Abstract
Studiet av protein interaksjoner i sammenheng med levende celler kan generere kritisk informasjon om lokalisering, dynamikk og samspill partnere. Denne informasjonen er spesielt verdifull i sammenheng med verts-patogen interaksjoner. Mange patogene proteiner fungere innenfor vertsceller i en rekke slik som for eksempel, slik at omgåelse av vertens immunsystem og overlevelse i den intracellulære miljøet. Å studere disse patogen-protein host-celle interaksjoner, er flere tilnærminger brukte, inkludert: in vivo infeksjon med en belastning som uttrykker et kodet eller mutant protein, eller innføring av patogen gener via transfeksjon eller transduksjon. Hver av disse metoder har fordeler og ulemper. Vi har søkt et middel til direkte å innføre eksogene proteiner i celler. Elektroporering er vanlig brukt for å introdusere nukleinsyrer inn i celler, men er mer sjeldent brukt til proteiner, selv om den biofysiske basis er nøyaktig den samme.En standard electroporator ble anvendt for å innføre affinitet-merkede bakterielle effektorer inn i pattedyrceller. Menneskelige epiteliale og musemakrofag celler ble dyrket av tradisjonelle metoder, enebolig, og plassert i 0,4 cm gap electroporation kyvetter med en eksogen bakteriell patogen protein av interesse (f.eks Salmonella Typhimurium GtgE). Etter elektroporering (0,3 kV) og en kort (4 timer) restitusjonsperiode, ble intracellulært protein verifisert ved fluorescens-merking av proteiner via sin affinitetsmerkelapp og undersøker romlige og tidsmessige fordeling av konfokal mikroskopi. Den elektroporert protein ble også vist å være funksjonelle inne i cellen og i stand til korrekt subcellulære handel og protein-protein-interaksjon. Mens de eksogene proteiner tendens til å hope seg opp på overflaten av cellene, de elektroporerte prøver hadde store økninger i intracellulært effektor-konsentrasjon i forhold til inkubasjon alene. Protokollen er enkel og rask nok til å bli gjort i aparallel mote, slik at for høy gjennomstrømming karakterisering av patogen proteiner i vertsceller inkludert subcellulære målretting og funksjon av virulens proteiner.
Introduction
Mange Gram-negative bakterier anvende spesialiserte sekresjons-systemer for å injisere virulens-relaterte proteiner (referert til som effektorer) direkte inn i vertsceller 1-5. Disse effektorer har et bredt spekter av biologiske funksjoner, inkludert: undertrykkelse av verts immunitet, cytoskeletal endringer, endring av intracellulær trafficking og signalering, transkripsjons endringer, og vert proteasomer endringer 6-9. Funksjonene til noen effektorer er kjent, men verts mål og biokjemiske virkning (r) av mange andre gjenstår å bli bestemt. Mens sammenligne villtype og rekombinante bakterielle infeksjoner er en gyldig metode for å studere intracellulære effektor virulensmekanismer, er det ofte fordelaktig å innføre en individuell effektor inn i vertscellen. Det er således meget ønskelig enkle metoder for innføring og karakter bakterielle effektor-proteiner i forbindelse med vertsceller.
Forenkling av eksperimentell analyse with en enkelt effektor er kritisk som andre effektorer kan ha motstridende eller overflødige funksjoner. For å oppnå dette forenkling, har forskerne tidligere innført makromolekyler i cellene av mange forskjellige metoder, inkludert viral transduksjon 10, mikroinjeksjon 11, skrape lasting 12,13, cellefusjon med kjemisk indusert mikroinjeksjon 14, proprietær protein "transfeksjonsteknologier" reagenser 15, kalsiumfosfat utfellinger 16, og elektroporasjon 17-20. De innførte molekyler varierer fra nukleinsyrer, inkludert DNA, RNA, og RNAi art til proteiner, celle-ugjennomtrengelig fargestoffer, og antistoffer for intracellulære mål 21,22. Noen metoder har begrensninger inkludert type makromolekyl som kan bli innført, og det spesielle nedstrøms analyser kan være begrenset på grunn av høy cellulær toksisitet, skadelige virkningsmekanismer, lav effekt, eller innføring effektivitet. Transfeksjon, et Often-brukte metoden for å uttrykke gener i pattedyrceller, også lider den begrensning at noen aktuelle vertscelletyper, slik som makrofager og primærceller, er spesielt motstandsdyktig mot transfeksjon. Utover dette er det vanskelig å kontrollere nivåene av bakterielt protein fremstilt ved innføring av fremmed DNA.
