Abstract
O estudo das interações proteína no contexto de células vivas podem gerar informações importantes sobre a localização, dinâmica e parceiros interagem. Esta informação é particularmente valiosa no contexto das interacções hospedeiro-agente patogénico. Muitas proteínas de agentes patogénicos funcionar dentro das células hospedeiras na forma de uma variedade tais como, permitindo a evasão do sistema imunitário do hospedeiro e a sobrevivência no ambiente intracelular. Para estudar essas interações célula-hospedeiro de patógenos em proteínas, diversas abordagens são comumente usados, incluindo: infecção in vivo com uma estirpe que expressa uma proteína marcada ou mutante, ou a introdução de genes de patógenos via transfecção ou transdução. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens. Buscamos um meio para introduzir directamente proteínas exógenas nas células. A electroporação é geralmente utilizado para introduzir ácidos nucleicos em células, mas foi mais raramente aplicado a proteínas, embora a base biofísica é exactamente o mesmo.Um electroporador padrão foi utilizada para introduzir efectores bacterianas de afinidade marcado com em células de mamífero. Macrófagos epiteliais e mouse Humanos foram cultivados pelos métodos tradicionais, individual, e colocados em 0,4 centímetros cuvetes gap eletroporação com uma proteína exógena bacteriana patógeno de interesse (por exemplo, Salmonella Typhimurium GTGE). Após a eletroporação (0,3 kV) e um curto período de recuperação (4 horas), proteína intracelular foi verificada por fluorescently rotulando a proteína através da sua marca de afinidade e examinar a distribuição espacial e temporal por microscopia confocal. A proteína também electroporação mostrou ser funcional no interior da célula e capaz de tráfico subcelular correcta e interacção proteína-proteína. Enquanto as proteínas exógenas tendia a acumular-se sobre a superfície das células, as amostras electroporadas teve grandes aumentos na concentração intracelular de efector em relação à incubação sozinho. O protocolo é simples e rápido o suficiente para ser feito em apmoda arallel, permitindo a caracterização de alta taxa de transferência de proteínas de patógenos em células hospedeiras incluindo segmentação e função das proteínas de virulência subcelular.
Introduction
Muitas bactérias Gram-negativas empregam sistemas de secreção especializados para injetar proteínas relacionadas à virulência (referidas como efetores) diretamente nas células hospedeiras 1-5. Estes efectores têm uma ampla gama de funções biológicas, incluindo: supressão da imunidade do hospedeiro, alterações do citoesqueleto, a modificação do tráfico intracelular e de sinalização, alterações da transcrição, e as alterações de proteassoma hospedeiro 6-9. As funções de alguns efectores são conhecidos, no entanto, os alvos do hospedeiro e de acção bioquímica (s) de muitos outros permanece a ser determinada. Ao se comparar o tipo selvagem e infecções bacterianas recombinantes é uma aproximação válida para estudar os mecanismos de virulência efector intracelular, é muitas vezes vantajoso para introduzir um indivíduo efectora na célula hospedeira. Assim, os métodos simples para a introdução e caracterização de proteínas efectoras bacterianas no contexto de células hospedeiras é altamente desejável.
Simplificar o wi análise experimentalth um único efetor é crítica como outros efetores podem ter funções opostas ou redundantes. Para realizar esta simplificação, os pesquisadores já introduziu macromoléculas em células por muitos métodos diferentes, incluindo a transdução viral 10, microinjeção 11, raspar o carregamento 12,13, fusão celular com microinjeção induzido quimicamente 14, proteína proprietária "transfecção" reagentes 15, precipitações de fosfato de cálcio 16, 17-20 e electroporação. As moléculas introduzidas variam de ácidos nucleicos, incluindo as espécies de ADN, ARN, e proteínas de ARNi a, corantes de células-impermeável, e anticorpos para alvos intracelulares 21,22. Alguns métodos têm limitações, incluindo o tipo de macromoléculas que podem ser introduzidas, e em particular análises a jusante pode ser limitada devido à elevada toxicidade celular, prejudiciais mecanismos de acção, a baixa eficácia, ou eficiência de introdução. A transfecção, uma oftemétodo de n-utilizado para a expressão de genes bacterianos em células de mamífero, também sofre da limitação de que alguns tipos de células hospedeiras relevantes, tais como macrófagos e células primárias, são particularmente resistentes às transfecção. Além disso, é difícil controlar os níveis de proteína bacteriana produzida após a introdução de ADN estranho.
