Abstract
Lo studio delle interazioni proteiche nel contesto di cellule viventi in grado di generare informazioni critiche sulla localizzazione, la dinamica, ei partner che interagiscono. Questa informazione è particolarmente importante nel contesto delle interazioni ospite-patogeno. Molte proteine patogeni funzionano all'interno delle cellule ospiti in una varietà di modo come, consentendo l'evasione del sistema immunitario ospite e la sopravvivenza all'interno dell'ambiente intracellulare. Per studiare queste interazioni ospite-patogeno cellula di proteine, diversi approcci sono comunemente usati, tra cui: in infezione vivo con un ceppo che esprime una proteina tag o mutante, o l'introduzione di geni patogeni tramite trasfezione o trasduzione. Ciascuno di questi approcci ha vantaggi e svantaggi. Abbiamo cercato un mezzo per introdurre direttamente proteine esogene in cellule. L'elettroporazione è comunemente utilizzato per introdurre acidi nucleici nelle cellule, ma è più raramente applicata alle proteine anche se la base biofisico è esattamente la stessa.Un elettroporatore standard è stato utilizzato per introdurre effettori batterici affinità con tag nelle cellule di mammifero. Macrofagi epiteliali e mouse umani sono stati coltivati con metodi tradizionali, indipendente, e collocati in 0,4 centimetri cuvette gap elettroporazione con esogeno proteine patogeno batterico di interesse (ad esempio Salmonella Typhimurium GtgE). Dopo l'elettroporazione (0,3 kV) e una breve (4 ore) periodo di recupero, la proteina intracellulare è stata verificata mediante l'etichettatura fluorescente proteina tramite il suo tag affinità e di esaminare la distribuzione spaziale e temporale mediante microscopia confocale. La proteina elettroporate stato anche dimostrato di essere funzionale all'interno della cellula e capace di corretta traffico subcellulare e l'interazione proteina-proteina. Mentre le proteine esogene tendevano ad accumularsi sulla superficie delle cellule, i campioni avevano elettroporate elevato aumento intracellulare concentrazione effettore rispetto alla sola incubazione. Il protocollo è semplice e abbastanza veloce da fare in apmoda arallel, permettendo la caratterizzazione high-throughput di proteine patogeni in cellule ospiti tra cui il targeting e la funzione delle proteine di virulenza subcellulare.
Introduction
Molti batteri Gram-negativi impiegano sistemi di secrezione specializzati per iniettare proteine di virulenza correlate (denominate effettori) direttamente nelle cellule ospiti 1-5. Questi effettori hanno una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui: la soppressione di immunità dell'ospite, cambiamenti del citoscheletro, la modifica del traffico intracellulare e segnalazione, i cambiamenti trascrizionali, e le alterazioni del proteasoma ospite 6-9. Le funzioni di alcuni effettori sono noti, tuttavia gli obiettivi host e azione biochimica (s) di molti altri rimane da determinare. Confrontando wild-type e infezioni batteriche ricombinanti è un valido approccio per studiare i meccanismi effettori di virulenza intracellulari, è spesso vantaggioso introdurre un individuo effettore nella cellula ospite. Così, metodi semplici per introdurre e caratterizzare proteine batteriche effettrici nel contesto delle cellule ospiti è altamente desiderabile.
Semplificare l'analisi sperimentale wi° un singolo effettore è critica come altri effettori possono avere funzioni opposte o ridondanti. Per realizzare questa semplificazione, i ricercatori hanno già introdotto macromolecole nelle cellule da molti metodi diversi, tra cui trasduzione virale 10, microiniezione 11, raschiare il caricamento 12,13, fusione cellulare con microiniezione indotta chimicamente 14, proteine proprietarie "transfezione" reagenti 15, precipitazioni fosfato di calcio 16, 17-20 e elettroporazione. Le molecole introdotte vanno da acidi nucleici, tra cui specie DNA, RNA, e RNAi alle proteine, coloranti cellule impermeabili, e anticorpi per bersagli intracellulari 21,22. Alcuni metodi hanno dei limiti, tra cui il tipo di macromolecola che può essere introdotta, e particolari analisi a valle possono essere limitate a causa dell'alta tossicità cellulare, meccanismi dannosi di azione, bassa efficacia, efficienza o l'introduzione. Transfection, un ofteMetodo n-utilizzata per esprimere geni batterici in cellule di mammifero, soffre anche la limitazione che alcuni tipi di cellule ospite rilevanti, come macrofagi e cellule primarie, sono particolarmente resistenti verso trasfezione. Oltre a ciò, è difficile controllare i livelli della proteina batterica realizzano su introduzione di DNA estraneo.
