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Immunology and Infection

स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक बैक्टीरियल effectors के electroporation

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52296
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 1, 1, 4
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

Abstract

जीवित कोशिकाओं के संदर्भ में प्रोटीन बातचीत का अध्ययन स्थानीयकरण, गतिशीलता, और बातचीत भागीदारों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उत्पन्न कर सकते हैं। यह जानकारी मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कई रोगज़नक़ प्रोटीन इंट्रासेल्युलर पर्यावरण के भीतर मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली और अस्तित्व की चोरी, सक्रिय करने के लिए इस तरह के रूप में जिस तरह की एक किस्म में मेजबान कोशिकाओं के भीतर कार्य करते हैं। इन रोगज़नक़ प्रोटीन मेजबान सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए, कई दृष्टिकोण सामान्यतः सहित उपयोग किया जाता है: विवो संक्रमण में अभिकर्मक या पारगमन के माध्यम से एक टैग या उत्परिवर्ती प्रोटीन, या रोगज़नक़ जीन की शुरूआत व्यक्त तनाव के साथ। इन तरीकों में से प्रत्येक के फायदे और नुकसान है। हम सीधे कोशिकाओं में बहिर्जात प्रोटीन को पेश करने का एक साधन की मांग की। Electroporation सामान्यतः कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन biophysical आधार बिल्कुल वैसा ही है, हालांकि अधिक शायद ही कभी प्रोटीन के लिए लागू किया गया है।एक मानक electroporator स्तनधारी कोशिकाओं में आत्मीयता टैग बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मानव उपकला और माउस मैक्रोफेज कोशिकाओं, पारंपरिक तरीकों से सुसंस्कृत अलग है, और ब्याज की एक बहिर्जात बैक्टीरियल रोगज़नक़ प्रोटीन (जैसे साल्मोनेला GtgE) के साथ 0.4 सेमी के अंतराल electroporation के cuvettes में रखा गया था। Electroporation के (0.3 केवी) और एक छोटी (4 घंटा) वसूली की अवधि के बाद, intracellular प्रोटीन fluorescently अपनी आत्मीयता टैग के माध्यम से प्रोटीन लेबलिंग और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थानिक और लौकिक वितरण की जांच से सत्यापित किया गया था। electroporated प्रोटीन भी सेल के अंदर कार्यात्मक और सही subcellular तस्करी और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत करने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया था। बहिर्जात प्रोटीन कोशिकाओं की सतह पर जमा हो जाती थी, वहीं electroporated नमूने अकेले ऊष्मायन के लिए इंट्रासेल्युलर प्रेरक एकाग्रता सापेक्ष में बड़े बढ़ जाती थी। प्रोटोकॉल एपी में किया जा करने के लिए सरल और तेजी से पर्याप्त हैsubcellular लक्ष्यीकरण और डाह प्रोटीन के समारोह सहित मेजबान कोशिकाओं में रोगज़नक़ प्रोटीन की उच्च throughput लक्षण वर्णन के लिए अनुमति arallel फैशन,।

Introduction

कई ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया सीधे मेजबान कोशिकाओं 1-5 में (प्रभावोत्पादक के रूप में करने के लिए कहा गया है) डाह से संबंधित प्रोटीन इंजेक्षन करने के लिए विशेष स्राव सिस्टम को रोजगार। मेजबान उन्मुक्ति का दमन, cytoskeletal परिवर्तन, intracellular तस्करी और संकेतन, ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन के संशोधन, और मेजबान Proteasome परिवर्तन 6-9: इन प्रभावोत्पादक सहित जैविक कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला है। कुछ effectors के कार्यों हालांकि मेजबान लक्ष्य और कई अन्य लोगों के जैव रासायनिक क्रिया (ओं) निर्धारित किया जाना बना रहता है, जाना जाता है। जंगली प्रकार और पुनः संयोजक बैक्टीरिया के संक्रमण की तुलना इंट्रासेल्युलर प्रेरक डाह तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक वैध दृष्टिकोण है, यह मेजबान सेल में एक व्यक्ति प्रेरक लागू करने के लिए अक्सर फायदेमंद है। इस प्रकार, मेजबान कोशिकाओं के संदर्भ में बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन शुरू करने और निस्र्पक के लिए सरल तरीकों अत्यधिक वांछनीय है।

प्रयोगात्मक विश्लेषण वाई सरल बनानेएक भी प्रेरक महत्वपूर्ण है वें अन्य प्रभावोत्पादक विरोध या अनावश्यक कार्यों में हो सकता है के रूप में। इस सरलीकरण को पूरा करने के लिए, शोधकर्ताओं ने पहले से नोच 12,13 लोड हो रहा है, वायरल पारगमन 10, microinjection के 11 सहित कई अलग अलग तरीकों, द्वारा कोशिकाओं में बड़े अणुओं पेश किया है, रासायनिक प्रेरित microinjection के 14, मालिकाना प्रोटीन "अभिकर्मक" अभिकर्मकों 15, कैल्शियम फास्फेट precipitations के साथ सेल संलयन 16, और electroporation 17-20। शुरू की अणुओं इंट्रासेल्युलर लक्ष्य 21,22 के लिए प्रोटीन, सेल अभेद्य रंजक, और एंटीबॉडी के लिए डीएनए, आरएनए, और आरएनएआई प्रजातियों सहित न्यूक्लिक एसिड से लेकर। कुछ तरीकों पेश किया जा सकता है कि macromolecule के प्रकार सहित सीमाएं हैं, और विशेष रूप से नीचे की ओर विश्लेषण के कारण उच्च सेलुलर विषाक्तता, कार्रवाई के हानिकारक तंत्र, कम प्रभावकारिता, या परिचय दक्षता के लिए सीमित हो सकती है। अभिकर्मक, एक ofteभी ऐसे मैक्रोफेज और प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में कुछ प्रासंगिक मेजबान सेल प्रकार, अभिकर्मक की ओर विशेष रूप से प्रतिरोधी रहे हैं कि सीमा ग्रस्त है, स्तनधारी कोशिकाओं में बैक्टीरियल जीन व्यक्त करने के लिए विधि एन इस्तेमाल किया। इस के अलावा, यह विदेशी डीएनए की शुरूआत पर उत्पादित बैक्टीरियल प्रोटीन के स्तर को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है।

