Abstract
המחקר של אינטראקציות חלבון בהקשר של תאי חיים יכול ליצור מידע קריטי על לוקליזציה, דינמיקה, ושותפים באינטראקציה. מידע זה הוא בעל ערך במיוחד בהקשר של אינטראקציות מארח הפתוגן. חלבוני הפתוגן רבים לתפקד בתוך תאי מארח במגוון רחב של דרך כגון, מה שמאפשר התחמקות ממערכת החיסון המארחת וההישרדות בסביבה תאית. ללמוד אינטראקציות מארח תאי הפתוגן-חלבון אלה, מספר גישות נמצאות בשימוש נפוץ, ובם: בזיהום vivo עם זן לבטא חלבון מתויג או מוטציה, או הקדמה של גני הפתוגן באמצעות transfection או התמרה. לכל אחת מהגישות הללו יש יתרונות וחסרונות. חפשנו אמצעי להציג ישירות חלבונים אקסוגניים לתאים. Electroporation משמשת בדרך כלל כדי להציג חומצות גרעין לתאים, אך הוחל חלבונים לעתים רחוקות יותר אם כי בסיס biophysical הוא בדיוק אותו הדבר.Electroporator סטנדרטי שימש להציג effectors חיידקי זיקה מתויגת לתאי יונקים. תאי אפיתל מקרופאג ועכבר אנושיים היו בתרבית בשיטות מסורתיות, מנותקים, והניחו בcuvettes electroporation פער 0.4 סנטימטר עם חלבון אקסוגני חיידקים פתוגנים של עניין (למשל סלמונלה Typhimurium GtgE). לאחר electroporation (0.3 קילו וולט) ותקופת החלמה (4 שעות) קצרה, חלבון תאיים אומת על ידי fluorescently תיוג החלבון באמצעות תג זיקתה ובחינת חלוקת מרחב ובזמן על ידי מיקרוסקופ confocal. חלבון electroporated הוצג גם להיות פונקציונלי בתוך התא ומסוגל סחר subcellular נכון ואינטראקציה בין חלבונים. בעוד החלבונים אקסוגניים נטו לצבור על פני השטח של התאים, היו לי דגימות electroporated עליות גדולות ביחסי ריכוז מפעיל תאיים לדגירה לבד. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר מספיק כדי להיעשות בapאופנת arallel, המאפשרת לאפיון תפוקה גבוה של חלבונים בתאי מארח הפתוגן כוללים מיקוד ותפקוד של חלבוני ארסיות subcellular.
Introduction
חיידקים גראם-שלילי רבים להעסיק מערכות הפרשה מיוחדות להזריק חלבונים הקשורים לאלימות (המכונים מפעילים) ישירות לתוך תאי מארח 1-5. יש לי effectors אלה מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים כוללים: דיכוי חסינות מארח, שינויי cytoskeletal, שינוי של סחר תאיים ואיתות, שינויי תעתיק, ושינויי פרוטאזום מארח 6-9. הפונקציות של כמה effectors ידועות, עם זאת מטרות המארח ופעולה הביוכימית (ים) של רבים אחרים עדיין לא נקבעו. תוך השוואת wild-type וזיהומים חיידקיים רקומביננטי היא גישה תקפה ללמוד מנגנוני אלימות מפעיל תאיים, הוא לעתים קרובות יתרון להציג מפעיל בודד לתוך התא המארח. לפיכך, שיטות פשוטות להצגה ואפיון חלבוני מפעיל חיידקים בהקשר של תאי מארח רצויה מאוד.
פישוט wi הניתוח הניסיוניה מפעיל יחיד הוא קריטי כפי שאולי יש effectors אחרת פונקציות יריבה או מיותרות. כדי להשיג פישוט זה, חוקרים הציגו בעבר מקרו-מולקולות לתוך תאים על ידי שיטות רבות ושונות, כוללים התמרה ויראלית 10, microinjection 11, לגרד טעינת 12,13, איחוי תאים עם microinjection המושרה כימי 14, ריאגנטים חלבון קניינית "transfection" 15, משקעי סידן זרחה 16, וelectroporation 17-20. המולקולות הציגו נעות בין חומצות גרעין כוללים מיני DNA, RNA, וRNAi לחלבונים, צבעי תא-חדיר, ונוגדנים למטרות תאיות 21,22. יש כמה שיטות מגבלות כוללים הסוג של פולימר שיכול להיות מוצג, וניתוחים במורד הזרם מסוימים עשויים להיות מוגבלים בשל רעילות גבוהה סלולרית, מנגנונים מזיקים של פעולה, יעילות נמוכה, או יעילות מבוא. Transfection, often שימוש בשיטה לביטוי גנים של חיידקים בתאי יונקים, סובל גם המגבלה שכמה סוגי תאי מארח רלוונטיים, כגון מקרופאגים ותאים ראשוניים, הם עמידים במיוחד לקראת transfection. מעבר לכך, קשה לשלוט ברמות של חלבון חיידקים המיוצר על כניסתה של דנ"א זר.