Molto lavoro ha stabilito l'elettroporazione di acidi nucleici nelle cellule sia batteriche e di mammifero come tecnica di laboratorio comune; tuttavia, non vi è la continua ricerca di metodi migliori per la consegna di proteine in cellule in condizioni fisiologiche. Rapporti su proteine trasfezione sono promettenti, ma richiedono reagenti costosi e l'ottimizzazione. Il desiderio di introdurre effettori batterici potenzialmente tossiche in un'ampia varietà di bersagli cellulari con un costo minimo ci ha portato a considerare elettroporazione come metodo per studiare queste proteine in vivo.
Protein elettroporazione 23-25 è un conosciutoHOD introdurre proteine in cellule viventi attraverso electropermeabilization, noto anche come elettro-trasfezione o elettro-iniezione 26. Questa tecnica utilizza impulsi elettrici ad alta intensità per creare pori nelle membrane cellulari. Questi pori reversibili consentono macromolecole che sono normalmente esclusi dallo spazio intracellulare di entrare nella cellula. Alla rimozione del campo elettrico esterno, la membrana può sigillare, permettendo alla cellula di mantenere molecole che passano attraverso i pori 27,28.
Un elettroporatore standard è stato utilizzato in questo studio per introdurre costantemente effettori batterici in entrambi i macrofagi di topo e cellule epiteliali umane. Il metodo è veloce, efficace e poco costoso, senza diminuzione apprezzabile vitalità cellulare. Le proteine introdotte possono essere visualizzati tramite immunofluorescenza o utilizzati per test funzionali. Questo è stato dimostrato utilizzando proteina fluorescente verde (GFP) come standard non tossico, nonchédue proteine effettrici Salmonella, SspH1 e GtgE. Proponiamo proteina elettroporazione come strumento aggiuntivo nel repertorio per lo studio delle proteine di virulenza batterica e le loro funzioni in cellule ospiti eucariotiche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparare in anticipo
- Warm fosfato sterile salina tamponata (PBS) a 37 ° C.
- Modifica del Warm Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) e Minimal Essential Medium (MEM) addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 100 IU / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina a 37 ° C. Nota: Questi rappresentano la normale crescita media (NGM) per le cellule RAW e HeLa rispettivamente.
2. Preparazione di cellule
- Crescere RAW 264.7 cellule al 70-90% di confluenza in NGM.
- Mantenere cellule a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% di CO 2 nell'atmosfera.
- Crescere cellule HeLa al 70-90% di confluenza in NGM.
- Mantenere cellule a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% di CO 2 nell'atmosfera.
- Prima raccolta, lavare le cellule una volta con PBS sterile.
- Raccogliere cellule pre-confluenti in una provetta conica sterile.
- Raschiare delicatamente le cellule RAWcon un poliziotto di gomma in PBS, con pipettaggio ripetuto per disperdere aggregazioni cellulari.
- Staccare cellule HeLa con soluzione di tripsina 0,25% fino esame visivo mostra dissociazione dalla superficie cultura. Ad esempio, utilizzare 2 a 3 ml per un pallone T-75. Regolare il volume di conseguenza per garantire la soluzione tripsina copre tutta la superficie della crescita.
- Placare reazione di dissociazione con NGM contenente il 10% FBS.
- Utilizzare almeno il doppio del volume di NGM di tripsina, con pipettaggio ripetuto per disperdere aggregazioni cellulari.
- Leggermente pellet cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
- Risospendere in stesso volume soluzione tripsina / raffreddamento con PBS sterile.
- Contare le cellule utilizzando emocitometro o contatore di particelle.
- Leggermente pellet cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
- Risospendere in adeguato volume di PBS per 5,5 x 10 6-6,0 x 10 6 cellule / ml. Nota: Per esempio, un T-75 pallone produrrà approximdiatamente 7,5 x 10 6 cellule 29.