Mye arbeid har etablert elektroporering av nukleinsyrer i både bakterie- og pattedyrceller som et felles laboratorium teknikk; derimot, er det pågående forskning på de beste metoder for levering av proteiner i celler under fysiologiske betingelser. Rapporter om protein transfeksjon er lovende, men krever dyre reagenser og optimalisering. Ønsket om å innføre potensielt toksiske bakterielle effektorer i et bredt spekter av celle mål med minimal kostnad førte oss til å vurdere elektroporering som en fremgangsmåte for å studere disse proteiner in vivo.
Protein elektroporering 23-25 er en oppfylthod å innføre proteiner inn i levende celler via electropermeabilization, også kjent som elektro-transfeksjon eller elektro-injeksjon 26. Denne teknikken bruker høy intensitet elektriske pulser å skape porer i cellemembraner. Disse reversible porer tillate makromolekyler som er normalt utelukket fra intracellulære plass til å gå inn i cellen. Ved fjerning av det ytre elektriske felt, kan membranen forsegles, slik at cellen til å beholde molekyler som passerte gjennom porene 27,28.
En standard electroporator ble anvendt i denne studien er å konsekvent innføre bakterielle effektorer i begge musemakrofaglignende celler og humane epitelceller. Metoden er rask, effektiv og billig, uten noen nevneverdig reduksjon i cellulære levedyktighet. De innførte proteiner kan visualiseres via immunfluorescens-mikroskopi eller benyttes til funksjonelle analyser. Dette er blitt vist ved hjelp av grønt fluorescerende protein (GFP) som et ikke-toksisk standard, så vel somto Salmonella effektor proteiner, SspH1 og GtgE. Vi foreslår protein elektroporering som et ekstra verktøy i repertoaret for studier av bakteriell virulens proteiner og deres funksjoner i eukaryote vertsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forbered i Advance
- Varm steril fosfatbufret saltløsning (PBS) til 37 ° C.
- Varm Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (DMEM) og Minimal Essential Medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 IU / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin til 37 ° C. Merk: Disse representerer Normal Vekst Media (NGM) for RAW og HeLa celler henholdsvis.
2. Fremstilling av Cells
- Vokse RAW 264,7 celler til 70-90% konfluens i NGM.
- Opprettholde cellene ved 37 ° C i en fuktet 95% luft / 5% CO2 atmosfære.
- Grow HeLa celler til 70-90% konfluens i NGM.
- Opprettholde cellene ved 37 ° C i en fuktet 95% luft / 5% CO2 atmosfære.
- Før samlingen, vaske cellemonolag gang med steril PBS.
- Samle pre-konfluente celler i et sterilt konisk rør.
- Forsiktig skrape RAW-cellermed en gummi politimann i PBS, til med gjentatt pipettering spre celle samlinger.
- Løsne HeLa celler med 0,25% trypsinoppløsning inntil visuell undersøkelse viser dissosiasjon fra kultur overflaten. For eksempel bruke 2 til 3 ml for en T-75 kolbe. Justere volumet tilsvarende for å sikre trypsinoppløsning dekker hele veksten overflaten.
- Stans reaksjonen med dissosiasjon NGM inneholdende 10% FBS.
- Bruk minst to ganger volumet av NGM til trypsin, med gjentatt pipettering å spre celle samlinger.
- Lett pelletere cellene ved sentrifugering ved 900 x g i 4 minutter.
- Resuspender i samme volum som trypsin / slukke løsning ved hjelp av steril PBS.
- Telle celler ved hjelp hemocytometer eller partikkelteller.
- Lett pelletere cellene ved sentrifugering ved 900 x g i 4 minutter.
- Resuspender i tilstrekkelig volum av PBS i 5.5 x 10 6 til 6,0 x 10 6 celler / ml. Merk: For eksempel vil en T-75 kolbe gi approximbart 7,5 x 10 6 celler 29.
- Hold cellesuspensjon på is inntil elektroporering.
3. Forberedelse til Electroporation
- Pre-Chill electroporation kyvetter (0,4 cm gap) på is.
- Slå på elektroporering apparater og sette spenningen til 0,3 kV.
MERK: Kapasitans og motstand var ikke justerbare innstillinger på vår electroporator (satt til 10 uF og 600 Ω av produsenten). - Fyll recovery plater med NGM og likevekt i fuktet 95% luft / 5% CO 2 atmosfæren ved 37 ° C.
4. Electroporation
- Plasser 400 ul av cellesuspensjonen i pre-avkjølt kyvette og tilsett 20 ug av proteinet valgt til kyvetten (50 ug / ml).
- Flick cuvette forsiktig ~ 10 ganger for å blande uten å skade celler. Merk: kyvetten kan også vendes flere ganger for å bland godt, men ikke pipettér opp og ned eller vortex å unngå å skade celler.
- Electroporate prøve på 0,3 kV for 1.5 til 1.7 msek. Merk: Dette var typisk for denne studien.
