Abstract
El estudio de las interacciones proteína en el contexto de las células vivas puede generar información crítica acerca de la localización, la dinámica y socios que interactúan. Esta información es particularmente valioso en el contexto de la interacción huésped-patógeno. Muchas proteínas de patógenos funcionan dentro de células huésped en una variedad de manera tal, que permite la evasión del sistema inmune del huésped y la supervivencia en el entorno intracelular. Para estudiar estas interacciones proteína-patógeno de la célula huésped, varios enfoques se utilizan comúnmente, incluyendo: la infección in vivo con una cepa que expresa una proteína etiquetada o mutante, o la introducción de genes de patógenos a través de la transfección o transducción. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas. Se buscó un medio para introducir directamente las proteínas exógenas en células. La electroporación se utiliza comúnmente para introducir ácidos nucleicos en células, pero ha sido más raramente aplicado a las proteínas, aunque la base biofísica es exactamente el mismo.A electroporador estándar fue utilizado para introducir efectores bacterianos-etiquetados por afinidad en células de mamífero. Macrófagos epiteliales y ratón Humanos fueron cultivadas por métodos tradicionales, extraído, y se colocaron en 0,4 cm cubetas de electroporación brecha con una proteína exógena bacteriano patógeno de interés (por ejemplo, Salmonella Typhimurium GtgE). Después de la electroporación (0,3 kV) y un corto (4 h) período de recuperación, la proteína intracelular se verificó mediante el etiquetado con fluorescencia la proteína a través de su etiqueta de afinidad y el examen de la distribución espacial y temporal por microscopía confocal. La proteína electroporación también ha demostrado ser funcional dentro de la célula y capaz de tráfico subcelular correcta y la interacción proteína-proteína. Mientras que las proteínas exógenas tendían a acumularse en la superficie de las células, las muestras electroporadas tenían grandes aumentos en la concentración intracelular de efector con respecto a la incubación solo. El protocolo es simple y lo suficientemente rápido para ser hecho en apmoda an paralelo, lo que permite la caracterización de alto rendimiento de las proteínas de patógenos en células huésped incluyendo focalización y la función de las proteínas de virulencia subcelular.
Introduction
Muchas bacterias Gram-negativas emplean sistemas de secreción especializados para inyectar proteínas relacionados con la virulencia (referidos como efectores) directamente en células huésped 1-5. Estos efectores tienen una amplia gama de funciones biológicas que incluyen: la supresión de la inmunidad del huésped, cambios en el citoesqueleto, la modificación de tráfico y la señalización intracelular, los cambios transcripcionales, y las alteraciones del proteasoma anfitrión 6-9. Las funciones de algunos efectores son conocidos, sin embargo, los objetivos de acogida y acción bioquímica (s) de muchos otros queda por determinar. Si bien la comparación de tipo salvaje y las infecciones bacterianas recombinantes es un enfoque válido para estudiar los mecanismos de virulencia efector intracelular, a menudo es ventajoso introducir un efector individuo en la célula huésped. Así, los métodos simples para la introducción y la caracterización de proteínas efectoras bacterianas en el contexto de las células huésped es altamente deseable.
Simplificando el análisis wi experimentalº un solo efector es crítica como en otros efectores pueden tener funciones opuestas o redundantes. Para llevar a cabo esta simplificación, los investigadores han introducido previamente macromoléculas en las células mediante muchos métodos diferentes, incluyendo la transducción viral 10, la microinyección 11, carga por raspado 12,13, fusión celular con microinyección químicamente inducido 14, proteína patentada reactivos "transfección" 15, precipitaciones de fosfato de calcio 16, y la electroporación 17-20. Las moléculas introducidas se extienden a partir de ácidos nucleicos que incluyen las especies de ADN, ARN, y RNAi a las proteínas, tintes impermeables a las células, y los anticuerpos para dianas intracelulares 21,22. Algunos métodos tienen limitaciones incluyendo el tipo de macromolécula que se puede introducir, y en particular análisis aguas abajo pueden ser limitadas debido a la alta toxicidad celular, los mecanismos dañinos de la acción, baja eficacia o eficiencia de introducción. La transfección, un oftemétodo n-utilizado para expresar genes bacterianos en células de mamíferos, también sufre la limitación de que algunos tipos de células de acogida pertinentes, como los macrófagos y las células primarias, son particularmente resistentes a la transfección. Más allá de esto, es difícil de controlar los niveles de proteína bacteriana producida tras la introducción de ADN extraño.
