Abstract
Studiet af protein-interaktioner i forbindelse med levende celler kan generere kritiske oplysninger om lokalisering, dynamik og interagerende partnere. Denne information er især værdifuldt i forbindelse med vært-patogen interaktioner. Mange patogene proteiner fungerer inden værtsceller i en række måde, såsom muliggør omgåelse af værtens immunsystem og overlevelse i det intracellulære miljø. For at undersøge disse patogen-protein vært-celle-interaktioner er flere metoder almindeligt anvendt, herunder: in vivo infektion med en stamme, der udtrykker et mærket eller mutant protein, eller indførelse af patogene gener via transfektion eller transduktion. Hver af disse metoder har fordele og ulemper. Vi søgte et middel til direkte at indføre exogene proteiner i celler. Elektroporation er almindeligt anvendt til at indføre nucleinsyrer i celler, men er mere sjældent anvendt til proteiner selvom biofysiske grundlag er nøjagtig den samme.En standard elektroporator blev anvendt til at indføre affinitetsmærkede bakterielle effektorer i pattedyrceller. Humane epitelceller og muse makrofag celler blev dyrket ved traditionelle metoder, fritstående, og anbringes i 0,4 cm hul elektroporation kuvetter med et exogent bakterielt patogen proteinet af interesse (f.eks Salmonella Typhimurium GtgE). Efter elektroporation (0,3 kV) og en kort (4 timer) tilbagebetalingsperioden blev intracellulært protein verificeret ved fluorescens mærkning af protein via dets affinitet tag og undersøge rumlige og tidsmæssige fordeling af konfokal mikroskopi. Den elektroporerede protein blev også vist at være funktionel inde i cellen og i stand til korrekt subcellulær handel og protein-protein-interaktion. Mens de eksogene proteiner tendens til at akkumulere på overfladen af cellerne, den elektroporerede prøver havde store stigninger i intracellulær effektor koncentration i forhold til inkubation alene. Protokollen er enkel og hurtig nok til at ske i aparallel mode, der giver mulighed for high-throughput karakterisering af patogene proteiner i værtsceller herunder subcellulær målretning og funktion af virulens proteiner.
Introduction
Mange Gram-negative bakterier anvender specialiserede sekretionssystemer at injicere virulens-relaterede proteiner (benævnt effektorer) direkte i værtsceller 1-5. Disse effektorer har en bred vifte af biologiske funktioner, herunder: undertrykkelse af vært immunitet, cytoskeletale ændringer, ændring af intracellulær handel og signaler, transkriptionelle ændringer, og vært proteasom ændringer 6-9. Funktionerne af nogle effektorer kendes dog værten mål og biokemisk virkning (er) af mange andre er endnu ikke fastslået. Mens sammenligne vildtype og rekombinante bakterielle infektioner er en gyldig metode til at undersøge intracellulære effektor virulens mekanismer, er det ofte fordelagtigt at indføre en enkelt effektor i værtscellen. Således enkle metoder til indføring og karakterisering bakterielle effektor proteiner i forbindelse med værtsceller er særdeles ønskelig.
Forenkling af eksperimentel analyse with en enkelt effektor er kritisk, da andre effektorer kan have modstående eller overflødige funktioner. For at opnå denne forenkling har forskere tidligere indført makromolekyler i celler ved mange forskellige metoder, herunder viral transduktion 10, mikroinjektion 11, skrabe lastning 12,13, cellefusion med kemisk induceret mikroinjektion 14, proprietær protein "transfektion" reagenser 15, calciumphosphat nedbør 16 og elektroporation 17-20. De indførte molekyler spænder fra nukleinsyrer, herunder DNA, RNA og RNAi arter til proteiner, celleimpermeable farvestoffer og antistoffer til intracellulære mål 21,22. Nogle metoder har begrænsninger, herunder den type makromolekyle der kan indføres, og især downstream analyser kan være begrænset på grund af høj cellulær toksicitet, skadelige virkningsmekanismer, lav effekt, eller introduktion effektivitet. Transfektion en oftenn-anvendte metode til ekspression af bakterielle gener i mammale celler, også lider den begrænsning, at nogle relevante vært celletyper, såsom makrofager og primære celler, er særligt modstandsdygtig overfor transfektion. Ud over dette er det vanskeligt at kontrollere niveauet af bakteriel protein produceret ved indføring af fremmed DNA.
Meget arbejde har etableret elektroporation af nukleinsyrer i både bakterie- og pattedyrsceller som en fælles laboratorium teknik; Men der er igangværende forskning i de bedste metoder til at levere proteiner i celler under fysiologiske betingelser. Rapporter om protein transfektion er lovende, men kræver dyre reagenser og optimering. Ønsket om at indføre potentielt toksiske bakterielle effektorer i en lang række celle- mål med minimale omkostninger førte os til at overveje elektroporering som en fremgangsmåde til at studere disse proteiner in vivo.