- Umiddelbart etter elektroporering flick kyvette forsiktig ~ 10 ganger for å blande godt.
5. Plating av celler
- Butikk kyvette med elektroporerte celler på is inntil klar til å plassere i recovery plater.
- For de fleste nedstrøms analyser, vaske celler 1x med forvarmet NGM å fjerne overflødig effektor protein.
- Fjerne celler for analyse og suspendere i 3-5 ml NGM.
- Pelletere cellene ved sentrifugering ved 900 x g i 4 minutter.
- Resuspender i tilstrekkelig volum av NGM for ønsket plate størrelse (f.eks 2 ml til 35 mm rett).
- Fjern passende mengde celler for genetisk analyse.
- Eksempel 1: plate i glass bunn retter for mikros analyse.
- Eksempel 2: plate into cellekultur plast for protein analyse som affinitet renselser.
- Tillate cellene å komme i likevekt platene i fuktet 95% luft / 5% CO2 atmosfære ved 37 ° C i minst 4 timer.
6. Mikros Analyse
6.1) Fiksering / Immunfluorescens Farging
- Vask celler 1x med steril PBS etter fire timers utvinning perioden.
- Fiks celler i 100% metanol i 2 minutter ved romtemperatur. Bruk nok metanol til å dekke celler (f.eks 2 ml til 35 mm parabol).
- Vask 3x med steril PBS.
- Permeabilisere cellene med 0,4% Triton X-100 i PBS i 15 min. For eksempel bruke en ml for en 35 mm diameter plate.
- Justere lengden av permeabilization og styrken av Triton X-100 i henhold til epitopen og plassering av målprotein. Merk: De beste resultater må bestemmes empirisk for hvert mål, men de ovennevnte forhold bør være tilstrekkelig for de fleste cytosolic mål.
- Blokk med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved RT. For eksempel bruke en ml for en 35 mm diameter plate.
- Vask 3 ganger med PBS.
- Inkuber primære antistoffet i antistoffbindingsløsning (0,1% Triton X-100 og 1% BSA i PBS) over natten ved 4 ° C med milde rocking. For eksempel bruke 0,5 ml for en 35 mm diameter plate.
- Følg produsentens anbefalinger for antistoff fortynning. Merk: For eksempel ble streptavidin bindende peptid tag (SBP-tag) antistoff som brukes på 1: 1000 fortynning, mens PKN1 antistoff ble brukt på 1: 200 fortynning.
- Vask 4x med PBS.
- Inkuber med passende fluorescens-konjugert sekundært antistoff i antistoffbindingsløsning i 1 time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
- For eksempel bruke Alexa 488 eller Alexa 647 for 1 time ved romtemperatur.
- Følg produsentens anbefalinger for mauriBody fortynning. (F.eks 1: 1000 for denne studien).
- Legg til andre flekker etter behov, for eksempel fem mikrometer Hvetespirer agglutinnin (WGA) konjugert til Alexa 647 eller DAPI henhold til produsentens anbefaling, for 1 time ved romtemperatur.
- For eksempel bruke Alexa 488 eller Alexa 647 for 1 time ved romtemperatur.
- Vask 5x med PBS og oppbevares ved 4 ° C, beskyttet mot lys før du er klar til bildet.
6.2) Konfokalmikroskopi og bildeanalyse
- Bildeeksempler på en invertert konfokal mikroskop ved hjelp av en 63x oljeneddyppingsobjektivet.
- Bilde grønn kanal med 488nm linje med en argon laser, med båndbredde utslipp mellom 492-542 nm.
- Bilde rød kanal med en 633 nm diode laser, med båndbredde utslipp mellom 640-718 nm.
- Bilde blå kanal med en 405 nm diode laser, med båndbredde utslipp mellom 407-453 nm.
- Sikre flere kanaler z-stabler dekker helheten av cellulær volum.
- Prosess bilder med passende bildebehandling.
7. Affinitetsrensing
- Vask elektroporerte celler to ganger med 4 ° C PBS etter fire timers utvinning perioden.
- Lyse med ~ 1,0 ml lyseringsbuffer (1% Triton X-100 med protease inhibitor cocktail og fosfatase-inhibitor i PBS) på is. Bruk hemmere i henhold til produsentens instruksjoner. Merk: For eksempel, både de fosfatase og proteasehemmere som brukes i denne studien ble levert ved 100x, men andre formuleringer skal fungere like godt.
- Omgå skrape celler med gummi politimann og samle inn koniske rør.
- Lyse etter kraftig virvling og lydbehandling. Merk: Andre lyse metodene kan fungere like godt, men effektiviteten må bestemmes empirisk som om egnetheten av analysekrav.
- Sonikere 3 x 30 sekunder med periodisk virvelblanding.