יש הרבה עבודה שהוקמה electroporation של חומצות גרעין לשני תאי החיידקים ויונקים כטכניקת מעבדה משותפת; עם זאת, יש מחקר מתמשך לשיטות הטובות ביותר לאספקת חלבונים לתאים בתנאים פיסיולוגיים. דיווחים על transfection חלבון מבטיחים, אך דורשים חומרים כימיים ואופטימיזציה יקרים. הרצון להציג effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל למגוון רחב של יעדי תא עם עלות מינימאלית הוביל אותנו לשקול electroporation כשיטה ללימוד חלבונים אלה in vivo.
electroporation החלבון 23-25 הוא נפגשהוד להציג חלבונים לתאים חיים באמצעות electropermeabilization, הידוע גם באלקטרו-transfection או אלקטרו-הזרקת 26. טכניקה זו משתמשת פולסים חשמליים בעוצמה גבוהה כדי ליצור נקבוביות בקרום תא. נקבוביות הפיכים אלה מאפשרים מקרומולקולות כי הם בדרך כלל לא נכללו מהחלל תאית להיכנס לתא. לאחר ההסרה של השדה החשמלי החיצוני, הקרום יכול לחתום מחדש, המאפשר לתא כדי לשמור על מולקולות שעברו דרך הנקבוביות 27,28.
Electroporator סטנדרטי שימש במחקר זה כדי להציג באופן עקבי effectors חיידקים לשני תאים כמו מקרופאג-עכבר ותאי האפיתל אנושיים. השיטה היא מהירה, יעילה, ולא יקר, ללא ירידה משמעותית בכדאיות סלולרית. ניתן דמיינו חלבונים הציגו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence או משמשים למבחנים פונקציונליים. זה הודגם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסטנדרט שאינו רעיל, כמו גםשני חלבוני סלמונלה מפעיל, SspH1 וGtgE. אנו מציעים electroporation חלבון ככלי נוסף ברפרטואר לחקר חלבוני ארסיות חיידקים ואת תפקידיהם בתאי מארח אוקריוטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. להכין מראש
- מי מלח חם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס.
- השינוי של Dulbecco החם של נשרים בינוניים (DMEM) והמינימאלי חיוני בינוני (MEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 100 IU / פניצילין מיליליטר, ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: אלה מייצגים רגיל צמיחת מדיה (NGM) לתאי RAW והלה בהתאמה.
2. הכנת תאים
- לגדול 264.7 תאי RAW לconfluency 70-90% בNGM.
- שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2.
- לגדל תאי הלה לconfluency 70-90% בNGM.
- שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% 2.
- לפני האיסוף, לשטוף monolayer תא פעם אחת עם PBS סטרילי.
- איסוף תאים טרום-ומחוברות בצינור חרוטי סטרילי.
- בעדינות לגרד תאי RAWעם שוטר גומי בPBS, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
- ניתוק תאי הלה עם 0.25% פתרון טריפסין עד בדיקה חזותית מציגה ניתוק ממשטח התרבות. לדוגמא, השתמש 2-3 מיליליטר לבקבוק T-75. להתאים את עוצמת קול בהתאם כדי להבטיח פתרון טריפסין מכסה שטח גידול כולו.
- להרוות את תגובת ניתוק עם NGM המכיל 10% FBS.
- השתמש לפחות פעמיים הנפח של NGM לטריפסין, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
- קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
- Resuspend באותו נפח כפתרון טריפסין / להרוות באמצעות PBS סטרילי.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מונה חלקיקים.
- קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
- Resuspend בנפח מספק של PBS ל5.5 x 10 x 6 6.0 10 6 תאים / מיליליטר. הערה: לדוגמא, T-75 בקבוק אחד יניב approximately 7.5 x 10 6 תאים 29.
- שמור השעיה תא על קרח עד electroporation.
3. הכנה לElectroporation
- cuvettes טרום צמרמורת electroporation (פער של 0.4 סנטימטרים) על קרח.
- הפעל מנגנון electroporation ולהגדיר את המתח 0.3 וולט.
הערה: קיבוליות והתנגדות לא היו הגדרות להתאמה על electroporator שלנו (על 10 μF ו -600 Ω על ידי היצרן). - מלא צלחות התאוששות עם NGM ולאזן באווירת CO אוויר / 5% humidified 95% 2 ב 37 ° C.
4. Electroporation
- הנח 400 μl של השעיה תא קובט טרום צונן ולהוסיף 20 מיקרוגרם של חלבון שנבחר לקובט (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
- קובט פליק בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ללא פגיעה בתאים. הערה: קובט גם יכול להיות הפוך מספר פעמים ולמערבב היטב, אבל לא pipet למעלה ולמטה או מערבולת כדי למנוע נזק לתאים.
- מדגם electroporate על 0.3 קילו וולט עבור 1.5-1.7 msec. הערה: זה היה אופייני למחקר זה.
- מייד לאחר קובט הקפיצי electroporation בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.
5. ציפוי של תאים
- קובט חנות עם תאי electroporated על קרח עד מוכן למקום בצלחות התאוששות.
- עבור רוב הניתוחים במורד הזרם, לשטוף תאי 1X עם NGM מראש חימם כדי להסיר חלבון מפעיל זר.
- הסרת תאים לניתוח ולהשעות ב3-5 מיליליטר של NGM.
- גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
- Resuspend בנפח מספק של NGM לגודל רצוי צלחת (למשל 2 מיליליטר למנה 35 מ"מ).