Protein elektroporation 23-25 er et opfyldthod at indføre proteiner i levende celler via electropermeabilization, også kendt som elektro-transfektion eller elektro-injektion 26. Denne teknik anvender højintensive elektriske impulser til at skabe porer i cellemembraner. Disse reversible porer tillader makromolekyler, der normalt er udelukket fra intracellulære rum at komme ind i cellen. Efter fjernelse af det ydre elektrisk felt kan membranen genforsegle, tillader cellen at fastholde molekyler, der passerede gennem porerne 27,28.
En standard elektroporator blev anvendt i denne undersøgelse konsekvent indføre bakterielle effektorer i både mus makrofag-lignende celler og humane epitelceller. Metoden er hurtig, effektiv og billig, med nogen mærkbar nedgang i cellulær levedygtighed. De indførte proteiner kan visualiseres via immunfluorescensmikroskopi eller anvendes til funktionelle assays. Dette er blevet påvist ved anvendelse af grønt fluorescerende protein (GFP) som en ikke-toksisk standard, samtto Salmonella effektor proteiner, SspH1 og GtgE. Vi foreslår protein elektroporation som et supplerende redskab i repertoiret for studiet af bakterielle virulens proteiner og deres funktioner i eukaryote værtsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered i Advance
- Varm sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) til 37 ° C.
- Varm Dulbeccos modifikation af Eagles medium (DMEM) og Minimal Essential Medium (MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 IU / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin til 37 ° C. Bemærk: Disse repræsenterer Normal vækstmedier (NGM) for RAW og HeLa-celler hhv.
2. Fremstilling af celler
- Grow RAW 264.7-celler til 70-90% konfluens i NGM.
- Oprethold celler ved 37 ° C i en fugtig 95% luft / 5% CO2-atmosfære.
- Grow HeLa-celler til 70-90% konfluens i NGM.
- Oprethold celler ved 37 ° C i en fugtig 95% luft / 5% CO2-atmosfære.
- Før samling vaskes cellemonolaget en gang med sterilt PBS.
- Saml præ-konfluerende celler i en steril konisk rør.
- Skrabe forsigtigt RAW cellermed en gummispartel i PBS, ved gentagen pipettering at dispergere celle aggregater.
- Frigør HeLa-celler med 0,25% trypsin løsning indtil visuel undersøgelse viser afstandtagen fra kultur overflade. Brug f.eks 2 til 3 ml til en T-75 kolbe. Juster volumen følgelig at sikre trypsinopløsning dækker hele vækst overflade.
- Quench dissociationsreaktion med NGM indeholdende 10% FBS.
- Brug mindst to gange mængden af NGM for trypsin, gentagen pipettering at dispergere celle aggregater.
- Let pelletere cellerne ved centrifugering ved 900 xg i 4 min.
- Resuspender i samme volumen som trypsin / quench løsning ved hjælp sterilt PBS.
- Tæl celler under anvendelse af hæmocytometer eller partikeltæller.
- Let pelletere cellerne ved centrifugering ved 900 xg i 4 min.
- Resuspender i passende volumen af PBS i 5,5 x 10 6 til 6,0 x 10 6 celler / ml. Bemærk: For eksempel vil en T-75 kolbe giver approximdelbart 7,5 x 10 6 celler 29.
- Hold cellesuspension på is indtil elektroporation.
3. Forberedelse til Elektroporation
- Pre-chill elektroporation kuvetter (0,4 cm gap) på is.
- Tænd apparatet elektroporation og indstille spændingen til 0,3 kV.
BEMÆRK: kapacitans og modstand ikke var justerbare indstillinger på vores elektroporator (fastsat til 10 uF og 600 Ω af fabrikanten). - Fyld recovery plader med NGM og ækvilibrere i befugtet 95% luft / 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C.
4. Elektroporering
- Placer 400 pi cellesuspension i præ-kølet kuvette og tilsættes 20 ug af udvalgte protein til kuvetten (50 ug / ml).
- Flick kuvetten forsigtigt ~ 10 gange for at blande uden at beskadige celler. Bemærk: Kuvetten kan også vendes flere gange for at blande grundigt, men ikke pipetteres op og ned eller vortex at undgå at beskadige celler.
- Elektroporere prøve ved 0,3 kV til 1,5-1,7 msek. Bemærk: Dette var typisk for denne undersøgelse.
- Umiddelbart efter elektroporation svirp kuvetten forsigtigt ~ 10 gange for at blande grundigt.