- Sentrifuger ved 10000 x g i 10 min ved 4 ° C for å samlecelleavfall og uoppløselige aggregater; Ta vare på supernatanten.
- Kombiner like volumer (~ 1,0 ml) av elektroporert cellelysat med 50 ul streptavidin-agarose Harpiksen suspensjonen ved 4 ° C over natten med ende-over-ende-rotasjon. Merk: Dette resin fanger elektroporert protein (og tilhørende komplekser) via sin streptavidin-bindende peptid affinitetsmarkør.
- Sentrifuger ved 2500 x g i 2 min, og supernatanten kastes.
- Vask to ganger med 40 sjiktvolumer (~ 1 ml) PBS.
- Tilsett 30 ul 4x LDS lastebuffer (141 mM Tris-base, 2% LD, 10% glyserol, 0,51 mM EDTA, 0,22 mM Serva Blå G, 0,175 mM fenolrødt, pH 8,5), 20 ul DIH 2 O og 1 ul 0,5 M tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP), slik at for en viss volum til å forbli i perlene.
- Oppvarm til 95 ° C i 10 min og avkjøl på is.
- Spin> 10.000 xg ved 4 ° C i 5 min.
- Samle supernatanten.
- Utfør en western blot ved hjelp av egnede antistoffer Merk: Hanre, er anti-PKN1 primært antistoff brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et første bevis på konseptet, ble renset grønt fluorescerende protein introdusert med hell i pattedyrceller ved hjelp elektroporering. GFP, et tilnærmet 27 kD molekylvekt protein blir vanligvis ført inn i pattedyrceller (vanligvis uttrykt fra plasmid-DNA) som en molekylær biologi verktøyet uten signifikant cellulær toksisitet. HeLa-cellene ble inkubert (figur 1A) eller elektroporert (figur 1B) med 25 ug / ml GFP, etterfulgt av immunfluorescens konfokal mikroskopi for å undersøke for GFP fluorescerende signal. For å demonstrere at GFP var inni det cellulære cytosol ble cellene også farget med hvetekim agglutinin (WGA) for å avgrense den cytosoliske grense (rød), samt en nukleinsyre flekken, DAPI (blå) for å indikere kjernen. Intracellulær GFP signal ble observert bare ved elektroporering, mens ingen intracellulært protein ble observert i celler inkubert med GFP. Lignende resultater ble observert med RAW264.7 musmakrofag-lignende celler (figur 1C og 1D). Legg merke til at WGA er et lektin som fortrinnsvis binder seg til rester i plasmamembranen, og således kan oppvise punktformet flekk basert på lengden av inkubasjon. Sammenlign figur 1A og 2A, hvor figur 2A ble inkubert i en lengre varighet enn figur 1A.
Electroporation ble deretter utvidet til en merket, renset Salmonella effektor, GtgE. GtgE, en kjent virulens faktor 30, ble oppdaget av vår gruppe å bli utskilt i vertsceller 31, og er nylig påvist å være en cystein protease 32. HeLa-cellene ble inkubert eller elektroporert med 50 ug / ml GtgE. For immunofluorescens-analyse, ble cellene farget med et antistoff mot streptavidin-bindende peptid affinitetsmerkelapp på GtgE. Cellene ble også farget med WGA og DAPI. I ruges HeLa-celler (Figure 2A), er det ingen intracellulær GtgE som visualisert ved en mangel på grønt fluorescerende foci. I motsetning til dette, elektroporerte HeLa-celler (figur 2B) viser signifikant fluorescerende intracellulære signal som indikerer effektor protein hadde kommet inn i cellene på grunn av elektroporering prosessen. RAW-celler viste en noe økt tilbøyelighet til å akkumulere protein på celleoverflaten under inkubasjon (figur 2C), men intracellulær signal ble sett bare ved elektroporering (figur 2D).
Bestemme deteksjonsgrensene for å visualisere sub-cellulær lokalisering via konfokalmikroskopi var viktig å sikre nok protein kom inn i cellen, og samtidig unngå overbelastning cellen med potensielt giftige bakterielle effektorer. I figur 3, ble GtgE elektroporert inn i RAW-makrofag-lignende celler ved 2,5, 25 og 50 ug / ml. Cellene ble deretter fiksert og farget med et antistoff mot merkelappen på GtgE. Oare et meget lite antall foci ble observert ved 2,5 pg / ml GtgE (figur 3A), med et økt antall foci tydelig på 25 ug / ml, (figur 3B), men det største antall distinkte brennpunkter ble sett ved den maksimale protein konsentrasjon testet, 50 ug / ml (Figur 3C). Lignende fargemønstre ble observert mellom prøvene tyder på disse proteinkonsentrasjoner intracellulært protein kan lett bli verifisert av konfokal mikroskopi. Protein konsentrasjoner over 50 pg / ml, ble ikke testet på grunn som konsentrasjonen av proteinet øket, så gjorde den tilbøyelighet til målproteinet til å bli adsorbert på overflaten av cellene. For å unngå disse aggregater av membranassosiert protein, ble det nødvendig å samle to electroporation kyvetter å skaffe nok verts samspill protein for å visualisere på en western blot (Figur 6, høyre kjørefelt).