- הסר כמות מתאימה של תאים לניתוח במורד הזרם.
- דוגמא 1: צלחת לתוך מנות תחתית כוס לניתוח מיקרוסקופי.
- דוגמא 2: int צלחתo פלסטיק תרבית תאים לניתוח חלבונים כגון purifications זיקה.
- לאפשר לתאים להתאושש בצלחות equilibrated באווירת CO אוויר / 5% -95% humidified 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.
6. מיקרוסקופית ניתוח
6.1) קיבוע / Immunofluorescence מכתים
- לשטוף את תאי 1X עם PBS סטרילי לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
- תקן תאים במתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש מספיק כדי לכסות את תאי מתנול (למשל 2 מיליליטר במשך 35 צלחת מ"מ) לחלוטין.
- 3x לשטוף עם PBS סטרילי.
- Permeabilize תאים עם 0.4% Triton X-100 ב PBS במשך 15 דקות. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
- התאם אורך של permeabilization וכוחו של טריטון X-100 על פי epitope ומיקום חלבון המטרה של. הערה: התוצאות הטובות ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל יעד, אולם התנאים הנ"ל צריכים להיות מספיק עבור רוב גמטרות ytosolic.
- לחסום עם 5% הסרום אלבומין שור (BSA) בPBS עבור שעה 1 ב RT. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
- 3x לשטוף עם PBS.
- דגירה נוגדן ראשוני בפתרון מחייב נוגדנים (0.1% Triton X-100 ו 1% BSA PBS) הלילה ב 4 ° C עם נדנדה עדינה. לדוגמא, השתמש 0.5 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
- עקוב אחר המלצות יצרן לדילול נוגדן. הערה: לדוגמא, נוגדן תג פפטיד מחייב streptavidin (SBP-תג) שימש בשעה 1: 1,000 דילול, ואילו נוגדני PKN1 שימשו בשעה 1: 200 דילול.
- לשטוף 4x עם PBS.
- דגירה עם נוגדנים מתאימים fluorescently מצומדות משניים בפתרון מחייב נוגדן עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור.
- לדוגמא, השתמש Alexa 488 או 647 Alexa עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- עקוב אחר המלצות יצרן לנמלהדילול ibody. (למשל על 1: 1,000 למחקר זה).
- להוסיף כתמים אחרים לפי צורך, למשל, agglutinnin נבט חיטה 5 מיקרומטר (WGA) מוצמד לAlexa 647 או DAPI בהתאם להמלצת יצרן, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- לדוגמא, השתמש Alexa 488 או 647 Alexa עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- לשטוף 5x עם PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור עד מוכן לתמונה.
6.2) ניתוח תמונת Confocal מיקרוסקופית ו
- דגימות תמונה במיקרוסקופ confocal הפוכה באמצעות מטרת 63x טבילת שמן.
- ערוץ תמונה ירוק באמצעות השורה של 488nm לייזר ארגון, עם פליטת רוחב פס בין 492-542 ננומטר.
- ערוץ תמונה אדום באמצעות לייזר דיודה 633 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 640-718 ננומטר.
- ערוץ תמונה כחול באמצעות לייזר דיודה 405 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 407-453 ננומטר.
- ודא ערוץ מרובה Z- ערימות לכסות את מכלול הנפח הסלולרי.
- תמונות תהליך עם תוכנת עיבוד תמונה מתאימה.
טיהור 7. זיקה
- שטוף תאי electroporated פעמיים עם 4 ° C PBS לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
- Lyse עם ~ 1.0 מיליליטר של חיץ תמוגה (1% Triton X-100 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל ומעכב phosphatase בPBS) על קרח. השתמש במעכבים בהתאם להוראות יצרן. הערה: לדוגמא, שני מעכבי פרוטאז phosphatase ושמשו במחקר זה סופקו ב100x, אבל ניסוחים אחרים צריכים לעבוד באותה מידה.
- מייד לגרד תאים עם שוטר גומי ולאסוף לתוך צינורות חרוטי.
- Lyse ידי vortexing וsonication הנמרצים. הערה: שיטות תמוגה אחרות יכולות לעבוד באותה המידה גם, אבל יעילות תצטרך להיקבע באופן אמפירי לגבי ההתאמה של דרישות assay.
- Sonicate 3 x 30 שניות עם vortexing לסירוגין.
- צנטריפוגה ב10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוףפסולת סלולרית ואגרגטים מסיסים; להציל את supernatant.
- לשלב כמויות שווה (~ 1.0 מיליליטר) של lysate תא electroporated עם 50 μl של השעיה שרף agarose streptavidin על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה הסוף-על-קצה. הערה: שרף זה לוכד את חלבון electroporated (ומתחמים כלולים) באמצעות תג זיקתה מחייב streptavidin פפטיד.
- צנטריפוגה ב 2500 XG למשך 2 דקות וזורקי supernatant.
- לשטוף פעמיים עם 40 כרכי מיטה (~ 1 מיליליטר) PBS.
- הוסף 30 μl חיץ טעינת 4x LDS (141 מ"מ טריס בסיס, 2% LDS, גליצרול 10%, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ"מ Serva Blue G, פנול 0.175 מ"מ אדום, pH 8.5), 20 μl diH 2 O, ו1 μl של phosphine 0.5 M טריס (2-carboxyethyl) (TCEP), המאפשר לכמה נפח להישאר בחרוזים.