Muito trabalho estabeleceu eletroporação de ácidos nucleicos em ambas as células bacterianas e de mamíferos como uma técnica de laboratório comum; no entanto, há investigação em curso sobre os melhores métodos para a entrega de proteínas nas células sob condições fisiológicas. Relatórios sobre a transfecção de proteína são promissores, mas requerem reagentes e otimização caros. O desejo de introduzir efectores bacterianas potencialmente tóxicos em uma grande variedade de alvos celulares com um custo mínimo nos levou a considerar electroporação como um método para o estudo destas proteínas in vivo.
Electroporação é uma proteína de 23-25 method para introduzir as proteínas em células vivas através electropermeabilization, também conhecidos como electro-transfecção ou electro-injeção 26. Esta técnica utiliza-alta intensidade impulsos eléctricos para criar poros em membranas celulares. Estes poros reversíveis permitir macromoléculas que são normalmente excluídos do espaço intracelular para entrar na célula. Após a remoção do campo eléctrico externo, a membrana pode selar novamente, permitindo que a célula de reter moléculas que passaram pelos poros 27,28.
Um electroporador padrão foi utilizada neste estudo para introduzir consistentemente efectores bacterianas em ambas as células tipo macrófagos do rato e as células epiteliais humanas. O método é rápido, eficiente e barato, sem redução apreciável na viabilidade celular. As proteínas podem ser introduzidos visualizado por microscopia de imunofluorescência ou utilizadas para ensaios funcionais. Isto foi demonstrado utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como um padrão não-tóxicos, bem comoduas proteínas efectoras Salmonella, SspH1 e GTGE. Propomos electroporação proteína como uma ferramenta adicional para o repertório para o estudo de proteínas de virulência da bactéria e das suas funções em células hospedeiras eucarióticas.
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Protocol
1. Prepare-se com antecedência
- Quente fosfato estéril salina tamponada (PBS) a 37 ° C.
- Modificação de Dulbecco quente de Meio de Eagle (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estes representam crescimento normal de mídia (NGM) para as células RAW e HeLa, respectivamente.
2. Preparação de Células
- Crescer 264.7 RAW para 70-90% de confluência em NGM.
- Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de CO2.
- Cultivar células HeLa a 70-90% de confluência em NGM.
- Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de CO2.
- Antes da coleta, lave monocamada de células uma vez com PBS estéril.
- Recolher as células pré-confluentes num tubo cónico estéril.
- Raspe suavemente as células RAWcom um policia de borracha em PBS, com pipetagem repetida para dispersar agregados de células.
- Separar as células HeLa com solução de tripsina a 0,25% até que o exame visual mostra a dissociação a partir da superfície de cultura. Por exemplo, uso de 2 a 3 ml de um frasco T-75. Ajustar o volume da solução em conformidade para assegurar tripsina cobre toda a superfície de crescimento.
- Extingue-se reacção com dissociação NGM contendo 10% de FBS.
- Use pelo menos duas vezes o volume de NGM a tripsina, com pipetagem repetida para dispersar agregações celulares.
- Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
- Ressuspender em volume igual solução de tripsina / têmpera usando PBS estéril.
- Contagem de células usando hemocitômetro ou contador de partículas.
- Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
- Ressuspender em volume adequado de PBS para 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 células / ml. Nota: Por exemplo, um frasco de T-75 irá produzir aproximdamente 7,5 x 10 6 células 29.
- Mantenha suspensão de células em gelo até eletroporação.
3. Preparação para electroporação
- Cuvetes Pré-chill eletroporação (0,4 centímetros de folga) em gelo.
- Ligue aparelho de eletroporação e definir a tensão de 0,3 kV.
NOTA: capacitância e resistência não eram configurações ajustáveis em nosso electroporator (fixado em 10 iF e 600 Ω pelo fabricante). - Encha com placas de recuperação NGM e equilibrar em humidificada de 95% ar / 5% de CO2 a 37 ° C.
4. Eletroporação
- Colocar 400 mL da suspensão de células em cuvetes de pré-gelada e adiciona-se 20 ug de proteína seleccionada a cuvete (50 ug / ml).
- Flick tina suavemente ~ 10 vezes para misturar sem danificar as células. Nota: A cuvete pode também ser invertida diversas vezes para misturar bem, mas não pipetar para cima e para baixo ou de vórtice, para evitar danificar as células.
- Amostra electroporate a 0,3 kV para 1,5-1,7 ms. Nota: Isso era típico para este estudo.
- Imediatamente após a eletroporação filme tina suavemente ~ 10 vezes para misturar bem.
5. chapeamento de Células
- Tina loja com células eletroporados no gelo até que esteja pronto para colocar em placas de recuperação.
- Para a maioria das análises a jusante, lave as células 1x com NGM pré-aquecido para remover a proteína estranha efectora.
- Remover as células para análise e suspender em 3-5 ml de NGM.
- Peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
- Ressuspender em volume adequado de NGM para o tamanho da placa desejada (por exemplo 2 ml para 35 milímetros prato).
- Remover quantidade adequada de células para análise de downstream.
- Exemplo 1: placa em pratos com fundo de vidro para análise de microscopia.
- Exemplo 2: placa into plástico de cultura de células para análise de proteínas, tais como purificação por afinidade.
- Permitir que as células em placas de recuperar humidificada equilibrada em 95% de ar / 5% de CO2 a 37 ° C durante pelo menos 4 horas.
6. Análise de Microscopia
6.1) Fixação / técnica de imunofluorescência
- Lave as células 1x com PBS estéril após o período de recuperação de 4 horas.
- Fix células em 100% de metanol durante 2 minutos à temperatura ambiente. Use metanol suficiente para cobrir completamente as células (por exemplo, 2 ml para 35 milímetros prato).
- Lavar 3x com PBS estéril.
- Permeabilizar as células com 0,4% de Triton X-100 em PBS durante 15 min. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
- Ajustar o comprimento de permeabilização e força de Triton X-100 de acordo com epitopo e localização da proteína alvo. Nota: Os melhores resultados terá de ser determinado empiricamente para cada alvo, no entanto, as condições acima mencionadas, deve ser adequada para a maioria cmetas ytosolic.
- Bloco com 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS durante 1 h à TA. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
- Lavar 3x com PBS.
- Incubar anticorpo primário em solução de ligação do anticorpo (0,1% de Triton X-100 e 1% de BSA em PBS) durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Por exemplo, usar 0,5 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
- Siga as recomendações do fabricante para a diluição do anticorpo. Nota: Por exemplo, o anticorpo marcador peptídico de ligação a estreptavidina (SBP-tag) foi utilizado a 1: 1000 de diluição, enquanto que o anticorpo PKN1 foi utilizado a 1: 200 de diluição.
- Lavar 4x com PBS.
- Incubar com anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado em solução de ligação do anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente, protegida da luz.
- Por exemplo, usar Alexa 488 ou Alexa 647, durante 1 h à temperatura ambiente.
- Siga as recomendações do fabricante para a formigadiluição ibody. (Por exemplo, cerca de 1: 1000 para este estudo).
- Adicionar outras manchas, conforme necessário, por exemplo, 5 uM de gérmen de trigo agglutinnin (WGA) conjugada com Alexa 647 ou DAPI de acordo com a recomendação do fabricante, durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Por exemplo, usar Alexa 488 ou Alexa 647, durante 1 h à temperatura ambiente.
- Wash 5x com PBS e armazenar a 4 ° C, protegido da luz até que esteja pronto para a imagem.
6.2) microscopia confocal e Análise de Imagem
- Amostras de imagem em um microscópio confocal invertido utilizando uma objectiva de imersão em óleo de 63x.
- Imagem canal verde usando a linha de 488 nm de um laser de argônio, com emissão de largura de banda entre 492-542 nm.
- Imagem canal vermelho usando um laser de diodo 633 nm, com emissão de largura de banda entre 640-718 nm.
- Imagem do canal de azul usando um laser de diodo 405 nm, com emissão de largura de banda entre 407-453 nm.
- Assegurar o canal múltiplo z pilhas cobrir a totalidade do volume celular.
- Processar imagens com o software de processamento de imagem apropriado.
7. Affinity Purificação
- Lave as células eletroporados duas vezes com 4 ° C PBS após o período de recuperação de 4 horas.
- Lise com ~ 1,0 ml de tampão de lise (1% Triton X-100 com um cocktail inibidor de protease e inibidores de fosfatase em PBS) em gelo. Use inibidores de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Por exemplo, ambos os inibidores da protease e da fosfatase utilizados neste estudo foram fornecidas a 100x, mas outras formulações deve funcionar igualmente bem.
- Prontamente raspar células com polícia de borracha e recolher em tubos cônicos.
- Lise por vórtice vigoroso e sonicação. Nota: Outros métodos de lise pode funcionar igualmente bem, mas a eficiência será necessário ser empiricamente determinada como a adequação dos requisitos do ensaio.
- Sonicar 3 x 30 segundos com agitação em vórtex intermitente.
- Centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para recolheros detritos celulares e agregados insolúveis; salvar o sobrenadante.
- Combinar volumes iguais (~ 1,0 ml) de lisado de células electroporadas com 50 ul de suspensão de estreptavidina resina de agarose a 4 ° C durante a noite com uma rotação de extremidade sobre extremidade. Nota: Esta resina captura a proteína electroporadas (e complexos associados), através do seu péptido marcador de afinidade de ligação a estreptavidina.