For ytterligere å demonstrere at introduced protein ble ikke bare adsorberes på overflaten av cellen, ble påfølgende optiske seksjoner avbildes på fokalplanene hvert 0,35 til 0,43 mikrometer (Z-stabler) ved hjelp av konfokal mikroskopi. RAW-celler ble elektroporert med 50 ug / ml GtgE og farget som beskrevet ovenfor (figur 4, A og B). Z-stabler viste at GtgE var faktisk intracellulær og foci strekker seg fra bunnen (figur 4A, planet 6 av 36) til toppen av cellen (figur 4B, planet 26 av 36). Lignende resultater ble oppnådd for alle elektroporerte proteiner. Den iboende fluorescente profilen til kontrollcellepopulasjoner med og uten effektor-protein eller elektroporering ble undersøkt ved fluorescerende konfokal mikroskopi og ble funnet å være ubetydelig.
I tillegg ble det elektroporert protein undersøkt for å se om det var målrettet for degradering via endocytiske trasé. Celler ble farget for Ras-relaterte protein 5A (Rab5), enmarkør for tidlige endosomer (Figur 4C), eller lysosome-assosiert membran protein 1 (Lamp1), en markør for sene endosomer og lysosomer (Figur 4D). Samlokalisering mellom elektroporert protein og disse cellulære markører skulle tilsi en tett fysisk interaksjon mellom dem (dvs. at elektroporert protein var inne i endosomer / lysosomer). Konfokalmikroskopi viste at elektroporert protein (GFP eller GtgE) ikke co-lokalisere med LAMP1 eller Rab5. Det ble konkludert fra dette at innførte protein ble ikke direkte gjennom endocytose inn i cellene, eller er målrettet mot endocytotic bane innen fire timer etter behandling.
Eksogent protein innføring kan ha cellulære effekter i løpet av flere timer eller dager, og dermed er det ofte gunstig å undersøke utholdenhet av introduserte proteiner. Å bestemme hvor lenge en elektroporert protein ville vedvare uten degradering etter elektroporering. Basert on visualisering av vedlegg og celle spredning, ble 4 timers fast bestemt på å være omtrentlig minimum restitusjonstid for elektroporerte celler. For å temporært observere protein persistens en tidsforløpet eksperimentet ble utført, farging av cellene 4, 24 eller 96 timer etter elektroporering. Etter 4 timer (figur 5A), når cellemorfologi antydet utvinning, var det en betydelig mengde av intracellulært protein. Etter 24 timer (figur 5B), var det fortsatt betydelig elektroporert protein inne i cellene. Selv når tiden etter elektroporering ble utvidet til 96 timer før fiksering og farging (figur 5C) var det observer foci riktignok med redusert tilsynelatende overflod, demonstrerer protein utholdenhet dager etter første behandling.
To viktige advarsler ble registrert i løpet av disse eksperimentene. RAW-celler utviste en større tendens enn HeLa-celler for å akkumulere eksogene proteiner på celleoverflaten irreperspektiv av inkubasjon (figur 6A) eller elektroporering (Figur 6B). Til tross for dette, var alle prøvene elektroporerte økende indre protein (figurene 1, 2, 5b). I tillegg er membranassosiert protein forsvant over tid. En andre påminnelse var en liten populasjon av celler som oppviser en fenotype som består av mindre, avrundede celler lastet med høye mengder av eksogene proteiner i både kontroll (inkubert) og behandlet (elektroporerte celler) (figur 6 C og D, inkubasjonstider prøvene vist). Kjerner av disse cellene viste kondensert kromatin basert på DAPI-farging, og fylt helheten av cellevolum, som tyder på apoptose. Det er derfor mulig at apoptotiske celler (som oppstår som en normal del av cellesyklusen eller på grunn av avling / behandling) har en tilbøyelighet til å absorbere proteinet fra bufferen.
For å demonstrere at elektroporerte proteiner var funksjonell og kunne lokalisere tilsvarctly inne i vertscellen, co-lokalisering og protein-protein interaksjon mellom Salmonella effektorproteinet SspH1 og dets kjente vert målet, proteinkinase N1 (PKN1) 33 ble vist. Etter elektroporering ble fysisk interaksjon mellom SspH1 og PKN1 verifisert av en tilhørighet basert immunoprecipitation fulgt av western blot (figur 7A). Co-lokalisering ble også observert ved konfokal mikroskopi, noe som indikerer fluoroforene er nær nok til å overlappe hverandre romlig 34. Etter elektroporering med 50 ug / ml SspH1, ble HeLa-celler (Figur 7b) fiksert og farget for SspH1 (grønn) og PKN1 (rød). Ved lav laser makt tydelig fokus (gul) ble observert i kjernen indikerer SspH1 og PKN1 var fysisk nær nok til å samhandle. Dette samspillet har vært etablert i litteraturen; men denne studien er den første til å vise samlokalisering i kjernen.
