔注射。小心不要处理的动物时，打开手术部位。

7.鼠标监测

1. 手术后称量小鼠在1，3,5和7天。

Representative Results

。PNX，假手术鼠标重量的情节在图6提供了在我们的手中，生存始终是95 - 100％为PNX和假肺。有关如何右肺再生长在该模型和预期的时间过程中，我们建议读者参考吉布尼等人的 ¹⁵和Wang 等人的手稿的描述^。14

几种常见的陷阱，必须避免成功执行鼠标PNX和鼠标假肺的程序。

气管插管 ：许多研究者学习鼠标PNX技术有困难气管插管。当鼠标喉是前部和气管内导管，必须通过声带予以通过，很容易对导管传递到食道。这表现在图1A中，所述钝头导管应倾斜的前部尽可能继看台沿中线舌TURE，然后传递入气管与轻轻的压力。中期气管导管位置应在视觉上确认（ 图1B）。气管位置可以通过轻轻移动导管一边到另一边，并观察了气管运动得到证实。正确的定位是通过观察双侧挺胸抬头证实。下面一种替代技术进行说明。

外科领域创造 ：第二个常见的错误是未能创造足够的开胸窗口。 如图2A和2B所示 ，开胸窗口必须足够大和后部，以允许左肺动脉的足够的可视化和左主支气管干。没有经验的运营商通常会做他的胸太小，太前，或过于自卑轻松收回左肺并访问左侧肺门。

血管夹Applicati于：未能正确应用血管夹会导致放血。正确识别肺门是关键（ 图3A）。这表现在图3B和3C所示 ，当夹子从由夹子施加器保持器移除时，剪辑的端部是与夹子施用器的尖端和夹子的本体是齐平的弯曲施加器尖端的主体内。敷贴手柄温柔关闭将关闭剪辑。任何改变夹子的方向，可能会导致夹闭不足;因此，如果一个剪辑变得与施加器移出一个新的剪辑应该被加载。同样地，牵引左肺要轻柔以免撕肺门近端到夹子。涂抹器的弯曲尖端应遵循左肺的优越方面的曲线结扎左侧肺门（ 图3D）。一个常见的​​错误是食管结扎。这表现在图3E

避免左肺损伤的深水PNX：经验和没有经验的运营商可能是最常见的陷阱时假PNX是左肺损伤。这表现在图5中，操作者必须开胸闭合期间小心不要刺穿肺用缝合针，或允许突出肺的滞留。它放置牵开器，所述24克血管导管为空气排空，并缝合（ 图5A-D），当解除肋是很重要的。期间开胸闭合，捆扎前放置缝合线的两条链最小化肺包封（ 图5E）的风险。我们的实验室通常会执行四项假手续后4 PNX这样我们就可以将一个假鼠标变成PNX鼠标要伤害左肺。应当指出的是，并非所有组执行残余左胸廓空气排空。尽我们所知，不存在数据有和无残留的空气排出比较PNX。

随着实践和经验，既PNX和假程序应实现在10分钟内，允许多达二十几的鼠标手术在一个会话中执行。

图1.鼠标气管插管。 （A）中所述的口腔气管导管应中线和用于按压舌，因为它是先进的，有角度的前方朝向喉部。（B）的中期气管导管的正确定位应在视觉上确认。“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图2.鼠标开胸手术。 （A）的切口与皮肤的释放从底层胸廓后，将创建一个1.5×1.5cm的外科窗口中心在^第 4 ^次和^第 5肋间。（B）中 ，在^第 4 ^次和第5创建开胸后^日肋骨肋间，拉钩用于可视化的肺。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.肺切除。 （A）的左L UNG把持用弯钳和解除通过开胸，露出左肺门（白色箭头）。（B）中的血管夹应坐在与血管夹施放器和弯曲的施用尖端内的前端齐平。（C）的涂抹器要与右拇指和^第 4 ^次手指与涂抹坐在沿右手的手掌与弯曲尖端倾斜远离手掌的主体。（D）的继左上叶的曲线，血管夹适用于左侧肺门。（E）如下左PNX看到，食道（白色箭头之间）就位于后方左侧肺门（血管夹概述了白框）。 请点击此处查看大图这个数字。