- Centrifugar a 2.500 xg por 2 min e elimine o sobrenadante.
- Lavar duas vezes com 40 volumes de leito (~ 1 ml de PBS).
- Adicionar 30 ul de tampão de carga 4x LDS (141 mM de base Tris, 2% de LDS, 10% glicerol, 0,51 mM de EDTA, 0,22 mM de L SERVA azul, vermelho de fenol 0,175 mM, pH 8,5), 20 ul dih 2 O, e 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), permitindo um certo volume para permanecer em grânulos.
- Aquece-se a 95 ° C durante 10 min e arrefecer em gelo.
- Rotação> 10.000 xg, a 4 ° C durante 5 min.
- Recolher o sobrenadante.
- Realizar um western blot utilizando anticorpos apropriados Nota: Elere, anti-PKN1 anticorpo primário é usado.
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Representative Results
Como um teste de conceito, a proteína fluorescente verde purificada foi introduzida com sucesso em células de mamíferos utilizando eletroporação. GFP, um valor aproximado de 27 kD, uma proteína de peso molecular é geralmente introduzido nas células de mamífero (normalmente expressos a partir de ADN de plasmídeo), como uma ferramenta de biologia molecular, sem toxicidade celular significativa. As células HeLa foram incubadas (Figura 1A) ou electroporação (Figura 1B) com 25 ug / ml de GFP, seguido por microscopia confocal de imunofluorescência para verificar se há sinal GFP fluorescente. Para demonstrar que a GFP foi no interior do citosol celular, as células foram também coradas com aglutinina de gérmen de trigo (WGA) para delinear o limite citosólica (vermelho), bem como uma mancha de ácido nucleico, DAPI (azul) para indicar o núcleo. GFP sinal intracelular foi observada somente em cima eletroporação, enquanto nenhuma proteína intracelular foi observado em células incubadas com GFP. Resultados similares foram observados com RAW264.7 ratomacrófagos-like (Figura 1C e 1D). Note-se que o WGA é uma lectina que se liga preferencialmente aos resíduos na membrana do plasma e, portanto, pode apresentar uma coloração ponteada com base no comprimento de incubação. Comparar a Figura 1A e Figura 2A, onde a Figura 2A foi incubada durante uma duração mais longa do que a Figura 1A.
Eletroporação foi então estendido a um marcado, efetoras Salmonella purificado, GTGE. GTGE, um factor de virulência conhecido 30, foi descoberto pelo nosso grupo para ser segregado em células hospedeiras de 31, e foi recentemente demonstrado que uma protease da cisteína 32. As células HeLa foram incubados ou a electroporação com 50 ug / ml GTGE. Para a análise de imunofluorescência, as células foram coradas com um anticorpo contra o péptido marcador de afinidade de ligação a estreptavidina em GTGE. As células também foram coradas com WGA e DAPI. Em células HeLa incubados (Figure 2A), não há GTGE intracelular como visualizado por uma falta de focos fluorescentes verdes. Em contraste, as células HeLa electroporadas (Figura 2B) mostram fluorescente sinal intracelular da proteína efectora indicando significativa tinha entrado nas células devido ao processo de electroporação. Células RAW mostrou um ligeiro aumento propensão para se acumular na superfície da proteína celular durante a incubação (Figura 2C), mas de sinal intracelular foi observado apenas sobre electroporação (Figura 2D).
Determinação dos limites de detecção para a visualização de localização sub-celular através de microscopia confocal foi importante para garantir a quantidade suficiente de proteína entrou na célula, evitando sobrecarregar a célula com efectores bacterianas potencialmente tóxicos. Na Figura 3, GTGE foi electroporado em células tipo macrófagos RAW em 2,5, 25, e 50 ug / ml. As células foram depois fixadas e coradas com um anticorpo contra o marcador na GTGE. Oomente foram observados um número muito reduzido de focos de 2,5 ug / ml GTGE (Figura 3A), com números crescentes de focos aparente a 25 ug / ml, (Figura 3B), mas o maior número de focos distintos foram encontrados na proteína máximo concentração testada, 50 ug / ml (Figura 3C). Foram observados padrões de coloração similares entre as amostras que indicam a estas concentrações de proteína intracelular de proteínas poderiam ser facilmente verificadas por microscopia confocal. As concentrações de proteína acima de 50 ug / ml Não foram testadas porque, como a concentração de proteína aumentou, assim como a propensão para a proteína alvo se tornar adsorvido à superfície das células. Para evitar esses agregados de proteína de membrana associada, tornou-se necessário reunir duas cuvetes eletroporação para obter acolhimento suficiente proteína de interação para visualizar em um western blot (Figura 6, pista da direita).