= "Always"> 
Figur 1: Electroporation av GFP - HeLa eller RAW 264,7 celler Celler ble inkubert eller elektroporert med 25 ug / ml renset, grønt fluorescerende protein (GFP) og farget med anti-antistoff GFP (grønt), DAPI, en nukleær spesifikk probe (blått. ), og WGA (rød) for å avgrense cytosolisk grensen. Inkubert (A) HeLa-celler viser et fravær av grønn fluorescens indikerer en mangel på internalisering av GFP. (B) viser et representativt fotomikrografi av elektroporert GFP. Legg merke til utseendet av intracellulær foci som indikerer GFP hadde kommet inn i cellene. (C) og (D) er representative bilder av RAW-celler inkubert (C), eller elektroporert (D) med 25 ug / ml renset grønt fluorescerende protein.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Fig. 2: Electroporation av Salmonella effektor GtgE - HeLa-celler Celler ble inkubert (A) eller elektroporert (B) med 50 ug / ml av en affinitet tagget Salmonella effektor, GtgE, og farget med et anti-effektor-tag antistoff (grønn), DAPI, en kjernefysisk maske (blå), og WGA (rød) for å avgrense cytosolisk grensen. I (A), HeLa-celler inkubert viser et fravær av grønn fluorescens indikerer en mangel på internalisering av GtgE. (B) viser et representativt fotomikrografi av elektroporert GtgE viser intracellulære elektroporert effektor protein. (C) og (D) er representative bilder RAW-celler som ble inkubert enten eller elektroporerte, henholdsvis på samme måte med 50 ug / ml av Salmonella GtgE. Lyseblå er kombinasjonen, eller overlegg, av rød fluorescens fra WGA oggrønn fluorescens fra det sekundære antistoff.
Figur 3: Titrering av elektroporert protein - RAW-makrofag-lignende celler Cellene ble elektroporert med 2,5 ug / ml (A), 25 ug / ml (B), eller 50 pg / ml (C) Salmonella effektor GtgE og tillatt å komme seg. 4 timer. Cellene ble fiksert og farget med et anti-SBP-tag antistoff (grønn) og kjerner maske, DAPI (blå). Det er mulig å visualisere fluorescerende foci, en indikasjon på intracellulær GtgE ved 2,5 ug / ml via konfokal microcopy, selv om bedre resultater ble oppnådd når høyere start mengde protein ble anvendt. Tilfredsstillende resultater (også intracellulært protein lett observeres ved konfokal mikroskopi uten overdreven membranassosiert aggregater) ble oppnådd ved 50 pg / ml for GtgE og således no større konsentrasjoner ble testet.
Figur 4:. Protein intern og mangel på samlokalisering med endosomet markører Fortløpende optiske skiver (z-stabler) innhentet av konfokalmikroskopi å visualisere hvis elektroporert protein var interne. RAW-celler ble elektroporert med 50 ug / ml GtgE. (A) viser optiske skive 6 av 36, z-stabelen (2,1 mikrometer) over bunnen av skålen. (B) viser det samme synsfelt, men på skive 26 av 36. De intracellulære foci strekker seg gjennom hele cellen noe som indikerer at proteinet virkelig er intracellulær og ikke samles på overflaten av cellen. Lyseblå er en kombinasjon av rødt WGA, grønn sekundært antistoff, og blå DAPI. Co-lokalisering analysen med markører av endosomer / lysosomer, Rab5, (C) eller et lysosom markør, LAMP1 
Figur 5: Protein utholdenhet etter elektroporering Confocal mikrograf viser utholdenhet av elektroporert GtgE over tid.. 50 ug / ml GtgE ble elektroporert inn i HeLa-celler. Cellene ble deretter fiksert og farget med et anti-SBP-tag antistoff (grønn) og kjerner maske, DAPI (blå). 4 timer (A) ble bestemt å være den minimale mengden av tid til å tillate celler å utvinne og som forventet viser maksimal intracellulært protein. Etter 24 timer (B) og 96 timer (C), grønn brennpunkter, både intracellulært og på cellular overflate, viser effektor utholdenhet som indikerer at proteinet ikke er degradert dager etter den første behandling. Den lyseblå fargen i dette bildet er det overlapping av blå DAPI og den grønne antistoffarging. 