Mucho trabajo se ha establecido la electroporación de ácidos nucleicos en ambas células bacterianas y de mamíferos como una técnica de laboratorio común; Sin embargo, hay investigaciones en curso en los mejores métodos para la entrega de proteínas en las células en condiciones fisiológicas. Informes sobre la transfección de proteínas son prometedores, pero requieren reactivos y optimización caros. El deseo de introducir efectores bacterianos potencialmente tóxicos en una amplia variedad de objetivos celulares con un coste mínimo nos llevó a considerar la electroporación como un método para el estudio de estas proteínas in vivo.
Proteína electroporación 23-25 es un conocióhod para introducir las proteínas en las células vivas a través de electropermeabilización, también conocido como electro-transfección o electro-inyección 26. Esta técnica utiliza pulsos eléctricos de alta intensidad para crear poros en las membranas celulares. Estos poros reversibles permiten macromoléculas que normalmente están excluidos desde el espacio intracelular para entrar en la célula. Tras la eliminación del campo eléctrico externo, la membrana puede volver a cerrar, permitiendo que la célula para retener moléculas que pasan a través de los poros 27,28.
A electroporador estándar se utilizó en este estudio para introducir constantemente efectores bacterianos en ambos ratón células similares a macrófagos y células epiteliales humanas. El método es rápido, eficiente y de bajo costo, sin disminución apreciable en la viabilidad celular. Las proteínas introducidas se pueden visualizar a través de microscopía de inmunofluorescencia o se utilizan para ensayos funcionales. Esto ha sido demostrado utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como un estándar no tóxico, así comodos proteínas efectoras Salmonella, SspH1 y GtgE. Proponemos electroporación proteína como una herramienta adicional en el repertorio para el estudio de las proteínas de virulencia bacteriana y sus funciones en células huésped eucariotas.
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Protocol
1. Prepárese por adelantado
- Cálido tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C.
- Modificación caliente de Dulbecco de medio de Eagle (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estos representan Crecimiento Normal Media (NGM) para células RAW y HeLa, respectivamente.
2. Preparación de las células
- Se cultivan las células RAW 264.7 a 70-90% de confluencia en NGM.
- Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera húmeda.
- Se cultivan las células HeLa a 70-90% de confluencia en NGM.
- Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera húmeda.
- Antes de la recolección, lave monocapa de células una vez con PBS estéril.
- Recoger las células pre-confluentes en un tubo cónico estéril.
- Raspar suavemente las células RAWcon un policía de caucho en PBS, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares.
- Separar las células HeLa con solución de tripsina al 0,25% hasta que el examen visual muestra la disociación de la superficie de cultivo. Por ejemplo, utilizar 2 a 3 ml de un matraz T-75. Ajuste el volumen en consecuencia para garantizar solución de tripsina cubre toda la superficie de crecimiento.
- Se inactiva la reacción de disociación con NGM que contiene 10% de FBS.
- Utilice al menos dos veces el volumen de NGM a la tripsina, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares.
- Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
- Resuspender en mismo volumen que la solución de tripsina / enfriamiento utilizando PBS estéril.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de partículas.
- Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
- Resuspender en volumen adecuado de PBS durante 5,5 x 10 6 a 6,0 x 10 6 células / ml. Nota: Por ejemplo, un matraz T-75 producirá aproximadam ente 7,5 x 10 6 células 29.
- Mantenga suspensión de células en hielo hasta la electroporación.
3. Preparación para la electroporación
- Cubetas Pre protección contra el frío de electroporación (brecha de 0,4 cm) en el hielo.
- Encienda el aparato de electroporación y ajustar la tensión de 0,3 kV.
NOTA: La capacitancia y la resistencia no eran configuraciones ajustables en nuestro electroporador (fijado en 10 mF y 600 Ω por el fabricante). - Llenar placas de recuperación con NGM y equilibrar en humidificado 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera a 37 ° C.
4. La electroporación
- Coloque 400 l de suspensión celular en la cubeta previamente enfriada y añadir 20 g de proteína seleccionada para la cubeta (50 mg / ml).
- Cubeta Flick suavemente ~ 10 veces para mezclar sin dañar las células. Nota: La cubeta también puede invertirse varias veces para mezclar bien, pero no pipetear hacia arriba y hacia abajo o vortex para evitar daños en las células.
- Muestra electroporar a 0,3 kV para 1.5 a 1.7 ms. Nota: Esto era típico para este estudio.
- Inmediatamente después de la electroporación película cubeta suavemente ~ 10 veces para mezclar a fondo.
5. Chapado de células
- Cubeta tienda con células electroporadas en hielo hasta que esté listo para colocar en placas de recuperación.
- Para la mayoría de los análisis posteriores, se lavan las células 1x con pre-calentado NGM para eliminar la proteína efectora extraña.