ज्यादा काम एक आम प्रयोगशाला तकनीक के रूप में दोनों बैक्टीरिया और स्तनधारी कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड की electroporation की स्थापना की है; हालांकि, शारीरिक शर्तों के तहत कोशिकाओं में प्रोटीन देने के लिए सर्वोत्तम तरीकों में चल रहे अनुसंधान नहीं है। प्रोटीन अभिकर्मक पर रिपोर्ट वादा कर रहे हैं, लेकिन महंगा अभिकर्मकों और अनुकूलन की आवश्यकता है। न्यूनतम लागत के साथ सेल लक्ष्यों की एक विस्तृत विविधता में संभावित विषाक्त बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक शुरू करने की इच्छा vivo में इन प्रोटीनों के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में electroporation पर विचार करने के लिए हमें का नेतृत्व किया।

प्रोटीन electroporation के 23-25 ​​एक मुलाकात की हैयह भी विद्युत अभिकर्मक या विद्युत इंजेक्शन 26 के रूप में जाना electropermeabilization के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को पेश करने का HOD। इस तकनीक को कोशिका झिल्ली में pores बनाने के लिए उच्च तीव्रता विद्युत दालों का उपयोग करता है। ये प्रतिवर्ती pores के सामान्य रूप से intracellular अंतरिक्ष से बाहर रखा गया है कि बड़े अणुओं सेल में प्रवेश करने की अनुमति देते हैं। बाहरी बिजली के क्षेत्र के हटाने पर, झिल्ली सेल pores, 27,28 के माध्यम से पारित कर दिया है कि अणुओं को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, reseal कर सकते हैं।

एक मानक electroporator लगातार माउस मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह है और मानव उपकला कोशिकाओं दोनों में बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक लागू करने के लिए इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। विधि सेलुलर व्यवहार्यता में कोई सराहनीय कमी के साथ, त्वरित, कुशल और सस्ती है। शुरू की प्रोटीन immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना या कार्यात्मक assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस के साथ ही, एक गैर विषैले मानक के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया गया हैदो साल्मोनेला प्रेरक प्रोटीन, SspH1 और GtgE। हम यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरियल विषैलापन प्रोटीन और उनके कार्यों के अध्ययन के लिए प्रदर्शनों की सूची में एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में प्रोटीन electroporation के प्रस्ताव।

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Protocol

1. पहले से तैयार

  1. 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)।
  2. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक ईगल मध्यम (DMEM) और न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) के गर्म है Dulbecco संशोधन, 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन 37 डिग्री सेल्सियस के लिए। नोट: ये क्रमश: रॉ और हेला कोशिकाओं के लिए सामान्य वृद्धि मीडिया (एन जी एम) का प्रतिनिधित्व करते हैं।

प्रकोष्ठों के 2. तैयारी

  1. एन जी एम में 70-90% confluency को रॉ 264.7 कोशिकाओं को विकसित।
    1. एक humidified 95% हवा / 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
  2. एन जी एम में 70-90% confluency को हेला कोशिकाओं को विकसित।
    1. एक humidified 95% हवा / 5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने।
  3. संग्रह से पहले, बाँझ पीबीएस के साथ एक बार सेल monolayer धो लें।
  4. एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व मिला हुआ कोशिकाओं को इकट्ठा।
    1. धीरे रॉ कोशिकाओं परिमार्जनपीबीएस में एक रबर पुलिसकर्मी के साथ दोहराया pipetting के साथ सेल एकत्रित फैलाने के लिए।
    2. दृश्य परीक्षा संस्कृति सतह से हदबंदी से पता चलता है जब तक 0.25% trypsin समाधान के साथ हेला कोशिकाओं को अलग करें। उदाहरण के लिए, एक टी -75 कुप्पी के लिए 2 से 3 मिलीग्राम का उपयोग करें। Trypsin समाधान संपूर्ण विकास सतह शामिल हैं सुनिश्चित करने के लिए तदनुसार मात्रा समायोजित करें।
      1. एन जी एम 10% FBS युक्त साथ हदबंदी प्रतिक्रिया बुझाने।
      2. सेल एकत्रित फैलाने के लिए दोहराया pipetting के साथ, trypsin के लिए एन जी एम के कम से कम दो बार की मात्रा का प्रयोग करें।
  5. हल्के से 4 मिनट के लिए 900 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
  6. बाँझ पीबीएस का उपयोग / trypsin बुझाना समाधान के रूप में एक ही मात्रा में resuspend।
  7. Hemocytometer या कण काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  8. हल्के से 4 मिनट के लिए 900 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
  9. 5.5 एक्स 10 6 6 से 10 एक्स 6.0 कोशिकाओं / एमएल के लिए पीबीएस की पर्याप्त मात्रा में resuspend। नोट: उदाहरण के लिए, एक टी -75 फ्लास्क approxim निकलेगाately 7.5 x 10 6 कोशिकाओं 29।
  10. इलेक्ट्रोपोरेशन जब तक बर्फ पर सेल निलंबन रखें।

Electroporation के लिए 3. तैयारी

  1. बर्फ पर प्री-सर्द electroporation के cuvettes (0.4 सेमी जीएपी)।
  2. Electroporation के तंत्र को चालू करें और 0.3 केवी वोल्टेज निर्धारित किया है।
    नोट: समाई और प्रतिरोध (निर्माता द्वारा 10 μF और 600 Ω पर सेट) हमारे electroporator पर समायोज्य सेटिंग नहीं थे।
  3. एन जी एम के साथ वसूली प्लेटें भरें और 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified 95% हवा / 5% सीओ 2 के माहौल में संतुलित

4. Electroporation

  1. पूर्व ठंडा क्युवेट में सेल निलंबन के 400 μl प्लेस और क्युवेट (/ मिलीलीटर से 50 माइक्रोग्राम प्रति) के लिए चयनित प्रोटीन की 20 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ें।
  2. झाड़ क्युवेट धीरे ~ 10 बार कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना मिश्रण करने के लिए। नोट: क्युवेट भी मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए कई बार उलटा हो सकता है, लेकिन ऊपर pipet नहीं है और नीचे या भंवर कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए।
  3. 1.5-1.7 मिसे के लिए 0.3 केवी पर electroporate नमूना। नोट: यह इस अध्ययन के लिए विशिष्ट था।
  4. इसके तत्काल बाद electroporation झटका क्युवेट के बाद धीरे ~ 10 बार मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।