5. Plating Celler
- Store cuvette med elektroporerede celler på is indtil klar til at placere i recovery-plader.
- For de fleste downstream analyser vaskes cellerne 1x med forvarmet NGM at fjerne uvedkommende effektor-protein.
- Fjern celler til analyse og suspendere 3-5 ml NGM.
- Pelletere cellerne ved centrifugering ved 900 xg i 4 min.
- Resuspender i tilstrækkelig mængde NGM for den ønskede plade størrelse (f.eks 2 ml for 35 mm skål).
- Fjern passende mængde celler til downstream analyse.
- Eksempel 1: plade i glas bunden retter til mikroskopi analyse.
- Eksempel 2: plade into cellekultur plast til proteinanalyse, såsom affinitet oprensninger.
- Tillad celler til at inddrive ækvilibrerede plader i befugtet 95% luft / 5% CO2-atmosfære ved 37 ° C i mindst 4 timer.
6. mikroskopianalyse
6.1) Fiksering / immunfluorescensfarvning
- Vask cellerne 1x med sterilt PBS efter 4 timer restitutionsperiode.
- Fix celler i 100% methanol i 2 minutter ved stuetemperatur. Brug nok methanol til helt at dække celler (fx 2 ml for 35 mm skål).
- Wash 3x med sterilt PBS.
- Permeabilisere celler med 0,4% Triton X-100 i PBS i 15 min. Brug f.eks 1 ml til en diameter plade 35 mm.
- Juster længde permeabilisering og styrken af Triton X-100 ifølge epitop og placering af målproteinet. Bemærk: De bedste resultater skal bestemmes empirisk for hvert mål, men ovennævnte betingelser bør være tilstrækkelig for de fleste Cytosolic mål.
- Blok med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Brug f.eks 1 ml til en diameter plade 35 mm.
- Vask 3 x med PBS.
- Inkuber primært antistof i antistof bindende opløsning (0,1% Triton X-100 og 1% BSA i PBS) natten over ved 4 ° C med forsigtig vuggende. Brug f.eks 0,5 ml til en diameter plade 35 mm.
- Følg producentens anbefalinger for antistoffortynding. Bemærk: For eksempel blev streptavidin-bindende peptid tag (SBP-tag) antistof, der anvendes ved 1: 1.000 fortynding, mens PKN1 antistof blev anvendt ved 1: 200 fortynding.
- Vask 4x med PBS.
- Inkuber med passende fluorescens-konjugeret sekundært antistof i antistof bindende opløsning i 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- For eksempel bruger Alexa 488 eller Alexa 647 i 1 time ved stuetemperatur.
- Følg producentens anbefalinger til myreiBody fortynding. (F.eks ca. 1: 1.000 til denne undersøgelse).
- Tilføj andre pletter efter behov, for eksempel 5 uM Hvedekim agglutinnin (WGA) konjugeret til Alexa 647 eller DAPI ifølge producentens anbefaling, i 1 time ved stuetemperatur.
- For eksempel bruger Alexa 488 eller Alexa 647 i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 5x med PBS og opbevares ved 4 ° C, beskyttet mod lys indtil klar til billedet.
6.2) konfokal mikroskopi og billedanalyse
- Billede prøverne på en omvendt konfokal mikroskopet med en 63x olieimmersion mål.
- Billede grønne kanal ved hjælp af 488 nm linje i et argon laser, med båndbredde emission mellem 492-542 nm.
- Billede røde kanal ved hjælp af en 633 nm diode laser, med båndbredde emission mellem 640-718 nm.
- Billede blå kanal ved hjælp af en 405 nm diode laser, med båndbredde emission mellem 407-453 nm.
- Sørg for, at multiple kanal z-stakke dækker hele det cellulære volumen.
- Proces billeder med passende billedbehandling software.
7. Affinitetsrensning
- Vask elektroporerede celler to gange med 4 ° C PBS efter 4 timers restitutionsperiode.
- Lyse med ~ 1,0 ml lysisbuffer (1% Triton X-100 med protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor i PBS) på is. Brug inhibitorer overensstemmelse med producentens anvisninger. Bemærk: For eksempel både phosphatase og protease-inhibitorer, der anvendes i denne undersøgelse blev leveret på 100x, men andre formuleringer bør arbejde lige så godt.
- Straks skrabe celler med gummi politimand og anbring i koniske rør.
- Lyse ved kraftig omhvirvling og sonikering. Bemærk: Andre lysis metoder kan arbejde lige så godt, men effektiviteten skal bestemmes empirisk med hensyn til egnetheden af assay krav.
- Sonikeres 3 x 30 sek med intermitterende vortex.
- Centrifugeres ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at indsamlecellerester og uopløselige aggregater; gemme supernatanten.