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图4.放置血管导管的空气排出。 （A）的血管导管尖端刺穿皮肤。（B）的血管导管插入膈肌进入胸腔上方。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.鼠标深水肺。 （A）在假的程序，以拉钩安置前肋缘起重减少肺损伤的危险。（B）的拉钩应留在原位，因为他们都为PNX。（C）肋骨的下缘应该抬起时，把24克血管导管用于吸入空气中残留下的胸部关闭和过度荷兰国际集团的皮肤。（D）肋骨也应该解除对缝线的位置。（E）通过将缝合两股在开胸网站搭售之前，肺压迫的风险降到最低。 请点击此处查看大图这个数字。

图6.预计减肥。使用每组5只小鼠，我们表明，手术后24小时，PNX老鼠会失去平均为1.5克（7.2％），和假老鼠会失去的平均1.1克（5.2％）。两个小组均由3天的术后恢复术前体重。

Discussion

我们已经提供了迄今报告的鼠标PNX和鼠标假PNX程序的最详细的描述。我们已经取得的读者了解一些常见的陷阱，调查人员学习的过程通常会遇到，我们已经介绍了我们的实验室开发，以减轻对这些缺陷的几个技巧。利用这种模式其他实验室可能已经开发了其他的技术修改或使用不同的仪器。在评估的技术差异，个别研究者将需要决定是否这些差异显著影响实验结果。

补偿性肺生长的小鼠模型PNX拥有肺修复与再生等动物模型的许多优点。在大量的转基因小鼠可用化妆谱系追踪，基因过度表达，和一般的靶向基因敲除实验实现的大多数实验室^16。其次，铁道部phometric技术定量肺泡再生长有很好的描述^17。第三，采用这种模式的成本适中。这些程序需要唯一的专业设备是血管夹喷头和钝尖科汉，Vannas弹簧剪刀。所有其他的设备将在小鼠的手术套件或可通过鼠标外科核心设施被共同提供。第四，有经验，鼠标PNX和假PNX程序相对快速，允许许多手术要在同一天进行。最后，鼠标的小尺寸相对于其他动物模型中，适度的外壳的要求，并易于与它们也可以育成使小鼠模型容易比其他动物模型来维持。

也有几个缺点鼠标PNX模式相比，肺再生等车型。虽然鼠标肺代偿增长在很大程度上依赖于拉伸^18，肺代偿增长日在高等哺乳动物取决于两者的拉伸和增加肺血流量¹⁹时。由于人类的肺再生可能更类似于这些高等哺乳动物的再生机制，研究者应当小心鼠标直接结果外推到人。鼠标的呼吸力学比人类呼吸力学不同。在人类中，端呼气伴随有停顿，其中没有气流。在人类端呼气，肺复由低顺应性胸廓的径向牵引保持。鼠标的呼吸周期缺乏这方面产生了少量的空气滞留的呼气暂停由于不完全呼气。由于该鼠标具有更高的合规性胸廓，正是这种空气滞留它保持肺复张^20。小鼠模型的第三个缺点是它的解剖结构。由于小鼠仅具有单个左肺叶，偏左侧PNX是不可能的，因为它是在其它种。