- חום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבים על קרח.
- ספין> 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- איסוף supernatant.
- לבצע כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים שימו לב: הואמחדש, משמש נוגדן ראשוני אנטי-PKN1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כהוכחה ראשונית של מושג, חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר הוצג בהצלחה בתאים יונקים באמצעות electroporation. GFP, 27 KD משוער חלבון משקל מולקולרי הוא הציג בדרך כלל לתאי יונקים (בדרך כלל באו לידי ביטוי מפלסמיד דנ"א) ככלי ביולוגיה מולקולרי ללא רעילות תאית משמעותית. תאי הלה הודגרו (איור 1 א) או electroporated (איור 1) עם GFP / מיליליטר 25 מיקרוגרם, ואחריו מיקרוסקופיה confocal immunofluorescence כדי לבדוק אות ה- GFP ניאון. על מנת להוכיח כי GFP היה בתוך cytosol הסלולרי, התאים היו גם מוכתמים agglutinin נבט חיטה (WGA) להתוות את גבול cytosolic (האדומה), כמו גם כתם חומצות גרעין, DAPI (כחול) כדי לציין את הגרעין. אות ה- GFP תאית נצפתה רק על electroporation, ואילו לא חלבון תאיים נצפה בתאים הודגרו עם GFP. תוצאות דומות נצפו עם עכבר RAW264.7תאים כמו מקרופאג (איור 1 ג ו1D). שים לב שWGA היא קטינים שמעדיפים נקשר לשאריות בקרום הפלזמה ובכך יכול להציג צביעת punctate מבוססת על משך הדגירה. השוואת איור 1 א ואיור 2 א, שבו איור 2A היה טופח במשך זמן ארוך יותר מאיור 1 א.
Electroporation לאחר מכן הורחבה למפעיל מתויג, מטוהר סלמונלה, GtgE. GtgE, גורם ארסיות ידוע 30, התגלה על ידי הקבוצה שלנו להיות מופרש לתאי מארח 31, ולאחרונה הוכחתי להיות פרוטאז ציסטאין 32. תאי הלה הודגרו או electroporated עם GtgE / מיליליטר 50 מיקרוגרם. לניתוח immunofluorescence, התאים היו מוכתמים עם נוגדן נגד תג זיקת פפטיד מחייב streptavidin על GtgE. התאים הוכתמו גם עם WGA וDAPI. בתאי הלה מודגרות (Figuמחדש 2A), אין GtgE תאית כמו דמיינו ידי חוסר מוקדי ניאון ירוקים. בניגוד לכך, תאי electroporated הלה (איור 2) מראים חלבון פלואורסצנטי משמעותי אות תאית מפעיל מצביע נכנס לתאים עקב תהליך electroporation. תאי RAW הראו נטייה מוגברת מעט לצבור חלבונים על פני השטח הסלולר במהלך הדגירה (איור 2 ג), אבל אות תאית הייתה לראות רק על electroporation (איור 2 ד).
קביעת הגבולות של זיהוי חזותי לוקליזציה משנה הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal הייתה חשובה כדי להבטיח מספיק חלבון נכנס לתא, תוך הימנעות עומס יתר התא עם effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל. באיור 3, GtgE היה electroporated לתוך תאים כמו מקרופאג-RAW ב 2.5, 25, ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר. התאים אז קובעו ונצבעו עם נוגדן נגד התג על GtgE. Only מספר קטן מאוד של מוקדים נצפו על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר GtgE (איור 3 א), עם מספרים מוגברות של מוקדים לכאורה במהירות של 25 מיקרוגרם / מיליליטר, (איור 3), אבל המספר הגדול ביותר של מוקדים שונים נראו בחלבון המרבי , 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז נבדק (איור 3 ג). דפוסי מכתים דומים נצפו בין הדגימות המצביעות בריכוזים חלבון אלה חלבון תאיים יכול להיות מאומת בקלות על ידי מיקרוסקופ confocal. ריכוזי חלבון מעל מיליליטר 50 מיקרוגרם / לא נבדקו משום שהריכוז של החלבון המוגבר, כך גם הנטייה לחלבון המטרה להפוך את הספיחה של התאים. כדי להימנע מאגרגטים חלבון קרום קשור של אלה, היה צורך לברכה שתי cuvettes electroporation להשיג מספיק מארח האינטראקציה חלבון לדמיין על כתם מערבי (איור 6, נתיב ימני).
כדי להדגים עוד כי intחלבון roduced לא פשוט את הספיחה של התא, חלקים אופטיים ברציפות היו צילמו במטוסי מוקד כל 0.35-0.43 מיקרומטרים (Z-ערימות) באמצעות מיקרוסקופ confocal. תאי RAW היו electroporated עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר GtgE ומוכתם כמתואר לעיל (איור 4, A ו- B). Z-הערימות הראו כי GtgE אכן הייתה תאית והמוקדים להאריך מלמטה (איור 4 א, מטוס 6 של 36) לחלק העליון של התא (איור 4, מטוס 26 36). תוצאות דומות התקבלו עבור כל חלבוני electroporated. פרופיל הניאון הפנימי של אוכלוסיות תאי שליטה עם ובלי חלבון מפעיל או electroporation נבדק על ידי מיקרוסקופ confocal ניאון, ונמצא זניחים.