- Eliminar las células para su análisis y suspender en 3-5 ml de NGM.
- Sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
- Volver a suspender en un volumen adecuado de NGM por tamaño de la placa deseada (por ejemplo, 2 ml de 35 mm plato).
- Retire cantidad adecuada de células para el análisis de aguas abajo.
- Ejemplo 1: placa en placas de fondo de cristal para el análisis de microscopía.
- Ejemplo 2: Placa de into de plástico de cultivo celular para el análisis de proteínas tales como purificaciones de afinidad.
- Permitir que las células se recuperen en placas equilibrada en humidificado 95% de aire / 5% de CO 2 atmósfera a 37 ° C durante al menos 4 h.
6. Análisis de Microscopía
6.1) Fijación / inmunofluorescencia tinción
- Lavar las células con PBS 1x estéril después de un período de recuperación de 4 horas.
- Fijar las células en 100% de metanol durante 2 min a temperatura ambiente. Use suficiente metanol para cubrir completamente las células (por ejemplo, 2 ml por placa de 35 mm).
- Lavar 3 veces con PBS estéril.
- Permeabilizar las células con 0,4% Triton X-100 en PBS durante 15 min. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro.
- Ajuste la longitud de permeabilización y la fuerza de Triton X-100 de acuerdo con epítopo y la ubicación de proteína diana. Nota: se necesitan mejores resultados debe determinarse empíricamente para cada objetivo, sin embargo las condiciones anteriores deben ser adecuados para la mayoría cobjetivos ytosolic.
- Bloque con 5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 1 hora a RT. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro.
- Lavar 3 veces con PBS.
- Incubar anticuerpo primario en solución de unión del anticuerpo (0,1% Triton X-100 y 1% de BSA en PBS) durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Por ejemplo, use 0.5 ml para una placa de 35 mm de diámetro.
- Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. Nota: Por ejemplo, se utilizó el anticuerpo etiqueta de péptido de unión a estreptavidina-(SBP-tag) a 1: 1000 dilución, mientras que el anticuerpo PKN1 se utilizó a 1: 200 dilución.
- Lave 4 veces con PBS.
- Incubar con el anticuerpo secundario conjugado fluorescente apropiada en solución de unión del anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Por ejemplo, utilice Alexa 488 o Alexa 647 durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Siga las recomendaciones del fabricante para la hormigadilución ibody. (Por ejemplo aproximadamente 1: 1000 para este estudio).
- Añadir otras manchas según sea necesario, por ejemplo, 5 mM de germen de trigo agglutinnin (WGA) conjugado con Alexa 647 o DAPI según la recomendación del fabricante, durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Por ejemplo, utilice Alexa 488 o Alexa 647 durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lave 5x con PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz hasta el momento de la imagen.
6.2) Microscopía Confocal y Análisis de Imágenes
- Muestras de imagen en un microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x.
- Imagen canal verde utilizando la línea de 488 nm de un láser de argón, con emisión de ancho de banda entre 492 a 542 nm.
- Imagen canal rojo usando un láser de diodo de 633 nm, con emisión de ancho de banda entre 640 a 718 nm.
- Imagen azul canal utilizando un láser de diodo de 405 nm, con emisión de ancho de banda entre 407 a 453 nm.
- Asegúrese de que el canal múltiple z-pilas cubren la totalidad del volumen celular.
- Procesar imágenes con software de procesamiento de imagen correspondiente.
Purificación 7. Affinity
- Lavar las células electroporadas dos veces con PBS 4 ° C después de un período de recuperación de 4 hr.
- Lisan con ~ 1,0 ml de tampón de lisis (1% Triton X-100 con cóctel inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa en PBS) en hielo. Utilice inhibidores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Por ejemplo, tanto los inhibidores de la fosfatasa y de la proteasa utilizados en este estudio fueron suministrados a 100X, pero otras formulaciones deben funcionar igualmente bien.
- Inmediatamente raspar las células con goma de policía y recoger en tubos cónicos.
- Lisan mediante agitación vigorosa y sonicación. Nota: Otros métodos de lisis pueden funcionar igual de bien, pero necesitarán la eficiencia por determinar empíricamente acerca de la adecuación de los requisitos de ensayo.
- Sonicar 3 x 30 segundos con agitación con vórtex intermitente.
- Centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para recogerrestos celulares y agregados insolubles; guardar el sobrenadante.
- Combinar volúmenes iguales (~ 1,0 ml) de lisado de células a electroporación con 50 l de estreptavidina suspensión de resina de agarosa a 4 ° C durante la noche con rotación de extremo a extremo. Nota: Esta resina captura la proteína de electroporación (y complejos asociados) a través de su péptido etiqueta de afinidad de unión a estreptavidina.