प्रकोष्ठों के 5. चढ़ाना

  1. तैयार है जब तक बर्फ पर electroporated कोशिकाओं के साथ स्टोर क्युवेट वसूली प्लेटों में जगह।
  2. सबसे नीचे की ओर विश्लेषण के लिए, बाहरी प्रेरक प्रोटीन को हटाने के लिए पूर्व गर्म एन जी एम के साथ कोशिकाओं 1x धो लें।
    1. विश्लेषण के लिए कोशिकाओं को हटाने और एन जी एम के 3-5 मिलीलीटर में निलंबित।
    2. 4 मिनट के लिए 900 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    3. वांछित थाली आकार (जैसे 35 मिमी पकवान के लिए 2 मिलीलीटर) के लिए एन जी एम की पर्याप्त मात्रा में resuspend।
  3. बहाव के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की उचित मात्रा में निकालें।
    1. उदाहरण 1: माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए गिलास नीचे बर्तन में थाली।
    2. उदाहरण 2: थाली पूर्णांकऐसी आत्मीयता purifications के रूप में प्रोटीन विश्लेषण के लिए ओ सेल संस्कृति प्लास्टिक की।
  4. कोशिकाओं में कम से कम चार घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर humidified 95% हवा / 5% सीओ 2 के माहौल में equilibrated प्लेटों में ठीक करने के लिए अनुमति दें।

6. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

6.1) फिक्सेशन / immunofluorescence धुंधला

  1. धो कोशिकाओं 4 घंटा वसूली की अवधि के बाद बाँझ पीबीएस के साथ 1x।
  2. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 100% मेथनॉल में कोशिकाओं को ठीक करें। पूरी तरह से कोशिकाओं (जैसे 2 मिलीलीटर 35 मिमी पकवान के लिए) को कवर करने के लिए पर्याप्त मेथनॉल का प्रयोग करें।
  3. बाँझ पीबीएस के साथ धो 3x।
  4. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.4% ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं permeabilize। उदाहरण के लिए, एक 35 मिमी व्यास की थाली के लिए 1 मिलीलीटर का उपयोग करें।
    1. मिलान और लक्ष्य प्रोटीन के स्थान के अनुसार ट्राइटन X-100 के permeabilization और ताकत की लंबाई को समायोजित। नोट: सर्वश्रेष्ठ परिणाम हालांकि उपरोक्त शर्तों सबसे ग के लिए पर्याप्त होना चाहिए, अनुभव से प्रत्येक लक्ष्य के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगीytosolic लक्ष्य।
  5. आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ ब्लॉक। उदाहरण के लिए, एक 35 मिमी व्यास की थाली के लिए 1 मिलीलीटर का उपयोग करें।
  6. पीबीएस के साथ धो 3x।
  7. 4 में रात भर एंटीबॉडी बाध्यकारी समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 और 1% बीएसए) सेते   कोमल कमाल के साथ सी °। उदाहरण के लिए, एक 35 मिमी व्यास की थाली के लिए 0.5 मिलीलीटर का उपयोग करें।
    1. एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें। नोट: 200 कमजोर पड़ने: PKN1 एंटीबॉडी एक में इस्तेमाल किया गया था, जबकि 1000 के कमजोर पड़ने: उदाहरण के लिए, streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड टैग (एसबीपी-टैग) एंटीबॉडी एक में इस्तेमाल किया गया था।
  8. पीबीएस के साथ धो 4x।
  9. प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एंटीबॉडी बाध्यकारी समाधान में उचित fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
    1. उदाहरण के लिए, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एलेक्सा 488 या एलेक्सा 647 का उपयोग करें।
      1. चींटी के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करेंibody कमजोर पड़ने। (उदाहरण के लिए के बारे में 1: 1000 इस अध्ययन के लिए)।
    2. उदाहरण के लिए, जरूरत के रूप में अन्य दाग जोड़ें, 5 माइक्रोन गेहूं के बीज agglutinnin (WGA) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए निर्माता की सिफारिश के अनुसार एलेक्सा 647 या DAPI के संयुग्मित।
  10. छवि के लिए तैयार है जब तक प्रकाश से सुरक्षित पीबीएस और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर से धो लें 5x,।

6.2) confocal माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

  1. एक 63x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर एक औंधा confocal खुर्दबीन पर छवि नमूने हैं।
    1. 492-542 एनएम के बीच बैंडविड्थ उत्सर्जन के साथ एक आर्गन लेजर की 488nm लाइन का उपयोग कर छवि ग्रीन चैनल,।
    2. 640-718 एनएम के बीच बैंडविड्थ उत्सर्जन के साथ एक 633 एनएम डायोड लेजर का उपयोग कर छवि लाल चैनल,।
    3. 407-453 एनएम के बीच बैंडविड्थ उत्सर्जन के साथ एक 405 एनएम डायोड लेजर का उपयोग कर छवि नीले चैनल,।
    4. जेड के ढेर सेलुलर मात्रा की सम्पूर्णता को कवर कई चैनल सुनिश्चित करें।
  2. उपयुक्त इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ इस प्रक्रिया छवियों।

7. आत्मीयता शुद्धि

  1. 4 घंटा वसूली की अवधि के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ दो बार electroporated कोशिकाओं को धो लें।
  2. साथ lyse ~ lysis बफर बर्फ पर (पीबीएस में protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला के साथ 1% ट्राइटन X-100) का 1.0 मिलीलीटर। निर्माता के निर्देशों के अनुसार अवरोधकों का प्रयोग करें। नोट: उदाहरण के लिए, दोनों इस अध्ययन में इस्तेमाल फॉस्फेट और प्रोटीज इनहिबिटर्स 100x में आपूर्ति की गई है, लेकिन अन्य योगों समान रूप से अच्छी तरह से काम करना चाहिए।
  3. तुरंत रबर पुलिसकर्मी के साथ कोशिकाओं परिमार्जन और शंक्वाकार ट्यूबों में इकट्ठा।
  4. जोरदार vortexing और sonication द्वारा lyse। नोट: अन्य सेल के तरीकों में समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, लेकिन क्षमता अनुभव से परख आवश्यकताओं की उपयुक्तता के रूप में निर्धारित करने की आवश्यकता होगी।
    1. रुक-रुक कर vortexing के साथ 3 एक्स 30 सेकंड Sonicate।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र इकट्ठा करने के लिएसेलुलर मलबे और अघुलनशील समुच्चय; सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।
  6. अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर Streptavidin agarose राल निलंबन के 50 μl के साथ electroporated सेल lysate के बराबर मात्रा (~ 1.0 मिलीलीटर) गठबंधन। नोट: यह राल अपने streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड आत्मीयता टैग के माध्यम से electroporated प्रोटीन (और जुड़े परिसरों) कब्जा।
  7. 2 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  8. 40 बिस्तर मात्रा (~ 1 एमएल) पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
  9. 30 μl 4x एलडीएस लोड हो रहा है बफर (141 मिमी Tris आधार, 2% एलडीएस, 10% ग्लिसरॉल, 0.51 मिमी EDTA, 0.22 मिमी SERVÄ ब्लू जी, लाल 0.175 मिमी फिनोल, पीएच 8.5), 20 μl DIH 2 हे, और 1 μl जोड़ें कुछ मात्रा की अनुमति के लिए 0.5 एम Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP), मोती में रहने के लिए।
  10. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और बर्फ पर शांत।
  11. स्पिन 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर> 10,000 XG।
  12. सतह पर तैरनेवाला लीजिए।
  13. उपयुक्त एंटीबॉडी नोट का उपयोग कर एक पश्चिमी धब्बा प्रदर्शन करना: वहफिर से, विरोधी PKN1 प्राथमिक एंटीबॉडी प्रयोग किया जाता है।