Fig. 6: Celleoverflate proteinaggregering og en electroporation fenotype RAW-makrofag-lignende celler ble inkubert enten (A) eller elektroporert (B) med 50 ug / ml GtgE og farget med anti-SBP-tag antistoff (grønn), WGA (Red ), og med DAPI (blå). Både RAW 264.7 og i mindre grad HeLa-celler, hadde en tendens til å aggregere effektor på overflaten av cellen; alle elektroporerte celler ble vist å ha økt intern protein (HeLa ikke vist). Gult er overlapping av røde fra WGA og grønt fra målprotein. RAW (C) og (D) HeLa-celler showing en endret fenotype etter inkubasjon med GtgE (vist). Flere eksperimenter viste en fenotype som består av mindre celler med differensial DAPI farging og et tap av cytoplasma. Lyseblå er overlegget fra den røde WGA, grønn sekundært antistoff, og blå DAPI. Konfokal mikroskopi ble benyttet for å vise målproteinet akkumuleres i kjernen. Siden dette fenotype av eksogene protein-laden celler dukket opp etter både inkubasjon og elektroporering, kunne man hypotese dette fenotype å være tankevekkende av apoptose. 
Figur 7:. Verts protein interaksjoner med elektroporerte Salmonella SspH1 - Jakten celler Celler ble elektroporerte på de oppførte konsentrasjoner med SspH1, lov til å komme seg i 4 timer før du utfører en modifisert affinitetsrensing fulgt av western blot (A) for å berike for ogoppdage den kjente eukaryote samspill partner: serin / treonin protein kinase N1 (PKN1). Legg merke til at den høyre kjørefelt (2x EP) innbefatter to samle kyvetter, idet signalet fra en kyvette blandes inn i bakgrunnen, men PKN1 ble fortsatt anriket over mangelen på binding sett i no-agn kontroll. Western blot ble utført med naturlig HeLa-lysat, renset SspH1, og affinitetsrensing prøvene før de ble undersøkt med et monoklonalt antistoff til PKN1. Måldetektering ble oppnådd via en pepperrotperoksydase konjugert sekundært antistoff med reaktivitet mot isotype for det primære antistoff. HeLa-celler (B) viser co-lokalisering (gul) mellom PKN1 (rød) og SspH1 (grønn) via ved konfokal mikroskopi etter elektroporering med 50 ug / ml SspH1. Denne optiske overlapping angir at effektor og vertsprotein er nær nok til fysisk å samhandle. Det faktum at interaksjonen ble vist i kjernen for første gang, gir ytterligere støtte somproteinet ble trafikkert riktig av verten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utskilte effektorer fra patogene bakterier har utviklet seg til å fungere i vertscellens miljø og således er det nyttig å studere dem in situ inne i verten. Innføring av spesifikke effektorer av interesse inn i vertceller lar de aktuelle patogen-vert interaksjoner som skal studeres isolert uten forstyrrelse fra andre bakterielle proteiner. Målet var å utforske elektroporering som et middel for å innføre bakterielle effektor proteiner i eukaryote vertsceller, og dermed unngå noen av utfordringene knyttet til transfeksjon eller transduksjon. Grønt fluorescerende protein ble anvendt som en kontroll og Salmonella effektor-proteiner ble testet. På grunn av interessen for bakterielle patogener som er rettet mot vert epitelceller samt immunceller, ble en human epitel-lignende cellelinje (HeLa) og mus makrofag-lignende celler (RAW 264.7) benyttet. Elektroporering kan levere eksogene proteiner i vertsceller med ingen merkbar reduksjon i celle viability, og de leverte proteiner var påvisbare i celler i opptil fire dager.
For å isolere virkningene av elektroporert protein, er rent protein nødvendig. I denne studien ble proteiner uttrykt i E. coli stamme BL21 med N-terminal polyhistidin og streptavidin bindende-peptid koder. Proteiner ble renset med Ni-NTA-harpiks, analysert med hensyn på konsentrasjon (vanligvis mellom 5-25 mg / ml) og renhet, og lagret ved -80 ° C inntil elektroporering. Kommersielt produserte proteiner ville også være akseptable for elektroporering, da de har en tendens til å være av høy renhet og godt karakterisert.