- Kombiner lige store volumener (~ 1,0 ml) af elektroporeret cellelysat med 50 pi streptavidin agarose resin suspension ved 4 ° C natten over med ende-over-ende rotation. Bemærk: Denne harpiks indfanger den elektroporerede protein (og tilhørende komplekser) via sin streptavidin-bindende peptid affinitetsmærke.
- Centrifuger ved 2.500 x g i 2 min og kassér supernatanten.
- Vask to gange med 40 lejevolumener (~ 1 ml) PBS.
- Tilsæt 30 pi 4x LDS loading buffer (141 mM Tris-base, 2% LDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM SERVA Blå G, 0,175 mM phenolrødt, pH 8,5), 20 pi DIH 2 O og 1 pi 0,5 M tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), giver mulighed for en vis mængde til at forblive i perlerne.
- Opvarm ved 95 ° C i 10 minutter og afkøles på is.
- Spin> 10.000 xg ved 4 ° C i 5 min.
- Saml supernatant.
- Udfør en western blot under anvendelse af egnede antistoffer Bemærk: Hanre, er anti-PKN1 anvendte primære antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et indledende proof of concept, blev renset grønt fluorescerende protein med succes indført i pattedyrceller ved anvendelse af elektroporation. GFP, en omtrentlig 27 kD en molekylvægt protein er almindeligt indføres i pattedyrceller (normalt udtrykt fra plasmid-DNA) som et molekylærbiologisk værktøj uden signifikant cellulær toksicitet. HeLa-celler blev inkuberet (figur 1A) eller elektroporeret (figur 1B) med 25 ug / ml GFP efterfulgt af immunofluorescens konfokal mikroskopi for at kontrollere for fluorescerende GFP signal. For at demonstrere, at GFP var inde i cellulære cytosol blev cellerne også farvet med hvedekimagglutinin (WGA) at afgrænse cytosoliske grænse (rød) samt en nucleinsyrefarve DAPI (blå) for at indikere kernen. Intracellulær GFP signal blev kun observeret ved elektroporering, mens der ikke intracellulært protein blev observeret i celler inkuberet med GFP. Lignende resultater blev observeret med RAW264.7 musmakrofag-lignende celler (figur 1C og 1D). Bemærk, at WGA er et lectin, der fortrinsvis binder til rester i plasmamembranen og således kan udvise punktformet farvning baseret på længden af inkubation. Sammenlign figur 1A og figur 2A, hvor figur 2A blev inkuberet i en længere varighed end figur 1A.
Elektroporation blev derefter forlænget til et mærket, oprenset Salmonella effektor, GtgE. GtgE, en kendt virulensfaktor 30, blev opdaget ved vores gruppe at blive udskilt i værtsceller 31, og blev for nylig vist at være en cysteinprotease 32. HeLa-celler blev inkuberet eller elektroporeret med 50 ug / ml GtgE. For immunofluorescensanalyse blev cellerne farvet med et antistof mod streptavidin-bindende peptid affinitetsmærke på GtgE. Cellerne blev også farvet med WGA og DAPI. I inkuberet HeLa-celler (Figure 2A), er der ingen intracellulær GtgE som visualiseret ved en mangel på grønt fluorescerende foci. I modsætning hertil elektroporerede HeLa-celler (figur 2B) signifikant fluorescerende intracellulært signal indikerer effektor-protein var trådt cellerne på grund af elektroporation processen. RAW celler viste en let øget tilbøjelighed til at akkumulere proteinet på celleoverfladen under inkubation (figur 2C), men intracellulært signal sås kun efter elektroporation (figur 2D).
Bestemmelse detektionsgrænserne til visualisering sub-cellulære lokalisering via konfokal mikroskopi var vigtigt at sikre tilstrækkelig protein ind i cellen, og samtidig undgå overbelastning af cellen med potentielt giftige bakterielle effektorer. I figur 3 blev GtgE elektroporeret i RAW makrofag-lignende celler ved 2,5, 25 og 50 ug / ml. Cellerne blev derefter fikseret og farvet med et antistof mod tag på GtgE. Only et meget lille antal foci blev observeret ved 2,5 ug / ml GtgE (figur 3A), med øgede antal foci synlige på 25 pg / ml, (figur 3B), men det største antal forskellige foci blev set ved den maksimale protein testkoncentration, 50 ug / ml (figur 3C). Lignende farvningsmønstre blev observeret mellem prøverne angiver ved disse proteinkoncentrationer intracellulært protein let kunne verificeres af konfokal mikroskopi. Proteinkoncentrationer over 50 ug / ml blev ikke testet, fordi koncentrationen af protein øges, så gjorde tilbøjelighed til målproteinet til at blive adsorberet til overfladen af cellerne. For at undgå disse aggregater af membran protein, blev det nødvendigt at samle to elektroporation kuvetter at få nok vært interagerende protein at visualisere på en western blot (figur 6, yderst til højre bane).