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Representative Results

अवधारणा के एक प्रारंभिक सबूत के रूप में, शुद्ध हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन सफलतापूर्वक इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग कर स्तनधारी कोशिकाओं में पेश किया गया था। GFP, एक अनुमानित 27 केडी एक आणविक वजन प्रोटीन सामान्यतः महत्वपूर्ण सेलुलर विषाक्तता के बिना एक आणविक जीव विज्ञान उपकरण के रूप में (सामान्य रूप से प्लास्मिड डीएनए से व्यक्त) स्तनधारी कोशिकाओं में शुरू की है। हेला कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) incubated या फ्लोरोसेंट GFP संकेत के लिए जाँच करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GFP के साथ (चित्रा 1 बी) electroporated थे। GFP के सेलुलर साइटोसॉल अंदर था कि प्रदर्शित करने के लिए, कोशिकाओं को भी नाभिक इंगित करने के लिए गेहूं के बीज agglutinin (WGA) साइटोसोलिक सीमा (लाल) चित्रित करने के लिए और साथ ही एक न्यूक्लिक एसिड दाग, DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। कोई इंट्रासेल्युलर प्रोटीन GFP के साथ incubated कोशिकाओं में मनाया गया, जबकि intracellular GFP संकेत, केवल इलेक्ट्रोपोरेशन पर मनाया गया। इसी तरह के परिणाम RAW264.7 माउस के साथ मनाया गयामैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह (चित्रा 1C और -1)। WGA के अधिमान्यतया ऊष्मायन की लंबाई के आधार पर कबरा धुंधला प्रदर्शन कर सकते हैं, इस प्रकार प्लाज्मा झिल्ली में अवशेषों को बांधता है और कहा कि एक लेक्टिन है कि ध्यान दें। चित्रा 2A चित्रा 1 ए से एक लंबी अवधि के लिए incubated किया गया था, जहां चित्रा 1 ए और 2A चित्रा, की तुलना करें।

Electroporation तो एक टैग, शुद्ध साल्मोनेला प्रेरक, GtgE के लिए बढ़ा दिया गया था। GtgE, एक ज्ञात विषैलापन कारक 30, हमारे समूह द्वारा की खोज की थी मेजबान कोशिकाओं 31 में स्रावित होने के लिए, और हाल ही में एक सिस्टीन प्रोटीज 32 होना दिखाया गया था। HELA कोशिकाओं incubated या 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE साथ electroporated थे। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं GtgE पर streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड आत्मीयता टैग के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। कोशिकाओं को भी WGA और DAPI के साथ दाग रहे थे। Figu (incubated HELA कोशिकाओं में) 2A पुनः, हरी फ्लोरोसेंट foci के अभाव द्वारा कल्पना के रूप में कोई इंट्रासेल्युलर GtgE है। इसके विपरीत, electroporated हेला कोशिकाओं (चित्रा 2B) महत्वपूर्ण फ्लोरोसेंट इंट्रासेल्युलर संकेत का संकेत प्रेरक प्रोटीन की वजह से electroporation प्रक्रिया के लिए कोशिकाओं में प्रवेश किया था दिखा। रॉ कोशिकाओं ऊष्मायन (चित्रा -2) के दौरान सेलुलर सतह पर प्रोटीन जमा करने के लिए एक थोड़ी वृद्धि हुई प्रवृत्ति से पता चला है, लेकिन इंट्रासेल्युलर संकेत केवल इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 2 डी) पर देखा गया था।

Confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उप सेलुलर स्थानीयकरण दृश्यमान करने के लिए पता लगाने की सीमाओं के निर्धारण संभावित विषाक्त बैक्टीरियल प्रभावोत्पादक के साथ सेल ओवरलोडिंग से परहेज करते हुए पर्याप्त प्रोटीन, सेल में प्रवेश किया सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण था। चित्रा 3 में, GtgE 2.5, 25 में कच्चे बृहतभक्षककोशिका की तरह कोशिकाओं में electroporated, और 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / किया गया था। कोशिकाओं तो तय है और GtgE पर टैग के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। हेnly foci के एक बहुत छोटी संख्या 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल, (3B चित्रा) में स्पष्ट foci के बढ़ी संख्या के साथ, 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE (चित्रा 3 ए) में मनाया गया, लेकिन अलग foci के सबसे बड़ी संख्या अधिकतम प्रोटीन पर देखा गया एकाग्रता का परीक्षण किया, 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (चित्रा -3 सी)। इसी प्रकार धुंधला पैटर्न इंट्रासेल्युलर प्रोटीन आसानी से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा सत्यापित किया जा सकता है इन प्रोटीन सांद्रता में दर्शाते हुए नमूनों के बीच मनाया गया। 50 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से ऊपर प्रोटीन सांद्रता तो कोशिकाओं की सतह पर adsorbed बनने के लिए लक्ष्य प्रोटीन के लिए प्रवृत्ति किया था, क्योंकि वृद्धि की प्रोटीन की एकाग्रता के रूप में परीक्षण नहीं किया गया। झिल्ली जुड़े प्रोटीन की इन समुच्चय से बचने के लिए, यह एक पश्चिमी धब्बा (चित्रा 6, अभी तक सही लेन) पर कल्पना करने के लिए प्रोटीन बातचीत काफी मेजबान प्राप्त करने के लिए दो electroporation के cuvettes पूल करने के लिए जरूरी हो गया।

आगे पूर्णांक को दिखाना है किroduced प्रोटीन बस सेल की सतह पर adsorbed नहीं किया गया था, लगातार ऑप्टिकल वर्गों हर 0.35-0.43 माइक्रोमीटर (जेड ढेर) confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग फोकल विमानों पर imaged थे। रॉ कोशिकाओं 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE साथ electroporated और (चित्रा 4, ए और बी) के ऊपर वर्णित के रूप में दाग रहे थे। जेड के ढेर GtgE इंट्रासेल्युलर वास्तव में दिखाया गया था कि और foci सेल (चित्रा 4 बी, विमान 36 से 26) के ऊपर से नीचे (चित्रा -4 ए, विमान 36 की 6) से करता हूं। इसी तरह के परिणाम सभी electroporated प्रोटीन के लिए प्राप्त किया गया। प्रेरक प्रोटीन या electroporation के साथ और बिना नियंत्रण सेल आबादी के आंतरिक फ्लोरोसेंट प्रोफाइल फ्लोरोसेंट confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी, और नगण्य हो पाया था।