- Centrifugar a 2500 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
- Lavar dos veces con 40 volúmenes de lecho (~ 1 ml) PBS.
- Añadir 30 l de 4x LDS tampón de carga (141 mM de base Tris, 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G, fenol 0,175 mM rojo, pH 8,5), 20 l DIH 2 O y 1 l de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), lo que permite algo de volumen permanezca en perlas.
- Se calienta a 95 ° C durante 10 min y enfriar en hielo.
- Girar> 10.000 xg a 4 ° C durante 5 min.
- Recoger el sobrenadante.
- Realizar una transferencia Western utilizando anticuerpos apropiados Nota: Élre, se utiliza anti-PKN1 anticuerpo primario.
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Representative Results
Como prueba inicial de concepto, proteína fluorescente verde purificado se introdujo con éxito en células de mamífero utilizando electroporación. GFP, un aproximado de 27 kD una proteína de peso molecular se introduce comúnmente en células de mamífero (normalmente expresadas a partir de ADN del plásmido) como una herramienta de biología molecular sin toxicidad celular significativa. Las células HeLa se incubaron (Figura 1A) o electroporación (Figura 1B) con 25 g GFP / ml, seguido por microscopía de inmunofluorescencia confocal para comprobar si la señal GFP fluorescente. Para demostrar que la GFP estaba dentro del citosol celular, las células también se tiñeron con aglutinina de germen de trigo (WGA) para delinear el límite citosólica (rojo), así como una mancha de ácido nucleico, DAPI (azul) para indicar el núcleo. Se observó señal de GFP intracelular sólo a la electroporación, mientras que ninguna proteína intracelular se observó en las células incubadas con GFP. Se observaron resultados similares con RAW264.7 ratóncélulas como los macrófagos-(Figura 1C y 1D). Tenga en cuenta que es una lectina WGA que se une preferentemente a los residuos en la membrana plasmática y por lo tanto puede mostrar tinción puntiforme en base a la duración de la incubación. Comparar la Figura 1A y la Figura 2A, donde la figura 2A se incubó durante una duración superior a la Figura 1A.
La electroporación se extendió luego a un etiquetado, efector Salmonella purificada, GtgE. GtgE, un factor de virulencia conocida 30, fue descubierto por nuestro grupo para ser secretada en las células huésped 31, y fue recientemente demostrado ser una proteasa cisteína 32. Las células HeLa se incubaron o electroporación con 50 mg / ml GtgE. Para el análisis de inmunofluorescencia, las células se tiñeron con un anticuerpo contra el péptido etiqueta de afinidad de unión a estreptavidina-en GtgE. Las células también se tiñeron con WGA y DAPI. En las células HeLa incubadas (Figure 2A), no hay GtgE intracelular como se visualiza por la falta de focos fluorescente verde. En contraste, las células HeLa electroporadas (Figura 2B) muestran significativa de la señal intracelular efector de la proteína fluorescente indicando había entrado en las células debido al proceso de electroporación. Células RAW mostraron un ligero aumento del propensión a acumular la proteína en la superficie celular durante la incubación (Figura 2C), pero la señal intracelular se observó sólo a la electroporación (Figura 2D).
La determinación de los límites de detección para la visualización de la localización subcelular mediante microscopía confocal era importante asegurar suficiente proteína entró en la celda, mientras que evita la sobrecarga de la célula con efectores bacterianos potencialmente tóxicos. En la Figura 3, GtgE se sometió a electroporación en células similares a macrófagos RAW a 2,5, 25, y 50 mg / ml. Las células fueron fijadas y teñidas con un anticuerpo contra la etiqueta en GtgE. Oólo se observó un pequeño número de focos en el 2,5 mg / ml GtgE (Figura 3), con un mayor número de focos aparente a 25 mg / ml, (Figura 3B), pero el mayor número de focos distintos fueron vistos en la proteína máxima concentración probada, 50 mg / ml (Figura 3C). Se observaron patrones de tinción similares entre las muestras que indican en estas concentraciones de proteína intracelular de proteínas podría ser fácilmente verificada por microscopía confocal. Las concentraciones de proteína por encima de 50 mg / ml no fueron probados porque como la concentración de proteína aumentado, también lo hizo la propensión a la proteína diana a ser adsorbido a la superficie de las células. Para evitar estos agregados de la proteína asociada a la membrana, se hizo necesario poner en común dos cubetas de electroporación para obtener suficiente proteína de interacción huésped de visualizar en un western blot (Figura 6, carril de la derecha).