For yderligere at demonstrere, at introduced protein blev ikke bare adsorberet til overfladen af cellen, blev fortløbende optiske sektioner afbildet ved fokusplaner hver 0,35-0,43 mikrometer (z-stakke) ved hjælp af konfokal mikroskopi. RAW-celler blev elektroporeret med 50 pg / ml GtgE og farvet som beskrevet ovenfor (Figur 4 A og B). Z-stacks viste, at GtgE faktisk var intracellulære og brændpunkterne strækker sig fra bunden (figur 4A, plan 6 ud af 36) til toppen af cellen (figur 4B, fly 26 36). Lignende resultater blev opnået for alle elektroporerede proteiner. Den iboende fluorescerende profil kontrol cellepopulationer med og uden effektor protein eller elektroporation blev undersøgt ved fluorescerende konfokal mikroskopi, og viste sig at være ubetydelig.
Desuden blev det elektroporeres protein undersøgt for at se, om den var målrettet til nedbrydning via endocytiske veje. Celler blev farvet for Ras-relateret protein 5A (Rab5), enmarkør for tidlig endosomer (figur 4C) eller lysosom-associerede membranprotein 1 (Lamp1), en markør for sent endosomer og lysosomer (figur 4D). Co-lokalisering mellem elektroporerede protein og disse cellulære markører indikerer en tæt fysisk samspil mellem dem (dvs. at den elektroporerede protein var inde endosomerne / lysosomer). Konfokal mikroskopi viste, at den elektroporerede protein (GFP eller GtgE) ikke co-lokalisere med LAMP1 eller Rab5. Det blev udledt, at indførte protein blev ikke direkte endocytose i cellerne eller målrettet til den endocytotisk vej inden for fire timers behandling.
Exogent protein introduktion kan have cellulære virkninger i løbet af flere timer eller dage, og det er således ofte en fordel at undersøge persistens af indførte proteiner. For at bestemme, hvor længe en elektroporerede protein ville vare ved uden nedbrydning efter elektroporation. Baseret on visualisering af tilknytning og cellespredning blev 4 timer bestemt til at være den omtrentlige minimum restitutionstid for elektroporerede celler. Til tidsmæssigt observere protein persistens et tidsforløb eksperiment blev udført, farvning af cellerne 4, 24 eller 96 timer efter elektroporering. Efter 4 timer (figur 5A), når cellemorfologi foreslået genvinding, var der en mærkbar mængde af intracellulært protein. Efter 24 timer (figur 5B), var der stadig en betydelig elektroporeret protein inde i cellerne. Selv når tiden efter elektroporation blev udvidet til 96 timer før fiksering og farvning (figur 5C) der var observerbare foci dog på et reduceret tilsyneladende overflod, demonstrerer protein vedholdenhed dage efter første behandling.
To vigtige advarsler blev konstateret i løbet af disse forsøg. RAW-celler udviste en større tendens end HeLa-celler til at akkumulere exogene proteiner på celleoverfladen irreperspektiv af inkubation (figur 6A) eller elektroporering (figur 6B). Trods dette var alle elektroporerede prøver øget intern protein (figur 1, 2, 5b). Derudover membran-associeret protein forsvandt over tid. En anden advarsel var en lille population af celler, der udviser en fænotype, der består af mindre, afrundede celler fyldt med store mængder af eksogene proteiner i både kontrol (inkuberet) og behandlet (elektroporerede) celler (figur 6 C og D, inkubationstider prøver vist). Kernerne i disse celler viste kondenseret kromatin baseret på DAPI farvning og fyldte hele den cellulære volumen, tyder på apoptose. Det er derfor muligt, at apoptotiske celler (opstår som en normal del af cellecyklussen eller på grund af høst / behandling) har en tilbøjelighed til at absorbere protein fra bufferen.
At vise, at elektroporerede proteiner var funktionelle og kunne lokalisere korrectly inde i værtscellen, co-lokalisering og protein-protein-interaktion mellem Salmonella effektor protein SspH1 og dets kendte vært mål proteinkinase N1 (PKN1) 33 blev vist. Efter elektroporation blev den fysiske vekselvirkning mellem SspH1 og PKN1 verificeret af en affinitet baseret immunopræcipitation efterfulgt af western blot (figur 7A). Co-lokalisering blev også observeret ved konfokal mikroskopi, der angiver de fluoroforer er tæt nok rumligt at overlappe 34. Efter elektroporation med 50 ug / ml SspH1 blev HeLa-celler (Figur 7B) fikseret og farvet for SspH1 (grøn) og PKN1 (rød). Ved lav lasereffekt særskilt foci (gul) blev observeret i kernen indikerer SspH1 og PKN1 var fysisk tæt nok til at interagere. Denne interaktion er blevet etableret i litteraturen; men denne undersøgelse er den første til at vise co-lokalisering i kernen.