इसके अतिरिक्त, electroporated प्रोटीन यह endocytic रास्ते के माध्यम से गिरावट के लिए निशाना बनाया गया था देखने के लिए अगर जांच की गई थी। प्रकोष्ठों रास से संबंधित प्रोटीन 5A (Rab5) के लिए दाग रहे थे, एकजल्दी endosomes (चित्रा 4C), या लाइसोसोम जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (Lamp1), देर endosomes और लाइसोसोम (चित्रा 4D) के लिए एक मार्कर के लिए मार्कर। Electroporated प्रोटीन और इन सेलुलर मार्करों के बीच सह स्थानीयकरण (electroporated प्रोटीन endosomes / लाइसोसोम के अंदर था कि आईई) उन दोनों के बीच एक करीबी शारीरिक बातचीत का संकेत होगा। Confocal माइक्रोस्कोपी electroporated प्रोटीन (GFP या GtgE) LAMP1 या Rab5 के साथ सह स्थानीय बनाना नहीं था कि पता चला है। यह सीधे कोशिकाओं में endocytosed या उपचार के चार घंटे के भीतर endocytotic मार्ग के लिए लक्षित नहीं किया गया प्रोटीन की शुरुआत की है कि इस से inferred किया गया था।

Exogenous प्रोटीन परिचय कई घंटों या दिनों के पाठ्यक्रम पर सेलुलर प्रभाव हो सकता है, और इस तरह इसे पेश प्रोटीन के हठ की जांच करने के लिए अक्सर फायदेमंद है। एक electroporated प्रोटीन electroporation के बाद गिरावट के बिना जारी रहती है कि कब तक यह निर्धारित करने के लिए। आधार ओलगाव और सेल के एन दृश्य, 4 घंटा electroporated कोशिकाओं के लिए अनुमानित न्यूनतम वसूली समय होने के लिए निर्धारित किया गया था फैल गया। अस्थायी प्रोटीन हठ का निरीक्षण करने के लिए एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग कोशिकाओं 4, 24, या electroporation के बाद 96 घंटा धुंधला हो जाना, प्रदर्शन किया गया था। सेल आकृति विज्ञान वसूली का सुझाव दिया है, जब चार घंटा (चित्रा 5A) के बाद, intracellular प्रोटीन की एक पर्याप्त राशि नहीं थी। 24 घंटा (चित्रा 5 ब) के बाद, कोशिकाओं के अंदर पर्याप्त Electroporated प्रोटीन अभी भी वहाँ था। Electroporation के बाद का समय निर्धारण और धुंधला (चित्रा 5C) प्रारंभिक उपचार के बाद प्रोटीन हठ दिनों का प्रदर्शन एक कम स्पष्ट बहुतायत में यद्यपि नमूदार foci, वहाँ थे पहले 96 घंटा के लिए बढ़ा दिया गया था यहां तक कि जब।

दो महत्वपूर्ण निरंतर इन प्रयोगों के दौरान नोट कर रहे थे। रॉ कोशिकाओं सेलुलर सतह irre पर बहिर्जात प्रोटीन जमा करने के लिए HELA कोशिकाओं की तुलना में एक बड़ा प्रवृत्ति का प्रदर्शनऊष्मायन के spective (चित्रा 6A) या electroporation (चित्रा 6B)। इस के बावजूद, सभी electroporated नमूने आंतरिक प्रोटीन (आंकड़े 1, 2, 5 ब) की वृद्धि हुई थी। इसके अतिरिक्त, झिल्ली जुड़े प्रोटीन समय के साथ गायब हो गया। एक दूसरी चेतावनी है, छोटे से मिलकर एक phenotype का प्रदर्शन कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी था दोनों नियंत्रण में बहिर्जात प्रोटीन की उच्च मात्रा के साथ भरी हुई कोशिकाओं गोल (incubated) और इलाज (electroporated) कोशिकाओं (चित्रा 6 सी और डी, ऊष्मायन के नमूने दिखाया गया है)। इन कोशिकाओं के नाभिक DAPI धुंधला के आधार पर संघनित क्रोमेटिन दिखाया है, और apoptosis के विचारोत्तेजक सेलुलर मात्रा की सम्पूर्णता, भर दिया। यह (फसल / उपचार के लिए सेल चक्र का एक सामान्य हिस्सा के रूप में या के कारण उत्पन्न होने वाली) apoptotic कोशिकाओं बफर से प्रोटीन को अवशोषित करने के लिए एक प्रवृत्ति है कि इसलिए संभव है।

Electroporated प्रोटीन कार्यात्मक थे और corre स्थानीयकरण सकता है कि प्रदर्शित करने के लिएctly साल्मोनेला प्रेरक प्रोटीन SspH1 और अपने ज्ञात मेजबान लक्ष्य, प्रोटीन काइनेज N1 (PKN1) 33 दिखाया गया था के बीच मेजबान सेल, सह स्थानीयकरण और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के अंदर। Electroporation के बाद, SspH1 और PKN1 के बीच शारीरिक संपर्क पश्चिमी धब्बा (चित्रा 7A) द्वारा पीछा एक समानता के आधार immunoprecipitation द्वारा सत्यापित किया गया था। सह स्थानीयकरण भी fluorophores के स्थानिक 34 ओवरलैप करने के लिए काफी करीब हैं जो इंगित करता है confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया। 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / SspH1 साथ electroporation के बाद, हेला कोशिकाओं (चित्रा 7B) तय किया गया और SspH1 (हरा) और PKN1 (लाल) के लिए दाग। कम लेजर शक्ति विशिष्ट foci (पीला) में SspH1 का संकेत नाभिक में मनाया और PKN1 बातचीत करने के लिए पर्याप्त शारीरिक रूप से करीब थे। इस बातचीत साहित्य में स्थापित किया गया है; हालांकि इस अध्ययन नाभिक में सह स्थानीयकरण पहले दिखाने के लिए है।

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चित्रा 1: GFP के electroporation - हेला या कच्चे 264.7 कोशिकाओं कोशिकाओं विरोधी GFP एंटीबॉडी (हरा), DAPI के एक परमाणु विशिष्ट जांच के साथ incubated या शुद्ध हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के 25 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ electroporated और दाग रहे थे (ब्लू। ), और WGA (लाल) साइटोसोलिक सीमा चित्रित करने के लिए। Incubated (ए) हेला कोशिकाओं GFP के internalization की कमी का संकेत है हरी प्रतिदीप्ति का अभाव दिखा। (बी) electroporated GFP के एक प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ पता चलता है। GFP कोशिकाओं में प्रवेश किया था यह दर्शाता इंट्रासेल्युलर foci के उपस्थिति ध्यान दें। (सी) और (डी) शुद्ध हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन का 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ कच्चे incubated कोशिकाओं (सी) के प्रतिनिधि के चित्र, या electroporated (डी) कर रहे हैं।