Para demonstrar ainda que a introduced proteína não foi simplesmente adsorvido à superfície da célula, secções ópticas consecutivos foram fotografadas em planos focais cada 0,35-0,43 micrómetros (Z) pilhas usando microscopia confocal. Células RAW foram electroporadas com 50 ug / ml GTGE e corados como descrito anteriormente (Figura 4, A e B). As pilhas Z-GTGE mostrou que era na verdade intracelular e os focos de se estender desde a parte inferior (Figura 4A, plano 6 de 36) para a parte superior da célula (Figura 4B, plano 26 de 36). Resultados semelhantes foram obtidos para todas as proteínas eletroporados. O perfil de fluorescência intrínseca de populações de células de controlo com e sem proteína efectora ou electroporação foi examinada por microscopia confocal de fluorescência, e verificou-se ser negligenciável.
Além disso, a proteína electroporado foi examinado para ver se ele foi alvo de degradação por meio das vias de endocitose. As células foram coradas para Ras-relacionados 5A proteína (Rab5), umamarcador para os endossomas precoces (Figura 4C), ou proteína de membrana associada a Lisossomal 1 (LAMP1), um marcador de endossomas e lisossomas (Figura 4D) final. Co-localização entre a proteína electroporado e esses marcadores celulares indicaria uma interação física estreita entre eles (ou seja, que a proteína electroporado estava dentro dos endosomes / lisossomos). A microscopia confocal mostraram que a proteína electroporadas (GFP ou GTGE) não co-localizar com LAMP1 ou Rab5. Foi daí deduzir que introduziu proteína não foi diretamente endocitado nas células ou direcionados para a via endocitótica no prazo de quatro horas de tratamento.
Introdução proteína exógena pode ter efeitos celulares ao longo de várias horas ou dias, e assim, é muitas vezes benéfico para examinar a persistência de proteínas introduzidas. Para determinar quanto tempo uma proteína electroporado persistiria sem degradação após a eletroporação. O Com basen visualização de apego e de célula se espalhando, 4 horas estava determinado a ser o tempo de recuperação mínimo aproximado para as células eletroporados. Para observar temporalmente persistência de proteína numa experiência ao longo do tempo foi realizada, coloração das células 4, 24, ou 96 horas após a electroporação. Depois de 4 h (Figura 5A), quando a morfologia celular sugere recuperação, havia uma quantidade considerável de proteína intracelular. Após 24 h (Figura 5B), ainda havia proteína electroporado substancial no interior das células. Mesmo que o tempo após a eletroporação foi estendido para 96 horas antes de fixação e coloração (Figura 5C) havia focos observáveis embora a um aparente abundância reduzida, demonstrando dias de persistência proteína após o tratamento inicial.
Duas ressalvas importantes foram observados durante o curso desses experimentos. Células RAW exibiu uma maior tendência do que as células HeLa para acumular proteínas exógenas na superfície celular irreindependente- de incubação (Figura 6A) ou electroporação (Figura 6B). Apesar disto, todas as amostras tinham aumentado electroporadas proteína interna (Figuras 1, 2, 5b). Além disso, a proteína associada à membrana desaparecido ao longo do tempo. Uma segunda desvantagem era uma pequena população de células que exibem um fenótipo que consiste em arredondada menor, células carregadas com grandes quantidades de proteínas exógenas em ambos controlo (incubadas) e células tratadas (electroporação) (Figura 6 C e D, as amostras de incubação mostrado). Os núcleos destas células mostrou cromatina condensada com base na coloração com DAPI, e encheu-se a totalidade do volume celular, sugestivo de apoptose. É portanto possível que as células apoptóticas (que surgem como uma parte normal do ciclo celular ou devido a colheita / tratamento) têm uma propensão para absorver a proteína a partir do tampão.
Para demonstrar que as proteínas foram electroporadas funcional e pode localizar corresponctly no interior da célula hospedeira, a co-localização e interacção proteína-proteína entre a proteína de Salmonella efectora SspH1 e seu alvo do hospedeiro conhecido, proteína quinase N1 (PKN1) 33 foi mostrado. Após a electroporação, a interacção física entre SspH1 e PKN1 foi verificada por meio de uma imunoprecipitação com base afinidade seguido por Western blot (Figura 7A). Co-localização também foi observada por microscopia confocal, que indica os fluorophores estão perto o suficiente para se sobrepor espacialmente 34. Após a electroporação com 50 ug / ml SspH1, células HeLa (Figura 7B) foram fixadas e coradas para SspH1 (verde) e PKN1 (vermelho). Em baixa potência do laser focos distintos (amarelo) foram observados no núcleo indicando SspH1 e PKN1 eram fisicamente perto o suficiente para interagir. Esta interacção foi estabelecida na literatura; no entanto, este estudo é o primeiro a mostrar a co-localização no núcleo.