Para demostrar aún más que la intproteína roducido no estaba simplemente adsorbido a la superficie de la célula, secciones ópticas consecutivos fueron imágenes en planos focales cada ,35-,43 micrómetros (Z-pilas) usando microscopía confocal. Las células RAW se sometieron a electroporación con 50 mg / ml y se tiñeron GtgE como se describe anteriormente (Figura 4, A y B). Los Z-pilas mostraron que GtgE era de hecho intracelular y los focos se extienden desde la parte inferior (Figura 4A, plano 6 de 36) a la parte superior de la célula (Figura 4B, el plano 26 de 36). Se obtuvieron resultados similares para todas las proteínas electroporadas. El perfil de fluorescencia intrínseca de las poblaciones de células de control con y sin proteína efectora o la electroporación se examinó por microscopía confocal fluorescente, y se encontró que era insignificante.
Además, la proteína de electroporación se examina para ver si estaba destinada a la degradación a través de vías endocítica. Las células se tiñeron para Ras-proteína relacionada 5A (Rab5), unamarcador de endosomas tempranos (Figura 4C), o proteína de membrana asociada a lisosoma 1 (Lamp1), un marcador de endosomas tardíos y lisosomas (Figura 4D). Co-localización entre la proteína electroporación y estos marcadores celulares indicaría una interacción física estrecha entre ellos (es decir, que la proteína electroporación estaba dentro de los endosomas / lisosomas). La microscopía confocal mostró que la proteína electroporación (GFP o GtgE) no co-localizar con LAMP1 o Rab5. Se infiere de ello que introdujo proteína no se endocitosis directamente en las células o dirigido a la vía endocítica dentro de las cuatro horas de tratamiento.
Introducción proteína exógena puede tener efectos celulares en el transcurso de varias horas o días, y por lo tanto a menudo es beneficioso para examinar la persistencia de proteínas introducidas. Para determinar cuánto tiempo persistiría una proteína electroporación sin degradación después de la electroporación. O Basadon visualización de apego y la propagación de células, 4 horas se determinó que era el tiempo de recuperación mínimo aproximado de células electroporadas. Para observar la persistencia temporal de proteína se realizó un experimento de evolución temporal, la tinción de las células 4, 24, o 96 horas después de la electroporación. Después de 4 hr (Figura 5A), cuando la morfología celular sugiere recuperación, había una apreciable cantidad de proteína intracelular. Después de 24 horas (Figura 5B), todavía había proteína electroporó sustancial dentro de las células. Incluso cuando el tiempo después de la electroporación se extendió a 96 hr antes de la fijación y la tinción (Figura 5C) hubo focos observables aunque a un abundancia aparente reducida, lo que demuestra días de persistencia de proteínas después del tratamiento inicial.
Se observaron dos advertencias importantes durante el curso de estos experimentos. Células RAW mostraron una mayor tendencia que las células HeLa para acumular proteínas exógenas en la superficie celular irreperspectiva de la incubación (Figura 6A) o la electroporación (Figura 6B). A pesar de esto, todas las muestras habían electroporadas aumento de la proteína interna (Figuras 1, 2, 5b). Además, la proteína asociada a la membrana desapareció con el tiempo. Una segunda advertencia es una pequeña población de células que muestran un fenotipo que consiste en más pequeño, las células cargadas con altas cantidades de proteínas exógenas en tanto el control redondeado (incubó) y las células tratadas (electroporación) (Figura 6 C y D, las muestras de incubación se muestra). Los núcleos de estas células mostraron cromatina condensada basándose en la tinción DAPI, y se llenan la totalidad del volumen celular, sugerente de la apoptosis. Por tanto, es posible que las células apoptóticas (que surgen como una parte normal del ciclo celular o debido a la cosecha / tratamiento) tienen una propensión a absorber la proteína de la memoria intermedia.
Para demostrar que las proteínas electroporación eran funcionales y podrían localizar correctly dentro de la célula huésped, la co-localización y la interacción proteína-proteína entre la proteína de Salmonella efector SspH1 y su host de destino conocido, la proteína quinasa N1 (PKN1) 33 se muestra. Después de la electroporación, la interacción física entre SspH1 y PKN1 se verificó mediante una inmunoprecipitación basado afinidad seguida de Western blot (Figura 7A). Co-localización también se observó por microscopía confocal, que indica los fluoróforos están lo suficientemente cerca espacialmente para solapar 34. Después de la electroporación con 50 mg / ml SspH1, las células HeLa (Figura 7b) se fijaron y tiñeron para SspH1 (verde) y PKN1 (rojo). Al láser de baja potencia distintos focos (amarillo) se observaron en el núcleo indicando SspH1 y PKN1 eran físicamente lo suficientemente cerca para interactuar. Esta interacción ha sido establecido en la literatura; sin embargo, este estudio es el primero en mostrar co-localización en el núcleo.