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चित्रा 2:। साल्मोनेला प्रेरक GtgE के electroporation - साल्मोनेला प्रेरक, GtgE, और एक विरोधी प्रेरक टैग एंटीबॉडी (हरा) के साथ दाग में चिह्नित हेला कोशिकाओं कोशिकाओं एक आकर्षण का 50 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ (ए) या ​​electroporated (बी) incubated रहे थे, DAPI के एक परमाणु मुखौटा (ब्लू), और WGA (लाल) साइटोसोलिक सीमा चित्रित करने के लिए। (ए) में। HELA कोशिकाओं GtgE के internalization की कमी का संकेत है हरी प्रतिदीप्ति का अभाव दिखा incubated (बी) के intracellular electroporated प्रेरक प्रोटीन दिखा, electroporated GtgE के एक प्रतिनिधि सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़ पता चलता है। (सी) और (डी) के प्रतिनिधि छवियाँ हैं या तो साल्मोनेला GtgE के 50 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर के साथ ही फैशन में, क्रमशः, incubated या electroporated गया है कि कच्चे कोशिकाओं। हल्का नीला WGA से लाल प्रतिदीप्ति का संयोजन, या ओवरले, औरमाध्यमिक एंटीबॉडी से हरी प्रतिदीप्ति।

चित्रा 3
चित्रा 3: electroporated प्रोटीन का अनुमापन - कच्चे मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह कोशिकाओं 2.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (ए), 25 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (बी), या 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल (सी) साल्मोनेला प्रेरक GtgE साथ electroporated और के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी गई। 4 घंटा। कोशिकाओं तय की और एक विरोधी एसबीपी-टैग एंटीबॉडी (हरा) और नाभिक मुखौटा, DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। यह प्रोटीन का उच्च प्रारंभिक राशि का उपयोग किया गया है, जब बेहतर परिणाम प्राप्त किया गया है, हालांकि confocal microcopy के माध्यम से 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर इंट्रासेल्युलर GtgE का संकेत फ्लोरोसेंट foci, कल्पना करने के लिए संभव है। (आसानी से अत्यधिक झिल्ली जुड़े समुच्चय बिना confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया इंट्रासेल्युलर प्रोटीन सहित) संतोषजनक परिणाम इस प्रकार एन GtgE के लिए 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर प्राप्त किया गयाओ अधिक से अधिक सांद्रता परीक्षण किया गया।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Electroporated प्रोटीन आंतरिक था अगर प्रोटीन internalization और endosome मार्कर के साथ सह स्थानीयकरण की कमी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त लगातार ऑप्टिकल स्लाइस (जेड ढेर) कल्पना करने के लिए। रॉ कोशिकाओं 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE साथ electroporated थे। (ए) 6 36 के ऑप्टिकल टुकड़ा से पता चलता है, पकवान के नीचे से ऊपर z ढेर (2.1 माइक्रोमीटर)। (बी) देखने की लेकिन टुकड़ा 26 के कम से एक ही क्षेत्र से पता चलता है 36. इंट्रासेल्युलर foci प्रोटीन सही मायने में intracellular और कोशिका की सतह पर एकत्रित नहीं है का संकेत है कि सेल भर में विस्तार। हल्के नीले रंग लाल WGA, हरी माध्यमिक एंटीबॉडी, और नीले DAPI का संयोजन है। Endosomes / लाइसोसोम, Rab5, (सी) या एक लाइसोसोम मार्कर, LAMP1 के मार्कर के साथ सह स्थानीयकरण परख

चित्रा 5
चित्रा 5: electroporation के बाद प्रोटीन हठ समय के साथ electroporated GtgE के हठ दिखा Confocal माइक्रोग्राफ।। 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE हेला कोशिकाओं में electroporated किया गया था। कोशिकाओं तो तय है और एक विरोधी एसबीपी-टैग एंटीबॉडी (हरा) और नाभिक मुखौटा, DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे। 4 घंटा (ए) कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए समय की न्यूनतम राशि होने के लिए निर्धारित किया गया था और उम्मीद के रूप में अधिकतम इंट्रासेल्युलर प्रोटीन से पता चलता है। Intracellular और सेल पर दोनों को 24 घंटा (बी) और 96 घंटा (सी), हरी foci के बादlular सतह, शो प्रेरक हठ प्रोटीन अपमानित दिनों प्रारंभिक उपचार के बाद नहीं है कि यह दर्शाता है। इस छवि में हल्के नीले रंग नीला DAPI और हरी एंटीबॉडी धुंधला की ओवरले है।

चित्रा 6
चित्रा 6:। कोशिका की सतह प्रोटीन एकत्रीकरण और एक electroporation के फेनोटाइप रॉ मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह या तो लाल (50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / GtgE साथ (ए) या ​​electroporated (बी) incubated और विरोधी एसबीपी-टैग एंटीबॉडी (हरा), WGA के साथ दाग रहे थे ), और DAPI (नीला) के साथ। दोनों 264.7 रॉ और एक हद तक HELA कोशिकाओं, कोशिका की सतह पर प्रेरक कुल जाती थी; सभी electroporated कोशिकाओं आंतरिक प्रोटीन की वृद्धि हुई है दिखाया गया (हेला नहीं दिखाया गया है)। पीला लक्ष्य प्रोटीन से WGA से लाल की ओवरले और हरे रंग का है। Showin रॉ (सी) और हेला (डी) कोशिकाओंजी GtgE साथ ऊष्मायन के बाद एक बदल फेनोटाइप (दिखाया गया है)। कई प्रयोगों अंतर DAPI धुंधला और कोशिका द्रव्य के नुकसान के साथ छोटे कोशिकाओं से मिलकर एक phenotype दिखाया। हल्के नीले रंग लाल WGA, हरी माध्यमिक एंटीबॉडी, और नीले DAPI से ओवरले है। Confocal माइक्रोस्कोपी नाभिक में जमते लक्ष्य प्रोटीन को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। बहिर्जात प्रोटीन से लदी कोशिकाओं के इस phenotype ऊष्मायन और electroporation दोनों के बाद दिखाई दिया, एक apoptosis के विचारोत्तेजक होने के लिए इस phenotype परिकल्पना सकता है।