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Figura 1: A electroporação de GFP - HeLa ou células RAW 264.7 As células foram incubadas ou electroporadas com 25 ug / ml de proteína fluorescente verde purificada (GFP) e coradas com anticorpo anti-GFP (verde), DAPI, uma sonda específica nuclear (azul. ), e WGA (vermelho) para delinear o limite citosólica. As células foram incubadas (A) HeLa mostram uma ausência de fluorescência verde indica uma falta de internalização de GFP. (B) mostra uma fotomicrografia representativa de GFP electroporadas. Note-se a aparência dos focos intracelular indica GFP tinham entrado nas células. (C) e (D) são imagens representativas de células RAW incubadas (C), ou a electroporação (D) com 25 ug / ml de proteína fluorescente verde purificada.
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Figura 2:. A electroporação de Salmonella efectora GTGE - células HeLa As células foram incubadas (A) ou electroporação (B) com 50 ug / ml de um tag de afinidade Salmonella efectora, GTGE, e coradas com um anticorpo anti-etiqueta efectora (verde), DAPI, uma máscara nuclear (azul), e WGA (vermelho) para delinear a fronteira cytosolic. Em (A), incubou-se células HeLa mostram uma ausência de fluorescência verde, indicando uma falta de internalização de GTGE. (B) mostra uma fotomicrografia representativa de electroporação GTGE, mostrando intracelular electroporadas proteína efectora. (C) e (D) são representativos de imagens células RAW que ou foram incubados ou a electroporação, respectivamente, da mesma forma, com 50 ug / ml de Salmonella GTGE. Luz azul é a combinação, ou de sobreposição, de fluorescência vermelha do WGA efluorescência verde a partir do anticorpo secundário.
Figura 3: Titulação de proteína electroporadas - células de macrófagos RAW Células semelhantes foram electroporadas com 2,5 ug / ml (A), 25 ug / ml (B), ou 50 ug / ml (C) Salmonella efectora GTGE e deixadas a recuperar durante. 4 hr. As células foram fixadas e coradas com um anticorpo anti-SBP-tag (verde) e a máscara de núcleos, DAPI (azul). É possível visualizar focos fluorescentes, indicativo de GTGE intracelular a 2,5 ug / ml através de microscopia confocal, embora os melhores resultados foram obtidos quando foram usadas maior quantidade de proteína de partida. Os resultados satisfatórios (incluindo proteína intracelular facilmente observadas por microscopia confocal de membrana sem excessiva agregados associados) foram obtidos a 50 ug / ml para GTGE e, assim, no maiores concentrações foram testadas.
Figura 4:. Internalização proteína e falta de co-localização com marcadores endossoma fatias ópticos consecutivos (z pilhas) obtidos por microscopia confocal para visualizar se a proteína foi electroporado interno. Células RAW foram electroporadas com 50 ug / ml GTGE. (A) mostra a fatia óptico 6 de 36, a pilha-z (2,1 micrómetros) por cima do fundo do prato. (B) mostra o mesmo campo de visão, mas em 26 de fatia 36. Os focos intracelulares estender por toda a célula, indicando que a proteína é realmente intracelular e não agregados na superfície da célula. Luz azul é a combinação de WGA vermelho, anticorpo secundário verde e azul DAPI. Ensaio de co-localização com marcadores de endossomas / lisossomas, Rab5, (C) ou um marcador de lisossoma, LAMP1 
Figura 5: persistência Protein após a eletroporação micrografia confocal mostrando a persistência de GTGE electroporado ao longo do tempo.. 50 ug / ml GTGE foi electroporado em células HeLa. As células foram depois fixadas e coradas com um anticorpo anti-SBP-tag (verde) e a máscara de núcleos, DAPI (azul). 4 h (A) foi determinada como sendo a quantidade mínima de tempo para permitir que as células recuperam e como esperado mostra proteína máxima intracelular. Após 24 h (B) e 96 horas (C), os focos verde, tanto intracelulares e no celsuperfície lular, mostra efetoras persistência indicando que a proteína não é degradadas dias após o tratamento inicial. A cor azul claro nesta imagem é a sobreposição de DAPI azul ea coloração de anticorpos verde. 