= "Altid"> 
Figur 1: Elektroporation af GFP - HeLa eller RAW 264.7-celler Celler blev inkuberet eller elektroporeret med 25 ug / ml renset grønt fluorescerende protein (GFP) og farvet med anti-GFP-antistof (grøn), DAPI, et nukleart specifik probe (blå. ) og WGA (rød) til at afgrænse det cytosoliske grænse. Inkuberet (A) HeLa-celler viser et fravær af grøn fluorescens indikerer en manglende internalisering af GFP. (B) viser et repræsentativt mikrofotografi af elektroporerede GFP. Bemærk forekomsten af intracellulær foci angiver GFP var trådt cellerne. (C) og (D) er repræsentative billeder af RAW-celler inkuberet (C), eller elektroporeret (D) med 25 ug / ml renset grønt fluorescerende protein.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Figur 2:. Elektroporation af Salmonella effektor GtgE - HeLa-celler Celler blev inkuberet (A) eller elektroporeret (B) med 50 ug / ml af en affinitetsmærkede Salmonella effektor, GtgE og farvet med et anti-effektor mærke-antistof (grøn), DAPI, et nukleart masken (blå) og WGA (rød) til at afgrænse det cytosoliske grænse. I (A), inkuberet HeLa-celler viser et fravær af grøn fluorescens indikerer en manglende internalisering af GtgE. (B) viser et repræsentativt mikrofotografi af elektroporeret GtgE, viser intracellulær elektroporeret effektor-protein. (C) og (D) er repræsentative billeder af RAW-celler, som enten var inkuberet eller elektroporerede henholdsvis på samme måde med 50 ug / ml Salmonella GtgE. Lyseblå er kombinationen, eller overlay, rød fluorescens fra WGA oggrøn fluorescens fra det sekundære antistof.
Figur 3: Titrering af elektroporeret protein - RAW makrofag-lignende celler Celler blev elektroporeret med 2,5 ug / ml (A), 25 ug / ml (B) eller 50 ug / ml (C) Salmonella effektor GtgE og fik lov til at komme sig. 4 timer. Cellerne blev fikseret og farvet med et anti-SBP-mærke-antistof (grøn) og kerner maske, DAPI (blå). Det er muligt at visualisere fluorescerende foci, indikerer intracellulær GtgE ved 2,5 ug / ml via konfokal mikroskopi, selv om der blev opnået bedre resultater, når højere udgangspunkt mængde protein blev anvendt. Tilfredsstillende resultater (herunder intracellulært protein let observeret af konfokal mikroskopi uden overdreven membran associerede aggregater) blev opnået ved 50 ug / ml for GtgE og dermed no større koncentrationer blev testet.
Figur 4:. Protein internalisering og manglende co-lokalisering med endosom markører hinanden følgende optiske skiver (z-stakke) opnået ved konfokal mikroskopi til at visualisere, hvis elektroporerede protein var interne. RAW-celler blev elektroporeret med 50 pg / ml GtgE. (A) viser optisk skive 6 af 36 z-stabel (2,1 mikrometer) over bunden af skålen. (B) viser det samme synsfelt men skive 26 36. De intracellulære foci strækker hele celle viser, at proteinet er virkelig intracellulært og ikke aggregeres på overfladen af cellen. Lyseblå er kombinationen af røde WGA, grøn sekundært antistof og blå DAPI. Co-lokalisering assay med markører for endosomer / lysosomer Rab5, (C) eller en lysosom markering, LAMP1 
Figur 5: Protein vedholdenhed efter elektroporation Konfokal mikrograf viser vedvarende elektroporerede GtgE over tid.. 50 ug / ml GtgE blev elektroporeret ind i HeLa-celler. Cellerne blev derefter fikseret og farvet med et anti-SBP-mærke-antistof (grøn) og kerner maske, DAPI (blå). 4 timer (A) var bestemt til at være den mindste mængde af tid til at gøre det muligt for cellerne at komme sig og som forventet, viser maksimal intracellulært protein. Efter 24 timer (B) og 96 timer (C), grøn foci, både intracellulært og på cellastet, overflade, viser effektor persistens indikerer, at proteinet ikke nedbrydes dage efter den indledende behandling. Den lyseblå farve i billedet er overlejring af blå DAPI og den grønne antistoffarvning. 