चित्रा 7
चित्रा 7:। Electroporated साल्मोनेला SspH1 साथ होस्ट प्रोटीन बातचीत - पश्चिमी धब्बा (ए) के बाद संशोधित आत्मीयता शुद्धि के प्रदर्शन से पहले 4 घंटे के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी प्रकोष्ठों SspH1 के साथ सूचीबद्ध सांद्रता में electroporated गया HELA कोशिकाओं, के लिए समृद्ध करने के लिए औरनाम से जाना जाता यूकेरियोटिक बातचीत साथी का पता लगाने: सेरीन / threonine प्रोटीन काइनेज N1 (PKN1)। एक क्युवेट से संकेत पृष्ठभूमि में मिश्रित, अभी तक PKN1 अभी कोई चारा नियंत्रण में देखा बंधन की कमी से ऊपर समृद्ध था के रूप में दूर सही लेन (2x ईपी), 2 जमा cuvettes भी शामिल है कि ध्यान दें। पश्चिमी धब्बा, देशी हेला lysate के साथ चलाने के SspH1 शुद्ध, और इससे पहले आत्मीयता शुद्धि नमूने PKN1 करने के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ जांच की जा रही थी। लक्ष्य का पता लगाने प्राथमिक एंटीबॉडी के निर्धारण के खिलाफ जेट के साथ एक हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के माध्यम से प्राप्त हुई थी। HELA कोशिकाओं 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / SspH1 साथ electroporation के बाद confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा के माध्यम से PKN1 (लाल) और SspH1 (हरा) के बीच सह स्थानीयकरण (पीला) दिखा रहा है (बी)। इस ऑप्टिकल ओवरलैप प्रेरक और मेजबान प्रोटीन शारीरिक रूप से बातचीत करने के लिए काफी करीब हैं कि इंगित करता है। बातचीत के लिए पहली बार नाभिक में दिखाया गया था तथ्य यह है कि, अतिरिक्त सहायता प्रदान करता है किप्रोटीन मेजबान द्वारा सही ढंग से तस्करी कर रहा था।

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Discussion

रोगजनक बैक्टीरिया से स्रावित प्रभावोत्पादक मेजबान सेल पर्यावरण के भीतर कार्य करने के लिए विकसित किया है और इस तरह यह मेजबान भीतर बगल में उन्हें अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। मेजबान कोशिकाओं में ब्याज की विशिष्ट प्रभावोत्पादक का परिचय प्रासंगिक रोगज़नक़ मेजबान बातचीत अन्य बैक्टीरियल प्रोटीन से हस्तक्षेप के बिना अलगाव में अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति देता है। लक्ष्य जिससे अभिकर्मक या पारगमन के साथ जुड़े चुनौतियों में से कुछ से बचने, यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन को पेश करने का एक साधन के रूप में electroporation का पता लगाने के लिए किया गया था। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और साल्मोनेला प्रेरक प्रोटीन परीक्षण किया गया। क्योंकि उपकला कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मेजबानी लक्ष्य है कि बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के हित में, एक मानव उपकला-तरह सेल लाइन (हेला) और माउस मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह (264.7 रॉ) का इस्तेमाल किया गया था। Electroporation सेल viabili में कोई सराहनीय कमी के साथ मेजबान कोशिकाओं में बहिर्जात प्रोटीन वितरित कर सकते हैंTy, और वितरित प्रोटीन ऊपर से चार दिनों के लिए कोशिकाओं में detectable थे।

Electroporated प्रोटीन के प्रभाव को अलग करने के लिए, शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में, प्रोटीन ई में व्यक्त किया गया एन टर्मिनल polyhistidine और streptavidin बाध्यकारी पेप्टाइड टैग के साथ कोलाई तनाव BL21। प्रोटीन एकाग्रता (आमतौर के बीच 5-25 मिलीग्राम / एमएल) और पवित्रता के लिए assayed, नी NTA राल के साथ शुद्ध, और electroporation तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। वे उच्च शुद्धता और अच्छी तरह से विशेषता के हो जाते हैं के रूप में वाणिज्यिक उत्पादन प्रोटीन भी, electroporation के लिए स्वीकार्य होगा।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम पूरी तरह से धोने से सेल संस्कृति के माध्यम से दूर करने और प्रोटीन से मुक्त बफर में कोशिकाओं को निलंबित शामिल थे। इस मनाया किसी भी नीचे की ओर phenotypes के हित के बहिर्जात प्रोटीन करने के लिए नहीं है और संस्कृति के माध्यम में मौजूद प्रोटीन की वजह से कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करता है। सेल घनत्व था जब electroporation की बेहतर दक्षता मनाया गयासबसे अच्छा सेल नंबर सेल आकार और प्रकार के साथ अलग अलग होंगे, हालांकि, (उदाहरण के लिए 6 एक्स 10 6 बनाम 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) अधिक है। प्रयोग में एक और महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं समय की वसूली और बर्तन को पुनः अनुलग्न करने की अनुमति के लिए गया था; पक्षपाती कोशिकाओं इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि यह आवश्यक था। यह इरादा अध्ययन की प्रकृति पर निर्भर करता है, उचित इंट्रासेल्युलर तस्करी, प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, या enzymatic गतिविधि के लिए प्रोटीन समय देने के लिए आवश्यक हो सकता है, हालांकि एक वसूली अवधि, निलंबन की कोशिकाओं के लिए कम महत्वपूर्ण होना चाहिए। वितरित प्रोटीन 96 घंटा अप करने के लिए कोशिकाओं के अंदर मनाया गया के बाद से, दृश्य या सेलुलर परख माइक्रोस्कोपी के पूर्व ऊष्मायन अवधि के लिए समायोजन के लिए ज्यादा गुंजाइश नहीं है।

इस प्रोटोकॉल में कई चर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, प्रोटीन लक्ष्य, या नीचे की ओर विश्लेषण योजनाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटीन की मात्रा वांछित इंट्रासेल्युलर एकाग्रता के लिए ठीक-देखते जा सकता है electroporated किया जाना है। एफओप्रोटीन स्थानीयकरण के आर दृश्य, के रूप में छोटे रूप में 1 माइक्रोग्राम प्रति इस्तेमाल किया जा सकता है। कार्यात्मक अध्ययन के लिए, प्रोटीन की उच्च प्रारंभिक मात्रा की जरूरत हो सकती है। इसके अलावा, के बाद electroporation सेल वसूली के लिए समय की राशि shorted या बढ़ाया जा सकता है। अस्थिर प्रोटीन लक्ष्य या तेजी से नीचे की ओर प्रक्रियाओं एक छोटी ऊष्मायन समय की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, चढ़ाया कोशिकाओं की राशि यहाँ सुझावों को परे समायोजित किया जा सकता है। शुरू की प्रोटीन माइक्रोस्कोपी द्वारा निगरानी, ​​या electroporated प्रोटीन ऐसे पश्चिमी blots के रूप में आवेदन के लिए ठीक किया जा रहा है अगर अधिक घनी चढ़ाया जा रहा है यदि कोशिकाओं को और अधिक कम चढ़ाया जा सकता है।