בנוסף, חלבון electroporated נבדק כדי לראות אם זה היה ממוקד עבור השפלה, דרך את endocytic. תאים היו מוכתמים עבור 5A הקשורים לראס חלבון (Rab5),סמן לendosomes המוקדם (איור 4C), או חלבון הקשורים הליזוזום הקרום 1 (Lamp1), סמן לendosomes וlysosomes (איור 4D) מאוחר. שיתוף לוקליזציה בין חלבון electroporated וסמנים התאיים אלה מצביעה אינטראקציה קרובה פיזית ביניהם (כלומר שחלבון electroporated היה בתוך endosomes / lysosomes). מיקרוסקופיה Confocal הראתה כי חלבון electroporated (GFP או GtgE) לא שתף למקם עם LAMP1 או Rab5. זה היה להסיק מזה שהציג חלבון לא היה endocytosed ישירות לתוך התאים או ממוקדת למסלול endocytotic בתוך ארבע שעות של טיפול.
מבוא חלבון אקסוגני יכול להיות השפעות סלולריות במהלך כמה שעות או ימים, ולכן זה הוא לעתים קרובות מועיל לבחון את ההתמדה של חלבונים הציגו. כדי לקבוע כמה זמן חלבון electroporated יתמיד ללא השפלה לאחר electroporation. o מבוססתההדמיה n של התקשרות ותא הפצה, 4 שעות היו נחוש להיות זמן החלמה המינימאלי המשוער לתאי electroporated. באופן זמני ללהתבונן התמדת חלבון ניסוי זמן כמובן בוצע, מכתים את התאים 4, 24, או 96 שעות לאחר electroporation. לאחר 4 שעות (איור 5 א), כאשר מורפולוגיה של תאים הציעה התאוששות, הייתה כמות ניכרת של חלבון תאיים. לאחר 24 שעות (איור 5), עדיין לא היה חלבון Electroporated משמעותי בתוך התאים. גם כאשר הפעם אחר electroporation הוארכה עד 96 שעות לפני הקיבעון והכתים (איור 5 ג) היו מוקדים נצפים אם כי בשפע לכאורה מופחת, מדגימים ימי התמדת חלבון לאחר טיפול ראשוני.
שתי הסתייגויות חשובות נרשמו במהלך ניסויים אלו. תאי RAW הציגו נטייה גדולה יותר מתאי הלה לצבור חלבונים אקסוגניים על irre המשטח הסלולריspective של דגירה (איור 6 א) או electroporation (איור 6). למרות זאת, כל דגימות electroporated עלו חלבון פנימי (איורים 1, 2, 5). בנוסף, חלבון הקרום הקשורים נעלם עם זמן. אזהרה שנייה הייתה אוכלוסייה קטנה של תאים המציגים פנוטיפ המורכב מקטן, מעוגלת תאים לטעון בסכומים גבוהים של חלבונים אקסוגניים בשתי השליטה (מודגרות) והתאים שטופלו (electroporated) (איור 6 C ו- D, דגימות דגירה מוצגים). הגרעינים של תאים אלה הראו הכרומטין תמצית מבוסס על מכתים DAPI, ומילאו את השלמות של הנפח הסלולרי, רמיזות של אפופטוזיס. ניתן, אפוא, כי יש לי תאים אפופטוטיים (הנובעים כחלק נורמלי של מחזור התא או בשל קציר / טיפול) נטייה לספוג חלבון מן המאגר.
על מנת להוכיח כי חלבוני electroporated היו פונקציונליים ויכולים למקם קור ctly בתוך התא המארח, שיתוף הלוקליזציה והאינטראקציה בין חלבונים בין חלבון סלמונלה מפעיל SspH1 ויעד המארח הידוע שלה, חלבון kinase N1 (PKN1) 33 הוצגו. לאחר electroporation, האינטראקציה הפיסית בין SspH1 וPKN1 אומתה על ידי immunoprecipitation מבוססת זיקה ואחריו כתם המערבי (איור 7 א). שיתוף לוקליזציה נצפתה גם על ידי מיקרוסקופ confocal, אשר מציין את fluorophores קרובה מספיק מרחבית חפיפה 34. לאחר electroporation עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר SspH1, תאי הלה (איור 7) קובעו ונצבעו לSspH1 (ירוק) וPKN1 (אדום). במוקדי כוח הלייזר נמוך מובחנים (צהוב) נצפו בגרעין מעיד SspH1 וPKN1 היו קרוב פיזי מספיק כדי אינטראקציה. אינטראקציה זו כבר נקבעה בספרות; עם זאת מחקר זה הוא ראשון שהראה שיתוף לוקליזציה בגרעין.