Viktige trinn i denne protokollen inkludert fullstendig cellekulturmediet fjernet ved å vaske og suspendere cellene i protein-fri buffer. Dette sikrer at eventuelle nedstrøms fenotyper som observeres er på grunn av eksogent protein av interesse, og ikke til proteiner som er tilstede i dyrkningsmediet. Bedre effektivitet av elektroporering ble observert når celletettheten varhøyere (f.eks 6 x 10 6 vs. 1 x 10 6 celler), men den beste mobilnummer vil variere med cellestørrelse og type. Et annet kritisk punkt i forsøket var å la cellene tid til å komme og koble seg til retter; Dette var nødvendig fordi adherente celler ble anvendt i denne studien. En utvinningsperioden bør være mindre viktig for suspensjonsceller, selv om det kan være nødvendig å gi proteiner tid for riktig intracellulær handel, protein-protein interaksjoner, eller enzymatisk aktivitet, avhengig av arten av den tilsiktede studien. Siden levert proteiner ble observert inne i cellene i opp til 96 timer, er det mye rom for justering av inkubasjonsperioden før mikroskopi visualisering eller cellulært assay.
Flere variabler i denne protokollen kan optimaliseres for ulike celletyper, protein mål, eller nedstrøms analyse ordninger. Mengden protein som skal electroporated kan finjusteres for ønsket intracellulær konsentrasjon. For visualisering av protein lokalisering, kan så lite som 1 pg bli brukt. For funksjonelle studier, kan høyere utgangs mengder proteiner være nødvendig. I tillegg kan tiden for post-elektroporering celle utvinning være kortsluttet eller forlenges. Labile protein mål eller raske nedstrømsprosesser vil kreve en kortere inkuberingstid. Dessuten kan mengden av celler belagt justeres utover forslag her. Celler kan være belagt mer sparsomt hvis introdusert protein skal overvåkes ved mikroskopi, eller belagt tettere hvis elektroporert protein er å bli gjenvunnet for applikasjoner som vestlige blotter.
Mens elektroporering er en enkel og grei fremgangsmåte for innføring av proteiner inn i levende celler, er det noen begrensninger i teknikken. Metoden krever meget rene proteiner i mikrogrammengder. Så lite som 1 mikrogram ble elektroporert og visualisert med konfokalmikroskopi, men med høyere start mengder protein ga better visuelle resultater. Mens proteinfunksjon ikke ble vurdert ved alle konsentrasjoner etter elektroporering, ble proteinkonsentrasjoner som er lik eller større enn 50 pg / ml som er nødvendig for tilfredsstillende signal for western blot. Også, på grunn av størrelsen begrensninger av electroporation kyvetter, kan oppskalering krever behandling av flere kyvetter av celler. Men tatt i betraktning at elektroporering prosessen tar bare sekunder når cellene er forberedt, parallell prosessering krever litt ekstra tid og innsats.
Hvis det innførte protein, er å bli visualisert ved western blot, mikroskopi, eller brukes for affinitetsrensing, bør proteinet har en tagg 35 for affinitetsrensing eller en tilgjengelig antistoff for påvisning. Imidlertid, av ukjente grunner, noen vekselvirkninger som er kjent fra litteraturen eller andre biokjemiske metoder (data ikke vist) var ikke i stand til å bli rekapitulert etter elektroporering. Det kan være at verten gjenkjenner noen elektroporerte proteiner som foreign og raskt markerer dem for proteasom degradering.
Elektroporering har flere fordeler i forhold til andre eksisterende metoder for proteinlevering. Sammenlignet med mikroinjeksjon, elektroporering er mye raskere og enklere, og et stort antall celler kan bli behandlet på en gang med nesten 100 prosent levedyktigheten for de testede betingelser. Electroporation er også billigere enn protein transfeksjon med kommersielt tilgjengelige reagenser. DNA-transfeksjoner er ofte brukt til å studere bakterielle effektor proteiner i vertsceller; Men dette fører til de bakterielle proteiner for å bli syntetisert ikke-ideell av verten. På den annen side, elektroporering av bakterielle proteiner fjerner avhengighet av pattedyr-protein ekspresjon maskineri, som tillater en bedre representasjon av den smittsomme prosess hvor effektor proteiner uttrykkes av bakterien.
Flere anvendelser kunne bruke protein elektroporering som en metode i studiet av bakteriell vert-interactions. For det første kan primære celler som ofte er vanskelig å transfektere bli mer mottagelig for elektroporering for proteinlevering. Dette vil muliggjøre studier av effektor funksjon i flere biologisk relevante celletyper. Electroporation gir også mulighet for multipleksing proteiner og / eller behandlinger. For eksempel kan multiple proteiner innføres samtidig eller medikamenter og andre små molekyler kan leveres sammen med proteiner. Det viktigste for å oppnå en funksjonell forståelse av virkningen av de innførte proteiner, protein elektroporering kan være kombinert med analyser for proteinfunksjonen og interaksjoner, for eksempel affinitetsrensing, western blots mot kjente mål, hel-celle-ekspresjon analyse, og mikroskopi for å bestemme subcellulære lokalisering av det innførte protein. Derfor har denne metoden stort potensial som et verktøy for å belyse bakteriell patogen biologi sammen med andre cellulære og molekylærbiologiske teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