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264.7 células HeLa o RAW células se incubaron o electroporación con 25 g / ml de proteína fluorescente verde purificado (GFP) y se tiñeron con anticuerpo anti-GFP (verde), DAPI, una sonda específica nuclear (Blue - Electroporación de GFP: la Figura 1. ), y WGA (rojo) para delinear la frontera citosólica. Incubaron células (A) HeLa muestran una ausencia de fluorescencia verde indica una falta de internalización de GFP. (B) muestra una microfotografía representativa de GFP a electroporación. Tenga en cuenta la aparición de focos intracelular indica GFP había entrado en las células. (C) y (D) son imágenes representativas de células RAW incubadas (C), o electroporación (D) con 25 mg / ml de proteína verde fluorescente purificada.
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Figura 2:. Electroporación de Salmonella efector GtgE - células HeLa Las células se incubaron (A) o electroporación (B) con 50 mg / ml de una afinidad etiquetados Salmonella efector, GtgE, y se tiñó con un anticuerpo anti-tag efector (verde), DAPI, una máscara nuclear (azul), y WGA (rojo) para delinear la frontera citosólica. En (A), se incubaron células HeLa muestran una ausencia de fluorescencia verde indica una falta de internalización de GtgE. (B) muestra una microfotografía representativa de electroporación GtgE, mostrando intracelular electroporación proteína efectora. (C) y (D) son imágenes representativas de células RAW que fueron incubados o bien a electroporación, respectivamente, de la misma manera con 50 g / ml de Salmonella GtgE. La luz azul es la combinación o superposición, de fluorescencia roja de la WGA yfluorescencia verde del anticuerpo secundario.
Figura 3: La titulación de proteína de electroporación - células de tipo macrófago RAW Las células se sometieron a electroporación con 2,5 mg / ml (A), 25 mg / ml (b), o 50 mg / ml (C) Salmonella efector GtgE y dejaron recuperar durante. 4 hr. Las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-SBP-tag (verde) y la máscara de núcleos, DAPI (azul). Es posible visualizar focos fluorescentes, indicativo de GtgE intracelular en 2,5 mg / ml a través de microscopia confocal, aunque se obtuvieron mejores resultados cuando se utiliza una mayor cantidad de partida de la proteína. Los resultados satisfactorios (incluyendo la proteína intracelular fácilmente observado por microscopía confocal de membrana sin excesiva agregados asociados) se obtuvieron a 50 mg / ml para GtgE y por lo tanto no concentraciones mayores fueron probados.
Figura 4:. Internalización de proteínas y la falta de co-localización con marcadores endosoma rebanadas ópticos consecutivos (z-pilas) obtenidas por microscopía confocal para visualizar si la proteína electroporación era interno. Las células RAW se sometieron a electroporación con 50 mg / ml GtgE. (A) muestra la rebanada óptico 6 de 36, el Z-pila (2,1 micrómetros) por encima de la parte inferior del plato. (B) muestra el mismo campo de visión pero al rebanada 26 de 36. Los focos intracelulares se extienden por toda la célula que indica que la proteína es verdaderamente intracelular y no agregados sobre la superficie de la célula. La luz azul es la combinación de WGA rojo, anticuerpo secundario verde y azul DAPI. Ensayo de co-localización con marcadores de endosomas / lisosomas, Rab5, (C) o un marcador lisosoma, LAMP1 
Figura 5: persistencia de proteínas después de la electroporación micrografía confocal que muestra la persistencia de GtgE electroporación con el tiempo.. 50 mg / ml GtgE se sometió a electroporación en células HeLa. Las células fueron fijadas y teñidas con un anticuerpo anti-SBP-tag (verde) y la máscara de núcleos, DAPI (azul). 4 horas (A) se determinó que la cantidad mínima de tiempo para permitir que las células se recuperen y como se esperaba muestra máxima de proteínas intracelulares. Después de 24 horas (B) y 96 h (C), focos verde, tanto intracelular y en el celsuperficie lular, persistencia espectáculo efector que indica que la proteína no es día degradados después del tratamiento inicial. El color azul claro en esta imagen es la superposición de DAPI azul y la tinción de anticuerpos verde. 