Figur 6:. Celleoverfladeprotein aggregering og en elektroporation fænotype RAW makrofag-lignende celler blev enten inkuberet (A) eller elektroporeret (B) med 50 ug / ml GtgE og farvet med anti-SBP-mærke-antistof (grøn), WGA (Rød ), og med DAPI (blå). Både RAW 264.7 og i mindre grad HeLa-celler, en tendens til at aggregere effektor på overfladen af cellen; alle elektroporerede celler viste sig at have øget intern protein (HeLa ikke vist). Gul er overlejring af røde fra WGA og grønt fra target protein. RAW (C) og HeLa (D) celler der beviserg en ændret fænotype efter inkubation med GtgE (vist). Flere forsøg viste en fænotype, der består af mindre celler med differentieret DAPI farvning og et tab af cytoplasma. Lyseblå er overlay fra den røde WGA, grøn sekundært antistof, og blå DAPI. Konfokal mikroskopi blev anvendt til at vise målproteinet akkumulere i kernen. Da denne fænotype af exogene protein-laden celler viste sig efter både inkubation og elektroporation, kunne man hypotesen denne fænotype at være tegn på apoptose. 
Figur 7:. Værtsprotein interaktioner med elektroporerede Salmonella SspH1 - HeLa-celler Celler blev elektroporeret ved de anførte koncentrationer med SspH1, lov til at komme i 4 timer før udførelse af en modificeret affinitet oprensning efterfulgt af western blot (A) for at berige for ogdetektere den kendte eukaryote interagerende partner: serin / threonin-proteinkinase N1 (PKN1). Bemærk, at det yderste højre vognbane (2x EP) indeholder 2 sammenlagte kuvetter, som signalet fra en kuvette blandet ind baggrund, men PKN1 var stadig beriget over den manglende binding ses i nej-agn kontrol. Western blot blev kørt med native HeLa lysat oprenset SspH1 og affinitetsoprensning prøver inden blive probet med et monoklonalt antistof til PKN1. Måldetektering blev opnået via en peberrodsperoxidase konjugeret sekundært antistof med reaktivitet mod isotypen af det primære antistof. HeLa-celler (B), der viser co-lokalisering (gult) mellem PKN1 (rød) og SspH1 (grøn) via ved konfokal mikroskopi efter elektroporation med 50 ug / ml SspH1. Denne optiske overlapning indikerer, at effektor og værten protein er tæt nok til fysisk at interagere. Det faktum, at interaktionen blev vist i kernen for første gang giver yderligere støtte,proteinet blev trafikerede korrekt af værten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Secernerede effektorer fra patogene bakterier har udviklet sig til at fungere i værtscellen miljø og det er således nyttigt at studere dem in situ i værten. Indførelse af specifikke effektorer af interesse i værtsceller tillader det relevante patogen-værts interaktioner skal undersøges isoleret uden indblanding fra andre bakterielle proteiner. Målet var at undersøge elektroporation som et middel til at indføre bakterielle effektor proteiner i eukaryote værtsceller og derved undgå nogle af de udfordringer, der er forbundet med transfektion eller transduktion. Grønt fluorescerende protein blev anvendt som en kontrol og Salmonella effektor proteiner blev testet. På grund af interesse i bakterielle patogener, som målværten epitelceller samt immunceller, blev et humant epitel-lignende cellelinie (HeLa) og muse makrofag-lignende celler (RAW 264.7), der anvendes. Elektroporation kan levere exogene proteiner i værtsceller med nogen mærkbar nedgang i celle viabiliTy, og de leverede proteiner var detekterbare i celler i op til fire dage.
For at isolere virkningerne af elektroporeret protein, rent protein nødvendig. I denne undersøgelse blev proteiner udtrykt i E. coli-stamme BL21 med N-terminal polyhistidin og streptavidin bindende-peptid tags. Proteiner blev oprenset ved Ni-NTA-harpiks, analyseret for koncentration (generelt mellem 5-25 mg / ml) og renhed, og opbevaret ved -80 ° C indtil elektroporering. Kommercielt fremstillede proteiner også ville være acceptabel for elektroporation, da de har tendens til at være af høj renhed og godt karakteriseret.