Electroporation के जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को शुरू करने के लिए एक सरल और सीधा तरीका है, तकनीक के लिए कुछ सीमाएं हैं। विधि माइक्रोग्राम मात्रा में अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता है। के रूप में छोटे से एक के रूप में माइक्रोग्राम प्रति electroporated और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना है, लेकिन प्रोटीन का उच्च प्रारंभिक मात्रा bett दिया गया थादृश्य परिणाम एर। प्रोटीन समारोह electroporation के बाद सभी सांद्रता में मूल्यांकन नहीं कर रहा था, के बराबर या अधिक से अधिक से अधिक 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / प्रोटीन सांद्रता पश्चिमी धब्बा के लिए पर्याप्त संकेत के लिए आवश्यक थे। इसके अलावा, electroporation के cuvettes के आकार की कमी की वजह से, ऊपर स्केलिंग कोशिकाओं के कई cuvettes के प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, कोशिकाओं से तैयार कर रहे हैं एक बार में electroporation प्रक्रिया मात्र सेकंड लेता है, विचार है कि समानांतर प्रसंस्करण थोड़ा अतिरिक्त समय और प्रयास की आवश्यकता है।

शुरू की प्रोटीन पश्चिमी धब्बा, माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना, या आत्मीयता शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, प्रोटीन आत्मीयता शुद्धि या पता लगाने के लिए कोई उपलब्ध एंटीबॉडी के लिए एक टैग 35 होनी चाहिए। हालांकि, अज्ञात कारणों के लिए, साहित्य या अन्य जैव रासायनिक तरीकों (नहीं दिखाया डेटा) से भी जाना जाता है कुछ बातचीत electroporation के बाद recapitulated जा करने में सक्षम नहीं थे। यह मेजबान च के रूप में कुछ electroporated प्रोटीन पहचानता है कि हो सकता हैजल्दी oreign और Proteasome गिरावट के लिए उन्हें चिह्नित करता है।

Electroporation प्रोटीन प्रसव के लिए अन्य मौजूदा तरीकों पर कई फायदे रखती है। Microinjection की तुलना में, electroporation के बहुत तेजी से और सरल है, और कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का परीक्षण स्थितियों के लिए लगभग 100 प्रतिशत व्यवहार्यता के साथ एक बार में इलाज किया जा सकता है। Electroporation भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के साथ प्रोटीन अभिकर्मक की तुलना में सस्ता है। डीएनए transfections के अक्सर मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरियल प्रेरक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि, इस बैक्टीरियल प्रोटीन मेजबान द्वारा गैर आदर्श रूप से संश्लेषित किया जा करने के लिए कारण बनता है। दूसरी ओर, बैक्टीरियल प्रोटीन की electroporation प्रेरक प्रोटीन बैक्टीरिया द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, जहां संक्रामक प्रक्रिया को बेहतर ढंग से प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देता है, स्तनधारी प्रोटीन अभिव्यक्ति मशीनरी पर निर्भरता को हटा।

कई आवेदन बैक्टीरियल मेजबान intera के अध्ययन में एक विधि के रूप में प्रोटीन electroporation के इस्तेमाल कर सकते हैंctions। सबसे पहले, अक्सर transfect करने के लिए मुश्किल हो जाता है कि प्राथमिक कोशिकाओं में प्रोटीन प्रसव के लिए electroporation के लिए उत्तरदायी हो सकता है। यह और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं में प्रेरक समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देगा। Electroporation भी बहुसंकेतन प्रोटीन और / या उपचार का विकल्प देता है। उदाहरण के लिए, कई प्रोटीन एक साथ पेश किया जा सकता है, या दवाओं और अन्य छोटे अणुओं प्रोटीन के साथ दिया जा सकता है। Subcellular निर्धारित करने के लिए, प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन ऐसी आत्मीयता शुद्धि, ज्ञात लक्ष्य, पूरे सेल अभिव्यक्ति विश्लेषण के खिलाफ पश्चिमी blots, और माइक्रोस्कोपी के रूप में प्रोटीन समारोह और बातचीत के लिए assays के साथ मिलकर किया जा सकता है शुरू की प्रोटीन के प्रभाव का एक कार्यात्मक समझ प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण है शुरू की प्रोटीन का स्थानीयकरण। इसलिए, इस विधि अन्य सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान तकनीक के साथ बैक्टीरियल रोगज़नक़ जीव विज्ञान elucidating के लिए एक उपकरण के रूप में काफी क्षमता है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution Cellgro 25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes Bio-Rad 165-2088
100% Methanol Any N/A Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter Beckman Coulter Model Z1
Cell Culture Incubator Any N/A Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C 
Cell Culture Plastic Any N/A Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) Cellgro 10-013 Warm to 37 °C 
Electroporator Bio-Rad E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-016-CV
Fluorescent confocal microscope  Ziess Model  LSM 710 
Glass Bottom Dishes for Microscopy Wilco Wells HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail Pierce 78430 Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line ATCC ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer Invitrogen NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)  Cellgro 10-010 Warm to 37 °C 
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent Any N/A
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line ATCC TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest Any N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore Any N/A
Phosphate Buffered Saline Any N/A Chill to 4 °C 
Sterile Phosphate Buffered Saline Any N/A Warm to 37 °C 
Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin Agarose Resin Suspension  Pierce 20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) Any N/A
TCEP Sigma-Aldrich 646547 Corrosive, Toxic
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8585 Irritant, Toxic

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References

  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
  3. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
  4. Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
  5. He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
  6. Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
  7. Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
  8. Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
  9. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
  10. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
  11. Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
  13. Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
  14. Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
  15. Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
  16. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
  17. Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
  18. Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
  19. Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
  20. Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
  21. Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
  22. Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
  23. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
  25. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
  26. Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
  27. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
  28. Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
  29. McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
  30. Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
  31. Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
  32. Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
  33. Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
  34. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
  35. Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).

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इम्यूनोलॉजी अंक 95 इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटीन अभिकर्मक अभिव्यक्ति स्थानीयकरण confocal माइक्रोस्कोपी साल्मोनेला प्रेरक
स्तनधारी कोशिकाओं में कार्यात्मक बैक्टीरियल effectors के electroporation
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Sontag, R. L., Mihai, C., Orr, G., Savchenko, A., Skarina, T., Cui, H., Cort, J. R., Adkins, J. N., Brown, R. N. Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (95), e52296, doi:10.3791/52296 (2015).

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