Figura 6:. Agregação de proteínas de superfície celular e um fenótipo electroporação de células de macrófagos RAW ou semelhante foram incubadas (A) ou electroporação (B) com 50 ug / ml GTGE e coradas com anticorpo anti-SBP-tag (verde), o WGA (Vermelho ), e com DAPI (azul). Tanto as células HeLa RAW 264.7 e, em menor grau, tendiam a agregar efectora na superfície da célula; todas as células electroporadas foram mostrado ter aumentado proteína interna (HeLa não mostrado). O amarelo é a sobreposição de vermelho e verde da WGA de proteína alvo. RAW (C) e HeLa (D) células showing um fenótipo alterado após incubação com GTGE (mostrado). Várias experiências mostraram um fenótipo que consiste em células mais pequenas com coloração DAPI diferencial e uma perda de citoplasma. Luz azul é a sobreposição do WGA vermelho, anticorpo secundário verde e azul DAPI. A microscopia confocal foi utilizada para mostrar a proteína alvo que se acumula no núcleo. Uma vez que este fenótipo de células de proteína carregados exógenos surge depois de incubação e electroporação, pode-se supor que este fenótipo ser sugestivo de apoptose. 
Figura 7:. Interacções proteína do hospedeiro com electroporadas Salmonella SspH1 - células HeLa As células foram electroporadas com as concentrações indicadas com SspH1, deixou-se recuperar durante 4 horas antes de efectuar uma purificação por afinidade modificado, seguidas por western blot (A) para enriquecer em edetectar o parceiro interagindo eucariótica conhecido: proteína serina / treonina quinase N1 (PKN1). Note-se que a faixa da direita (2x PE) inclui duas cuvetes agrupados, como o sinal a partir de uma cuvete misturou-se no fundo, no entanto, ainda PKN1 foi enriquecido acima da falta de ligação observada no controlo não-isca. O Western blot foi realizado com lisado de células HeLa nativo, purificado SspH1, e as amostras de purificação por afinidade antes de serem sondados com um anticorpo monoclonal para PKN1. A detecção de alvos foi obtido por meio de um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz forte reactividade contra o isotipo do anticorpo primário. Células HeLa (B) mostra a co-localização (amarelo) entre PKN1 (vermelho) e SspH1 (verde) através de microscopia confocal após a electroporação com 50 ug / ml SspH1. Esta sobreposição óptico indica que o efetoras e a proteína de acolhimento estão perto o suficiente para interagir fisicamente. O facto de a interacção foi mostrado no núcleo, pela primeira vez, que oferece um apoio adicionala proteína foi traficada corretamente pelo host.
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Discussion
Efectores secretadas a partir de bactérias patogénicas evoluíram a funcionar dentro do ambiente da célula hospedeira e, assim, é útil para estudá-los in situ dentro do hospedeiro. Introdução de efetores específicos de interesse em células hospedeiras permite a interação patógeno-hospedeiro relevantes a serem estudados de forma isolada, sem a interferência de outras proteínas bacterianas. O objectivo foi o de explorar a electroporação como um meio para introduzir proteínas efectoras bacterianas em células hospedeiras eucarióticas, evitando assim alguns dos desafios associados com a transfecção ou transdução. A proteína fluorescente verde foi utilizada como um controlo e proteínas efectoras Salmonella foram testados. Devido ao interesse em agentes patogénicos bacterianos que têm como alvo as células hospedeiras epiteliais, bem como células imunitárias, foram usadas uma linha epitelial humana do tipo de células (HeLa) e células de macrófagos de ratinho como (RAW 264.7). Eletroporação pode entregar proteínas exógenas em células hospedeiras sem redução apreciável na viabili celularty, e as proteínas foram entregues detectável em células por até quatro dias.
Para isolar os efeitos da proteína de electroporação, a proteína pura é necessária. Neste estudo, as proteínas foram expressas em E. coli estirpe BL21 com marcações de poli-histidina N-terminal e estreptavidina-peptídicos. As proteínas foram purificadas com resina de Ni-NTA, ensaiado para concentração (geralmente entre 5-25 mg / ml) e pureza, e armazenado a -80 ° C até electroporação. Proteínas comercialmente produzidos também seria aceitável para electroporação, uma vez que tendem a ser de elevada pureza e bem caracterizado.
As principais etapas deste protocolo incluiu remover completamente o meio de cultura celular por lavagem e suspendendo as células em tampão isento de proteína. Isto assegura que quaisquer jusante fenótipos observados são devidos à proteína exógena de interesse e não para as proteínas presentes no meio de cultura. A melhor eficiência de electroporação foi observada quando a densidade celular eramais elevado (por exemplo de 6 x 6 x 10 1 x 10 6 células), embora a melhor número de células irá variar com o tamanho e tipo de células. Outro passo importante no experimento foi o de permitir que as células tempo para se recuperar e recolocar a pratos; Isto foi necessário porque as células aderentes foram utilizados neste estudo. Um período de recuperação deve ser menos importante para as células em suspensão, embora possa ser necessária para se obter proteínas de tempo adequado para o tráfico intracelular, as interacções proteína-proteína, ou actividade enzimática, dependendo da natureza do estudo a que se destinam. Desde foram observadas proteínas entregues dentro de células por até 96 horas, há muito espaço para o ajuste para o período de incubação antes da microscopia visualização ou ensaio celular.