几种常见的陷阱，一定要避免在几个关键时刻成功地执行鼠标PNX和假程序。这些关键时刻的气管插管，建立手术领域，血管夹的应用程序，并避免左肺损伤过程中假手术。

未能生存下来，这些外科手术的任何小鼠的尸检是提高在未来外科技术。下面，我们解决一些共同的困难，并提供可能会产生更大程度的成功替代技术。

未能成功导管插入气管：其他实验室利用悬挂和反式气管的照明的口插管这避免了需要直接可视化^21。

难度可视化脐：创建一个大的，妥善安置开胸窗口需要我n阶可视化左侧肺门。如果在该过程可视化是不充分的，或有用于插入血管夹喷头没有足够的空间时，开胸应加长和拉钩重新定位。应该有血液在此过程中没有池。如果有，研究者应当确定他是否将在左肺过分紧张和撕裂的左肺动脉。

去除出血左肺后：在此过程中应该有一点出血。不当加载或施加血管夹是出血的最常见的原因，以及鼠标从其左肺动脉出血应安乐死。如果发生这种类型的出血，血管夹和坚定的应用正确装载，应用在偶数压力应该再次尝试执行过程之前确认。同样地，术后死亡与鲜血的发现在左胸部可能是由于不适当的血管夹的应用程序。另一种我们的血管夹的方法是用结扎丝线缝合。

左侧肺损伤的假手术：在许多方面，假手术需要更高程度的手术技巧比PNX程序。左肺可以开胸过程中受伤，插入下面的手术部位的24克血管导管的过程中，或在开胸关闭。根据实验的需要，小鼠接受假手术可以转换为PNX。左肺损伤的另一个潜在原因是突出的左肺中开胸网站关闭监禁。深水小鼠左肺损伤要么被安乐死，或有其手术过程变为PNX。

呼吸窘迫恢复之后：从麻醉中恢复后呼吸窘迫可以来自声门肿胀由于外伤插管，不足疼痛控制，或unrecognized肺损伤。在一般情况下，除非额外的止痛药缓解政府的窘迫，动物应安乐死和原因决定的。多次插管尝试可能导致声门或声门下肿胀与产生困难的灵感。上剖检，缺乏专利声门开口的将是显而易见后声门从喉咽分离。替代方法气管插管如上所述。不足的疼痛控制，可寻址更多剂量的止痛药。如上所述，学习假手术时意外左肺损伤是常见的，而且如果无法识别，可导致呼吸窘迫和改建的实验结果。

过度减肥和脱水：小鼠的经历过度减肥或脱水手术后可能有食管结扎，不充分的疼痛控制，或无法进食或喝水。食道在于Ĵ乌斯后左侧肺门及食管结扎应怀疑任何脱水鼠标。不足控制疼痛，应怀疑小鼠毛发竖立，增加攻击性，或减少下地活动。开胸可以防止老鼠到达的食物和水中的悬浮从术后第一天笼屋顶。老鼠不吃，并从麻醉恢复后喝，只会变得更加虚弱，脱水。我们建议手术后上笼的地板上放置的食物润湿24小时。

总之，补偿性肺生长的小鼠肺模型是阐明肺再生的基本机制的宝贵的典范。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 inch Vascular clip applicator	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon small titanium red clip	Teleflex Medical (WECK)	1201
Narrow pattern 12 cm curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Curved serrated 10 cm Graefe forceps	Fine Science Tools	11052-10
Castroviejo needle holder	Fine Science Tools	12565-14
Straight 9 cm Strabismus scissors (blunt tip)	Fine Science Tools	14075-09
Straight 8.5 cm hardened fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Straight, blunt tip Cohan-Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-12
Skin glue	Gluture	32046
22 G Angiocatheter
24 G Angiocatheter
3 ml Luer lock syringe
4 Short retractors
2 Long retractors
5-0 Prolene on curved cutting needle	Ethicon	8698G
0.5 ml Syringe on 27 G needle
Normal saline
Buprenorphine
Press-n-Seal wrap	Glad Products Company
12 x 12 inch Cork board stack	Office Depot
70% Ethanol
Betadine
Mouse ventilator	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Type 845
Isoflurane vaporizer	OHMEDA	Excel 210 SE
Artificial tear ointment	Puralube	NDC: 17033-211-38