Figura 6:. La superficie celular agregación de proteínas y un fenotipo electroporación células como los macrófagos-RAW se incubaron ya sea (A) o electroporación (B) con 50 mg / ml GtgE y se tiñeron con anticuerpos anti-SBP-etiqueta (verde), WGA (Rojo ), y con DAPI (azul). Tanto RAW 264.7 y en menor grado las células HeLa, tendían a agregarse efector en la superficie de la célula; todas las células electroporadas se han mostrado a aumento de la proteína interna (HeLa no mostrado). Amarillo es la superposición de rojo de Ventajas de Windows Original y verde de la proteína diana. Células RAW (C) y HeLa (D) showing un fenotipo alterado después de la incubación con GtgE (muestra). Varios experimentos mostraron un fenotipo que consiste en células más pequeñas con diferencial de tinción DAPI y una pérdida de citoplasma. La luz azul es la superposición del WGA rojo, anticuerpo secundario verde y azul DAPI. Se utilizó la microscopía confocal para mostrar la proteína diana que se acumula en el núcleo. Dado que este fenotipo de las células de proteínas exógenas Laden apareció después de que tanto la incubación y la electroporación, se podría plantear la hipótesis de este fenotipo a ser indicativos de apoptosis. 
Figura 7:. Host interacciones de proteínas con Salmonella SspH1 electroporadas - células HeLa Las células se sometieron a electroporación en las concentraciones que se indican con SspH1, dejaron recuperar durante 4 h antes de realizar una purificación por afinidad modificado seguido por Western blot (A) para enriquecer ydetectar la interacción socio eucariota conocido: serina / treonina proteína quinasa N1 (PKN1). Tenga en cuenta que el carril de la derecha (2x EP) incluye 2 cubetas agrupados, como la señal de una cubeta de mezcla en el fondo, sin embargo, PKN1 todavía se enriqueció por encima de la falta de unión visto en el control sin cebo. El Western blot se realizó con lisado de HeLa nativo, purificado SspH1, y las muestras de purificación por afinidad antes de ser determinada con un anticuerpo monoclonal para PKN1. La detección de objetivos se obtuvo a través de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante reactividad contra el isotipo del anticuerpo primario. Células HeLa (B) que muestra co-localización (amarillo) entre PKN1 (rojo) y SspH1 (verde) a través de por microscopía confocal después de la electroporación con 50 mg / ml SspH1. Esta superposición óptica indica que el efector y la proteína de acogida están lo suficientemente cerca para interactuar físicamente. El hecho de que la interacción se demostró en el núcleo por primera vez, ofrece un apoyo adicional quela proteína fue objeto de trata correctamente por el anfitrión.
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Discussion
Efectores secreta a partir de bacterias patógenas han evolucionado para funcionar en el entorno de la célula huésped y por lo tanto es útil para estudiar in situ dentro del huésped. Introducción de efectores específicos de interés en las células huésped permite las interacciones patógeno-hospedador relevantes para ser estudiados en forma aislada, sin interferencia de otras proteínas bacterianas. El objetivo era explorar la electroporación como un medio para introducir proteínas efectoras bacterianas en células huésped eucariotas, evitando así algunos de los desafíos asociados con la transfección o transducción. Proteína fluorescente verde se utiliza como un control y las proteínas efectoras se ensayaron Salmonella. Debido al interés de los patógenos bacterianos que se dirigen a la sede de las células epiteliales, así como las células inmunes, se utilizaron una línea humana-epitelial de células (HeLa) y las células como los macrófagos-ratón (RAW 264.7). La electroporación puede entregar proteínas exógenas en células huésped sin disminución apreciable en viabili celulardad, y las proteínas entregadas eran detectables en las células durante un máximo de cuatro días.
Para aislar los efectos de la proteína electroporación, se requiere la proteína pura. En este estudio, las proteínas se expresaron en E. coli cepa BL21 con las etiquetas de polihistidina N-terminal y estreptavidina de unión peptídicos. Las proteínas se purificaron con resina Ni-NTA, se ensayó para la concentración (generalmente entre 5-25 mg / ml) y la pureza, y se almacenaron a -80 ° C hasta que la electroporación. Proteínas producidas comercialmente también serían aceptables para la electroporación, ya que tienden a ser de alta pureza y bien caracterizado.
Los pasos claves en este protocolo incluyeron eliminando completamente el medio de cultivo celular mediante el lavado y suspendiendo las células en tampón libre de proteínas. Esto asegura que cualquier fenotipos intermedios observados son debidos a la proteína exógena de interés y no a las proteínas presentes en el medio de cultivo. Se observó una mejor eficiencia de la electroporación cuando la densidad celular erasuperior (por ejemplo 6 x 10 6 vs. 1 x 10 6 células), aunque la mejor número de células variará con el tamaño de celda y el tipo. Otro paso crítico en el experimento era dar tiempo las células se recupere y vuelva a colocar a los platos; esto era necesario ya que las células adherentes se utilizaron en este estudio. Un período de recuperación debe ser menos importante para las células en suspensión, aunque puede ser necesario dar tiempo para el tráfico de proteínas adecuada intracelular, interacciones proteína-proteína, o actividad enzimática, dependiendo de la naturaleza del estudio previsto. Desde que se observaron proteínas entregados dentro de las células de hasta 96 horas, hay mucho espacio para el ajuste al periodo de incubación antes de la microscopía de visualización o ensayo celular.
