La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Resumen

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

Resumen

El estudio de las interacciones proteína en el contexto de las células vivas puede generar información crítica acerca de la localización, la dinámica y socios que interactúan. Esta información es particularmente valioso en el contexto de la interacción huésped-patógeno. Muchas proteínas de patógenos funcionan dentro de células huésped en una variedad de manera tal, que permite la evasión del sistema inmune del huésped y la supervivencia en el entorno intracelular. Para estudiar estas interacciones proteína-patógeno de la célula huésped, varios enfoques se utilizan comúnmente, incluyendo: la infección in vivo con una cepa que expresa una proteína etiquetada o mutante, o la introducción de genes de patógenos a través de la transfección o transducción. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas. Se buscó un medio para introducir directamente las proteínas exógenas en células. La electroporación se utiliza comúnmente para introducir ácidos nucleicos en células, pero ha sido más raramente aplicado a las proteínas, aunque la base biofísica es exactamente el mismo.A electroporador estándar fue utilizado para introducir efectores bacterianos-etiquetados por afinidad en células de mamífero. Macrófagos epiteliales y ratón Humanos fueron cultivadas por métodos tradicionales, extraído, y se colocaron en 0,4 cm cubetas de electroporación brecha con una proteína exógena bacteriano patógeno de interés (por ejemplo, Salmonella Typhimurium GtgE). Después de la electroporación (0,3 kV) y un corto (4 h) período de recuperación, la proteína intracelular se verificó mediante el etiquetado con fluorescencia la proteína a través de su etiqueta de afinidad y el examen de la distribución espacial y temporal por microscopía confocal. La proteína electroporación también ha demostrado ser funcional dentro de la célula y capaz de tráfico subcelular correcta y la interacción proteína-proteína. Mientras que las proteínas exógenas tendían a acumularse en la superficie de las células, las muestras electroporadas tenían grandes aumentos en la concentración intracelular de efector con respecto a la incubación solo. El protocolo es simple y lo suficientemente rápido para ser hecho en apmoda an paralelo, lo que permite la caracterización de alto rendimiento de las proteínas de patógenos en células huésped incluyendo focalización y la función de las proteínas de virulencia subcelular.

Introducción

Muchas bacterias Gram-negativas emplean sistemas de secreción especializados para inyectar proteínas relacionados con la virulencia (referidos como efectores) directamente en células huésped ^1-5. Estos efectores tienen una amplia gama de funciones biológicas que incluyen: la supresión de la inmunidad del huésped, cambios en el citoesqueleto, la modificación de tráfico y la señalización intracelular, los cambios transcripcionales, y las alteraciones del proteasoma anfitrión ^6-9. Las funciones de algunos efectores son conocidos, sin embargo, los objetivos de acogida y acción bioquímica (s) de muchos otros queda por determinar. Si bien la comparaci....

Protocolo

1. Prepárese por adelantado

1. Cálido tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C.
2. Modificación caliente de Dulbecco de medio de Eagle (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estos representan Crecimiento Normal Media (NGM) para células RAW y HeLa, respectivamente.

2. Preparación de las células

1. Se cultivan las células RAW 264.7 a 70-90% de confluencia en NGM.
   1. Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO ₂ atmósfera húmeda.
2. Se cultivan las....

Resultados

Como prueba inicial de concepto, proteína fluorescente verde purificado se introdujo con éxito en células de mamífero utilizando electroporación. GFP, un aproximado de 27 kD una proteína de peso molecular se introduce comúnmente en células de mamífero (normalmente expresadas a partir de ADN del plásmido) como una herramienta de biología molecular sin toxicidad celular significativa. Las células HeLa se incubaron (Figura 1A) o electroporación (Figura 1B) con 25 g GFP / ml, seguido por mi.......

Discusión

Efectores secreta a partir de bacterias patógenas han evolucionado para funcionar en el entorno de la célula huésped y por lo tanto es útil para estudiar in situ dentro del huésped. Introducción de efectores específicos de interés en las células huésped permite las interacciones patógeno-hospedador relevantes para ser estudiados en forma aislada, sin interferencia de otras proteínas bacterianas. El objetivo era explorar la electroporación como un medio para introducir proteínas efectoras bacterianas en células .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% Tripsina-EDTA Solución	Cellgro	25-050-CL
0,4 cm Cubetas de electroporación desechables por huecos	Bio-Rad	165-2088
100% Metanol	Cualquier	N/A Inflamable	, Tóxico
Albúmina Suero Bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Aparato de recuento de células - Hemocitómetro o contador de rejas Beckman	Coulter	Modelo Z1
Incubadora de cultivos celulares	Cualquier	N/A	Humidificado 95% aire/5% CO2 atmósfera a 37 °C; C
Plástico para cultivos celulares	Cualquiera	N/A	Matraces/placas para cultivos celulares, pipetas, tubos, policías
de caucho Modificación del águila de Dulbecco s Medio (DMEM)	Cellgro	10-013	Cálido hasta 37 &° C
Electroporador	Bio-Rad	E. coli Pulsador
Suero Fetal Bovino (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Microscopio confocal fluorescente	Ziess	LSM 710
Placas con fondo de vidrio para microscopía	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Cóctel de inhibidores de proteasa	Pierce	78430	Línea celular HeLa corrosiva y tóxica
	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Tampón de carga	Invitrogen	NP0007
Medio esencial mínimo (MEM)	Cellgro	10-010	Cálido hasta 37 ° C
Otras tinciones fluorescentes (WGA, DAPI) junto con el reactivo antidecoloración	Cualquier	N/A
Penicilina/Estreptomicina	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Línea celular	ATCC	TIB-71
Anticuerpo primario contra el objetivo de interés	Cualquier	N/A
Anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo	Cualquier	N/A
Solución salina tamponada con fosfato	Cualquier	N/A	enfriar a 4 & deg; C
Solución salina tamponada con fosfato estéril	cualquier	N/A	caliente a 37 ° C
[header]
Suspensión de resina de estreptavidina y agarosa	Pierce	20353
Centrífuga de mesa capaz de aceptar tubos cónicos (preferiblemente cucharón oscilante)	Cualquier	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosivo, Tóxico
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritante, Tóxico

Modelo