Vigtige skridt i denne protokol omfattede fuldstændig fjernelse cellekulturmediet ved vask og suspendere celler i protein-fri puffer. Dette sikrer, at eventuelle efterfølgende fænotyper observerede skyldes det exogene protein af interesse og ikke til proteiner til stede i dyrkningsmediet. Bedre effektivitet af elektroporation blev observeret, når celledensiteten varhøjere (f.eks 6 x 10 6 vs. 1 x 10 6 celler), selvom det bedste celle antal vil variere med cellestørrelse og type. Et andet afgørende skridt i forsøget var at give celler tid til at komme og vedhæfte til retter; dette var nødvendigt, fordi adhærente celler blev anvendt i denne undersøgelse. En restitutionsperiode bør være mindre vigtigt for suspensionsceller, selvom det kan være nødvendigt at give proteiner tid for korrekt intracellulær transport, protein-protein-interaktioner eller enzymatisk aktivitet, afhængigt af arten af den påtænkte undersøgelse. Siden leverede proteiner blev observeret i celler i op til 96 timer, er der meget plads til tilpasning til inkubationstiden før mikroskopi visualisering eller cellulær assay.
Flere variabler i denne protokol, kan optimeres til forskellige celletyper, proteinmål eller analyse ordninger nedstrøms. Mængden af protein, der skal elektroporeres kan finjusteres til den ønskede intracellulære koncentration. For visualisering af protein lokalisering, kan så lidt som 1 ug anvendes. For funktionelle studier kan være nødvendigt med højere grundbeløb af proteiner. Desuden kan mængden af tid for post-elektroporation celleindvinding kortsluttes eller forlænges. Labile protein mål eller hurtige downstream processer vil kræve en kortere inkubationstid. Ligeledes kan mængden af celler udpladet justeres end de forslag her. Celler kan forgyldt mere sparsomt, hvis den indførte protein skal overvåges ved mikroskopi, eller belagt mere tæt, hvis det elektroporerede proteinet skal inddrives til applikationer såsom Western blotting.
Mens elektroporering er en enkel og ligetil metode til at indføre proteiner i levende celler, er der nogle begrænsninger for teknikken. Metoden kræver meget rene proteiner i mikrogram mængder. Så lidt som 1 pg blev elektroporeret og visualiseret med konfokal mikroskopi, men højere grundbeløb af protein gav bettER visuelle resultater. Mens proteinfunktion ikke blev vurderet ved alle koncentrationer efter elektroporering blev proteinkoncentrationer er lig med eller større end 50 pg / ml kræves for passende signal til western blot. Også på grund af størrelsen begrænsninger elektroporation kuvetter, opskalering kan kræve behandling af flere kuvetter af celler. , BETRAGTNING AF, at elektroporation tager få sekunder, når cellerne er forberedt, parallel behandling kræver lidt ekstra tid og kræfter.
Hvis det indførte proteinet skal visualiseres ved Western blot, mikroskopi eller anvendes til affinitetsoprensning, bør proteinet have et tag 35 for affinitetsoprensning eller tilgængeligt antistof til detektering. Men af ukendte årsager, nogle interaktioner er kendt fra litteraturen eller andre biokemiske metoder (data ikke vist) ikke var i stand til at blive sammenfattet efter elektroporation. Det kan være, at værten genkender nogle elektroporerede proteiner som foreign og hurtigt markerer dem for proteasom nedbrydning.
Elektroporation har flere fordele i forhold til andre eksisterende metoder til protein levering. Sammenlignet med mikroinjektion, elektroporation er meget hurtigere og enklere, og et stort antal celler kan behandles på en gang med næsten 100 procent levedygtighed for de afprøvede forhold. Elektroporation er også billigere end protein transfektion med kommercielt tilgængelige reagenser. DNA transfektioner anvendes ofte til at undersøge bakterielle effektor proteiner i værtsceller; Men dette medfører de bakterielle proteiner syntetiseres ikke-ideelt af værten. På den anden side, elektroporering af bakterielle proteiner fjerner afhængighed pattedyr proteinekspression maskiner, giver mulighed for en bedre repræsentation af det infektiøse proces, hvor effektor proteiner udtrykt af bakterierne.
Flere applikationer kan bruge protein elektroporation som metode i studiet af bakteriel-host interaKTIONER. For det første kan primære celler, der ofte er vanskelige at transficere være mere medgørlige til elektroporering for protein levering. Dette vil give mulighed for undersøgelse af effektorfunktion i mere biologisk relevant celletyper. Elektroporation giver også mulighed for multipleksing proteiner og / eller behandlinger. For eksempel kan flere proteiner indføres samtidigt eller narkotika og andre små molekyler kan leveres sammen med proteiner. Mest vigtigt for at opnå en funktionel forståelse af virkningen af de indførte proteiner kan protein elektroporering kobles med assays for protein-funktion og interaktioner, såsom affinitetsoprensning, western blots mod kendte mål, hel-celle-ekspression analyse og mikroskopi for at bestemme subcellulær lokalisering af den indførte protein. Derfor denne metode har et stort potentiale som et redskab til at belyse bakterielt patogen biologi sammen med andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