Varias variables de este protocolo pueden ser optimizados para diferentes tipos de células, proteínas diana, o esquemas de análisis de aguas abajo. La cantidad de proteína que se va a electroporación puede ser afinado para la concentración intracelular deseado. For visualización de localización de la proteína, se puede utilizar tan poco como 1 g. Para los estudios funcionales, pueden ser necesarias cantidades de partida más altos de proteínas. Además, la cantidad de tiempo para la recuperación de células después de la electroporación puede ser cortocircuitado o extendido. Objetivos de proteínas lábiles o procesos aguas abajo rápidas requeriría un tiempo de incubación más corto. Además, la cantidad de células sembradas se puede ajustar más allá de las sugerencias aquí. Las células pueden sembraron más escasamente si la proteína introducida debe ser supervisado por microscopía o plateado más densamente si la proteína electroporación se debe recuperar para aplicaciones tales como transferencias Western.
Mientras que la electroporación es un método simple y directo para la introducción de proteínas en células vivas, existen algunas limitaciones a la técnica. El método requiere proteínas altamente puros en cantidades de microgramos. Tan poco como 1 g se sometió a electroporación y se visualizó con microscopía confocal, pero cantidades mayores de proteína de partida dio better resultados visuales. Mientras que la función de proteínas no se evaluó en todas las concentraciones después de la electroporación, se requirieron concentraciones de proteína iguales a o mayor que 50 g / ml para la señal adecuada para transferencia de western. También, debido a las limitaciones de tamaño de las cubetas de electroporación, la ampliación puede requerir procesamiento de múltiples cubetas de células. Sin embargo, teniendo en cuenta que el proceso de electroporación toma cuestión de segundos una vez que se preparan las células, el procesamiento en paralelo requiere poco tiempo y esfuerzo extra.
Si la proteína introducida es para ser visualizado por Western blot, microscopía, o utilizado para la purificación por afinidad, la proteína debe tener una etiqueta 35 para purificación por afinidad o un anticuerpo disponible para la detección. Sin embargo, por razones desconocidas, algunas interacciones conocidos de la literatura o de otros métodos bioquímicos (datos no presentados) no fueron capaces de ser recapitulado después de la electroporación. Puede ser que el huésped reconoce algunas proteínas electroporadas como fXTRANJERA y rápidamente las marca para la degradación del proteasoma.
La electroporación tiene varias ventajas sobre otros métodos existentes para la entrega de proteínas. En comparación con la microinyección, electroporación es mucho más rápido y sencillo, y un gran número de células puede ser tratada a la vez con casi el 100 por ciento de viabilidad para las condiciones ensayadas. La electroporación es también más barato que la transfección de proteínas con reactivos disponibles comercialmente. Transfecciones de ADN se utilizan a menudo para estudiar las proteínas efectoras bacterianas en células huésped; sin embargo, esto hace que las proteínas bacterianas a ser sintetizados no idealmente por el anfitrión. Por otro lado, la electroporación de proteínas bacterianas elimina la dependencia de la maquinaria de expresión de proteínas de mamíferos, lo que permite una mejor representación del proceso infeccioso donde las proteínas efectoras se expresan por las bacterias.
Varias aplicaciones pueden utilizar la electroporación proteína como un método en el estudio de Intera bacteriana huéspedcciones. En primer lugar, las células primarias que son a menudo difíciles de transfectar puede ser más susceptible a la electroporación para la entrega de proteínas. Esto permitirá el estudio de la función efectora en tipos de células relevantes biológicamente más. La electroporación también da la opción de proteínas y / o tratamientos de multiplexación. Por ejemplo, múltiples proteínas se pueden introducir de forma simultánea, o de las drogas y otras moléculas pequeñas pueden ser entregados junto con proteínas. Lo más importante para la obtención de una comprensión funcional del efecto de las proteínas introducidas, electroporación proteína podría combinarse con ensayos para la función de las proteínas y las interacciones, tales como la purificación por afinidad, transferencias de Western contra objetivos conocidos, análisis de expresión de células enteras, y la microscopía para determinar subcelular la localización de la proteína introducida. Por lo tanto, este método tiene un gran potencial como herramienta para elucidar la biología patógeno bacteriano junto con otras técnicas de biología celular y molecular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
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