= "תמיד"> 
איור 1: Electroporation של GFP - הלה או RAW 264.7 תאי תאים הודגרו או electroporated עם 25 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר (GFP) ומוכתמים עם נוגדן אנטי GFP (ירוקה), DAPI, בדיקה ספציפית גרעינית (כחול. ), וWGA (אדום) להתוות את גבול cytosolic. תאי הודגרו () הלה להראות היעדר הקרינה ירוקה המעידה על חוסר ההפנמה של GFP. (B) מראה photomicrograph נציג של ה- GFP electroporated. (ג) שים לב למראה של מוקדים תאיים המצביעים על GFP נכנס לתאים. ו( D) הם תמונות נציג של תאי RAW מודגרות (C), או electroporated (ד ') עם 25 מיקרוגרם / מיליליטר של חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר.
es / ftp_upload / 52,296 / 52296fig2highres.jpg "/>
איור 2:. Electroporation של סלמונלה מפעיל GtgE - תאי הלה תאים הודגרו (א) או electroporated (B) עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר של זיקה מתויג מפעיל סלמונלה, GtgE, ומוכתם עם נוגדן אנטי-מפעיל תג (ירוק), DAPI, מסכה גרעינית (כחולה), וWGA (אדום) להתוות את גבול cytosolic. ב (א), מודגרות תאי הלה להראות היעדר הקרינה ירוקה המעידה על חוסר ההפנמה של GtgE. (B) מראה photomicrograph נציג GtgE electroporated, מראה חלבון מפעיל תאית electroporated. (ג) ו- (ד) הם תמונות נציג תאי RAW שהודגרו או או electroporated, בהתאמה, באותו אופן עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר של סלמונלה GtgE. אור הכחול הוא שילוב, או כיסוי, של הקרינה אדומה מWGA והקרינה ירוקה מהנוגדנים משני.
איור 3: כותרות של חלבון electroporated - תאים כמו מקרופאג-RAW תאים היו electroporated עם 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר (א), 25 מיקרוגרם / מיליליטר (B), או 50 מיקרוגרם / מיליליטר (C) סלמונלה מפעיל GtgE ואפשרו להתאושש ל. 4 שעות. התאים קובעו ונצבעו עם נוגדן אנטי SBP-תג (ירוקה) ואת מסכת הגרעינים, DAPI (כחול). אפשר לדמיין מוקדי ניאון, מעידים על GtgE תאית על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר באמצעות microcopy confocal, למרות תוצאות טובות יותר הושגו כאשר סכום ההתחלתי גבוה יותר של חלבון היה בשימוש. תוצאות משביעות רצון (כוללים חלבון תאיים נצפה בקלות על ידי מיקרוסקופ confocal ללא אגרגטים הקשורים קרום מוגזם) התקבלו ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר לGtgE וכך no ריכוזים גדולים יותר נבדקו.
איור 4:. הפנמת חלבון וחוסר שיתוף לוקליזציה עם סמני אנדוזום פרוסות אופטיות עוקבות (Z- ערימות) המתקבלות על ידי מיקרוסקופ confocal לדמיין אם חלבון electroporated היה פנימי. תאי RAW היו electroporated עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר GtgE. (א) מראה פרוסה אופטי 6 של 36, Z- המחסנית (2.1 מיקרומטר) מעל החלק התחתון של המנה. (ב) מראה את אותו שדה הראייה אבל בפרוסה 26 36. מוקדים תאיים להאריך ברחבי התא מצביע על כך שהחלבון הוא באמת תאית ולא מצטבר על פני השטח של התא. אור הכחול הוא השילוב של WGA האדום, נוגדנים משני ירוקים, וDAPI הכחול. assay שיתוף לוקליזציה עם סמנים של endosomes / lysosomes, Rab5, (ג) או סמן הליזוזום, LAMP1 
איור 5: התמדת חלבון לאחר electroporation מיקרוסקופ Confocal מראה את ההתמדה של GtgE electroporated לאורך זמן.. 50 מיקרוגרם / מיליליטר GtgE היה electroporated לתוך תאי הלה. התאים אז קובעו ונצבעו עם נוגדן אנטי SBP-תג (ירוקה) ואת מסכת הגרעינים, DAPI (כחול). 4 שעות () היו נחושות בדעתו להיות הכמות המינימלית של זמן כדי לאפשר לתאים להתאושש וכצפויי תערוכות חלבון תאיים מרבי. לאחר 24 שעות (ב) ו- 96 שעות (C), מוקדים ירוקים, שני תאיות ועל celמשטח lular, התמדת מפעיל תכנית מצביעה על כך שהחלבון הוא לא ימים מושפלים לאחר הטיפול הראשוני. הצבע הכחול הבהיר בתמונה זו הוא הכיסוי של DAPI הכחול ומכתים הנוגדן הירוק. 
איור 6:. צבירת חלבון משטח נייד ופנוטיפ electroporation תאים כמו מקרופאג-RAW הודגרו או (א) או electroporated (B) עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר GtgE ומוכתם עם נוגדן אנטי SBP-תג (ירוק), WGA (Red ), ועם DAPI (הכחול). שני תאי הלה RAW 264.7 ובמידה פחותה יותר, נטו לצבור מפעיל על פני השטח של התא; כל תאי electroporated הוצגו גדלו חלבון פנימי (הלה לא מוצג). צהוב הוא הכיסוי של אדום והירוק מWGA מחלבון המטרה. RAW (C) והלה תאים (D) showing פנוטיפ שונה לאחר דגירה עם GtgE (עולם). כמה ניסויים הראו פנוטיפ המורכב מתאים קטנים עם ההפרש מכתים DAPI ופסד של ציטופלסמה. אור הכחול הוא הכיסוי מWGA האדום, נוגדנים משני ירוקים, וDAPI הכחול. מיקרוסקופיה confocal שימשה כדי להראות את חלבון המטרה המצטבר בגרעין. מאז פנוטיפ זה של תאי חלבון עמוס אקסוגניים הופיע לאחר שתי דגירה וelectroporation, אפשר לשער פנוטיפ זה להיות רמיזות של אפופטוזיס. 