Diversas variáveis neste protocolo pode ser otimizado para diferentes tipos de células, proteínas alvo, ou esquemas de análise a jusante. A quantidade de proteína a ser electroporação podem ser ajustadas para a concentração intracelular desejado. Fovisualização r de localização de proteínas, tão pouco como 1 ug pode ser utilizado. Para estudos funcionais, podem ser necessárias quantidades mais elevadas de proteínas de partida. Além disso, a quantidade de tempo para a recuperação de células pós-electroporação pode ser curto ou prolongado. Alvos de proteínas lábeis ou de processos a jusante rápidos exigiria um tempo de incubação mais curto. Além disso, a quantidade de células plaqueadas pode ser ajustado para além das sugestões aqui. As células podem ser plaqueadas mais escassamente se a proteína introduzida é para ser monitorizada por microscopia, ou revestida com maior densidade se a proteína a electroporação é para ser recuperado para aplicações, tais como western blots.
Enquanto eletroporação é um método simples e direto para a introdução de proteínas em células vivas, existem algumas limitações para a técnica. O método requer proteínas altamente puro, em quantidades de micrograma. Tão pouco como 1 mg foi electroporado e visualizados com microscopia confocal, mas montantes iniciais mais elevados de proteína deu Better resultados visuais. Embora a função da proteína não foi avaliada em todas as concentrações após a electroporação, as concentrações proteicas iguais ou superiores a 50 ug / ml foram necessárias para o sinal adequado para a transferência de western. Além disso, devido às limitações de tamanho dos cuvetes eletroporação, ampliação pode exigir processamento de vários cuvetes de células. No entanto, considerando que o processo de eletroporação leva apenas alguns segundos uma vez células são preparadas, o processamento paralelo requer pouco tempo e esforço extra.
Se a proteína é introduzida para ser visualizado por Western blot, microscopia, ou utilizada para a purificação por afinidade, a proteína deve ter uma etiqueta 35 para purificação por afinidade ou um anticorpo disponível para a detecção. No entanto, por razões desconhecidas, algumas interacções conhecidas a partir da literatura ou outros métodos bioquímicos (dados não mostrados) não foram capazes de ser recapitulado após a electroporação. Pode ser que o hospedeiro reconhece como algumas proteínas electroporadas foreign e rapidamente os marca para a degradação do proteassoma.
A electroporação possui várias vantagens sobre outros métodos existentes para a entrega de proteína. Comparado a microinjecção, electroporação é muito mais rápido e mais simples, e um elevado número de células podem ser tratadas de uma só vez com quase 100 por cento de viabilidade para as condições testadas. A electroporação é também mais barata do que a transfecção de proteína com reagentes disponíveis comercialmente. Transfecções de ADN são muitas vezes usadas para estudar proteínas efectoras bacterianas em células hospedeiras; No entanto, isto faz com que as proteínas bacterianas ser sintetizados não idealmente pelo hospedeiro. Por outro lado, a electroporação de proteínas bacterianas remove a dependência na expressão de proteína de mamífero máquinas, permitindo uma melhor representação do processo infeccioso onde as proteínas efectoras são expressos pela bactéria.
Várias aplicações podem utilizar a electroporação de proteína como um método no estudo de intera-hospedeiro bacterianoficções. Primeiro, as células primárias que são muitas vezes difíceis de transfectar pode ser mais favorável para a electroporação para a entrega de proteína. Isto permitirá o estudo da função efectora em tipos de células relevantes mais biologicamente. A electroporação também dá a opção de proteínas e / ou tratamentos de multiplexação. Por exemplo, múltiplas proteínas podem ser introduzidos em simultâneo, ou drogas e outras moléculas pequenas pode ser entregue juntamente com proteínas. O mais importante para a obtenção de um entendimento do efeito funcional das proteínas introduzidas, electroporação proteína poderia ser acoplados com os ensaios para a função da proteína e interacções, tais como purificação por afinidade, Western blot contra alvos conhecidos, a análise da expressão de células inteiras, e microscopia para determinar subcelular localização da proteína introduzida. Assim, este método tem um grande potencial como ferramenta para elucidar a biologia patógeno bacteriano ao lado de outras técnicas de biologia celular e molecular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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