איור 7:. אינטראקציות חלבון מארחת עם electroporated סלמונלה SspH1 - תאי הלה תאים היו electroporated בריכוזים המפורטים בSspH1, אפשרו להתאושש במשך 4 שעות לפני ביצוע טיהור זיקה שונה ואחריו כתם המערבי (A) להעשרה וללזהות את השותף המתנגש אוקריוטים הידוע: חלבון kinase סרין / תראונין N1 (PKN1). שים לב שהנתיב הימני (2x EP) כולל 2 cuvettes במאגר, כאות מקובט אחד התמזגה רקע, עדיין PKN1 עדיין מועשרת מעל חוסר כריכה ראה בשליטה ללא פיתיון. הכתם המערבי היה לרוץ עם lysate הלה ילידים, מטוהר SspH1, ודגימות טיהור זיקה לפני שמששו עם נוגדנים חד שבטיים לPKN1. גילוי מטרה הושג באמצעות נוגדנים משני peroxidase חזרת מצומדות עם תגובתיות נגד אלוטיפ של הנוגדן הראשוני. תאי הלה (B) מראה שיתוף לוקליזציה (צהובה) בין PKN1 (אדום) וSspH1 (ירוק) דרך על ידי מיקרוסקופ confocal לאחר electroporation עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר SspH1. חפיפה אופטית זה מצביעה על כך מפעיל וחלבון המארח קרובים מספיק כדי אינטראקציה פיזית. העובדה שהאינטראקציה הוצגה בגרעין בפעם הראשונה, מציעה תמיכה נוספת שהחלבון נסחר בצורה נכונה על ידי המארח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
effectors מופרש מחיידקים פתוגניים התפתחה כדי לתפקד בסביבת התא המארח, ולכן כדאי ללמוד אותם באתרו בתוך הפונדקאי. מבוא של effectors הספציפי של עניין לתאי מארח מאפשר אינטראקציות הפתוגן-המארח הרלוונטי כדי להיחקר בבידוד ללא הפרעות מחלבונים חיידק אחרים. המטרה הייתה לחקור electroporation כאמצעי להציג חלבוני מפעיל חיידקים לתאי מארח אוקריוטים, וכך להימנע מכמה מהאתגרים הקשורים transfection או התמרה. חלבון פלואורסצנטי ירוק שימש כביקורת וחלבוני מפעיל סלמונלה נבדקו. בגלל העניין בחיידקים פתוגנים כי היעד לארח תאי אפיתל, כמו גם תאי חיסון, קו אנושי כמו אפיתל תאים (הלה) ותאי עכבר כמו מקרופאג (RAW 264.7) היו בשימוש. Electroporation יכולה לספק חלבונים אקסוגניים לתאי מארח ללא ירידה ניכר בviabili תאty, והחלבונים נמסרו היו להבחין בתאים לתקופה של עד ארבעה ימים.
כדי לבודד את ההשפעות של חלבון electroporated, נדרש חלבון טהור. במחקר זה, חלבונים באו לידי ביטוי בE. BL21 זן coli עם תגי polyhistidine וstreptavidin N-terminal מחייב-peptide. חלבונים היו מטוהרים עם שרף Ni-נ.ת.ע, assayed לריכוז (בדרך כלל בין 5-25 מ"ג / מיליליטר) וטוהר, ומאוחסנים ב -80 ° C עד electroporation. חלבונים מיוצרים באופן מסחרי יהיו מקובלים גם לelectroporation, כפי שהם נוטים להיות של טוהר גבוה ומאופיין היטב.
שלבים עיקריים בפרוטוקול זה כללו הסרת לחלוטין בינוני תרבית תאים על ידי שטיפה והשעיית תאי חיץ ללא חלבון. הדבר מבטיח כי כל פנוטיפים במורד הזרם נצפו נובעים מחלבון אקסוגני של עניין ולא לחלבונים המצויים במדיום התרבות. יעילות טובה יותר של electroporation נצפתה כאשר צפיפות תאים הייתהגבוה יותר (6 x 10 6 לעומת למשל 1 x 10 6 תאים), אם כי המספר הסלולרי הטוב ביותר ישתנה עם גודל תא וסוג. עוד צעד קריטי בניסוי היה לאפשר זמן לתאים להתאושש ולצרף למאכלים; זה היה נחוץ משום תאים חסיד שמשו במחקר זה. תקופת החלמה צריכה להיות פחות חשובה לתאי השעיה, אם כי ייתכן שיהיה צורך לתת חלבונים זמן לסחר נכון תאיים, אינטראקציות בין חלבונים, או פעילות האנזימטית, בהתאם לאופי של המחקר המיועד. מאז חלבונים נמסרו נצפו בתוך תאים לתקופה של עד 96 שעות, יש הרבה מקום להתאמה לתקופת הדגירה לפני במיקרוסקופ הדמיה או assay הסלולרי.
מספר משתנה בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם לסוגי תאים שונים, מטרות חלבון, או תוכניות ניתוח במורד הזרם. כמות החלבון שelectroporated יכול להיות מכויל לריכוז תאיים הרצוי. Foההדמיה r של לוקליזציה חלבון, יכול לשמש כקטן כמו 1 מיקרוגרם. ללימודים פונקציונליים, כמויות התחלה גבוהות יותר של חלבונים עשויות להיות נחוצות. בנוסף, משך זמן להתאוששות תא לאחר electroporation ניתן לקצר או להאריך. מטרות חלבון יציבים או תהליכים במורד הזרם מהירים ידרשו זמן דגירה קצר יותר. כמו כן, כמות של תאים מצופים יכולה להיות מותאמת מעבר להצעות כאן. תאים עשויים להיות מצופים בדלילות יותר אם החלבון הציג הוא להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ, או מצופה יותר בצפיפות אם חלבון electroporated הוא להיות התאושש עבור יישומים כגון כתמים מערביים.
בעוד electroporation הוא שיטה פשוטה וישירה להחדרת חלבונים לתאים חיים, יש כמה מגבלות לטכניקה. השיטה דורשת חלבונים טהורים מאוד בכמויות מיקרוגרם. קטן כמו 1 מיקרוגרם היה electroporated ומדמיין עם מיקרוסקופיה confocal, אך כמויות התחלה גבוהות יותר של חלבון נתנו בטאה תוצאות חזותיות. בעוד תפקוד חלבון לא הוערך בכל הריכוזים לאחר electroporation, ריכוזי חלבון שווים או גדול מ -50 מיקרוגרם / מיליליטר נדרשו לאות מספקת לכתם מערבי. כמו כן, בשל אילוצי גודל cuvettes electroporation, גמלון עשוי לדרוש עיבוד של cuvettes מרובה של תאים. עם זאת, בהתחשב בכך שתהליך electroporation לוקח שניות בלבד לאחר תאים מוכנים, עיבוד מקביל דורש תוספת זמן ומאמץ קטן.
אם החלבון הציג הוא להיות דמיין ידי הכתם המערבי, מיקרוסקופיה, או המשמש לטיהור זיקה, החלבון צריך להיות תג 35 לטיהור זיקה או נוגדן זמין לצורך זיהוי. עם זאת, מסיבות שאינן ידועות, כמה אינטראקציות ידועות מהספרות או השיטות ביוכימיות אחרות (מידע לא מוצג) לא היו מסוגלת להיות סכם לאחר electroporation. יכול להיות שהמארח מכיר כמה חלבוני electroporated כמו Foreign ובמהירות מסמן אותם להשפלת פרוטאזום.
Electroporation מחזיקה במספר יתרונות על פני שיטות קיימות אחרות למסירת חלבון. בהשוואה לmicroinjection, electroporation הוא מהיר יותר והרבה יותר פשוט, ומספר גדול של תאים ניתן לטפל בו-זמנית עם כמעט 100 אחוזים יכולת קיום לתנאים שנבדקו. Electroporation הוא גם זול יותר מאשר transfection חלבון עם ריאגנטים זמינים מסחרי. transfections DNA משמש לעתים קרובות כדי ללמוד חלבוני מפעיל חיידקים בתאי מארח; עם זאת, זה גורם לחלבוני החיידק להיות מסונתזים שאינו באופן אידיאלי על ידי המארח. מצד השני, electroporation של חלבונים חיידקיים מסיר את ההסתמכות על מכונות ביטוי חלבון יונקים, המאפשר לייצוג טוב יותר של התהליך שבו חלבוני זיהומיות מפעיל באים לידי ביטוי על ידי החיידקים.
מספר יישומים יכולים להשתמש electroporation חלבון כשיטת בחקר חיידקי Intera-המארחctions. ראשית, תאים ראשוניים שהם לעתים קרובות קשה transfect עשויים להיות נוחים יותר לelectroporation למסירת חלבון. זה יאפשר לחקר תפקוד מפעיל בסוגי תאים רלוונטיים מבחינה ביולוגית יותר. Electroporation גם נותנת את האפשרות של חלבוני ריבוב ו / או טיפולים. לדוגמא, חלבונים מרובים עשויים להיות הציגו בו-זמנית, או תרופות ומולקולות קטנות אחרות יכולים להיות מועברים לצד חלבונים. חשוב ביותר להשגת הבנה פונקציונלית של ההשפעה של החלבונים הציגו, electroporation חלבון יכול להיות בשילוב עם מבחני לתפקוד חלבון ואינטראקציות, כגון טיהור זיקה, כתמים מערביים נגד מטרות ידועות, ניתוח ביטוי כל התא, ומיקרוסקופ כדי לקבוע subcellular לוקליזציה של החלבון הציג. לפיכך, יש בשיטה זו פוטנציאל גדול ככלי להבהרת הביולוגיה פתוגן חיידקים לצד טכניקות ביולוגיה תאיות ומולקולריות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