- Tenere sospensione cellulare in ghiaccio fino elettroporazione.
3. Preparazione per elettroporazione
- Cuvette pre-raffreddamento elettroporazione (0,4 centimetri gap) su ghiaccio.
- Accendere apparecchi elettroporazione e impostare la tensione di 0,3 kV.
NOTA: Capacità e resistenza non sono impostazioni regolabili sulla nostra elettroporatore (fissato al 10 uF e 600 Ω dal costruttore). - Riempire le piastre di recupero con NGM ed equilibrare in umidificata 95% di aria / 5% di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C.
4. elettroporazione
- Mettere 400 ml di sospensione cellulare in cuvetta pre-raffreddata e aggiungere 20 mg di proteina selezionato cuvetta (50 mcg / ml).
- Flick cuvetta delicatamente ~ 10 volte per mescolare senza danneggiare le cellule. Nota: La cuvetta può anche essere invertita più volte per mescolare completamente, ma non pipettare su e giù o vortex per evitare di danneggiare le cellule.
- Campione elettroporazione a 0,3 kV per 1,5-1,7 msec. Nota: Questo era tipica per questo studio.
- Subito dopo l'elettroporazione flick cuvetta delicatamente ~ 10 volte per mescolare accuratamente.
5. placcatura di Celle
- Conservare provetta con cellule elettroporate in ghiaccio fino al momento di mettere in lastre di recupero.
- Per la maggior parte delle analisi a valle, lavare le cellule 1x con NGM pre-riscaldato per rimuovere proteine effettrici estranea.
- Rimuovere le cellule per l'analisi e sospendere in 3-5 ml di NGM.
- Agglomerare cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
- Risospendere in un adeguato volume di NGM per dimensioni piatto desiderato (ad esempio 2 ml per piastra da 35 mm).
- Rimuovere adeguata quantità di cellule per l'analisi a valle.
- Esempio 1: piastra in piatti di fondo in vetro per l'analisi al microscopio.
- Esempio 2: piastra into plastica coltura cellulare per l'analisi di proteine come purificazioni affinità.
- Consentono alle cellule di recuperare in lastre equilibrata in umidificata 95% di aria / 5% di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C per almeno 4 ore.
6. Microscopia Analisi
6.1) Fissaggio / immunofluorescenza colorazione
- Lavare le cellule 1x con PBS sterile dopo un periodo di recupero di 4 ore.
- Fissare cellule in metanolo 100% per 2 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare sufficiente metanolo per coprire completamente le cellule (ad esempio 2 ml per piastra da 35 mm).
- Lavare 3x con PBS sterile.
- Permeabilize cellule con 0,4% Triton X-100 in PBS per 15 min. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di diametro 35 mm.
- Regolare la lunghezza di permeabilizzazione e la forza di Triton X-100 secondo epitopo e la posizione di proteina bersaglio. Nota: I migliori risultati dovranno essere determinati empiricamente per ogni target, ma le condizioni di cui sopra dovrebbero essere sufficienti per la maggior parte cobiettivi ytosolic.
- Blocco con 5% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS per 1 ora a RT. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di diametro 35 mm.
- Lavare 3x con PBS.
- Incubare anticorpo primario in soluzione legame anticorpale (0,1% Triton X-100 e 1% BSA in PBS) overnight a 4 ° C con dolce dondolio. Ad esempio, utilizzare 0,5 ml per una piastra diametro 35 mm.
- Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione degli anticorpi. Nota: Ad esempio, l'anticorpo tag peptide streptavidina-binding (SBP-tag) è stato usato a 1: 1.000 diluizione, mentre l'anticorpo PKN1 stato usato in diluizione 1: 200.
- Lavare 4x con PBS.
- Incubare con adeguate anticorpo fluorescente coniugato secondario in soluzione vincolante anticorpi per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
- Ad esempio, utilizzare Alexa 488 o Alexa 647 per 1 ora a temperatura ambiente.
- Seguire le raccomandazioni del produttore per antdiluizione iBody. (Es circa 1: 1,000 per questo studio).
- Aggiungi altre macchie, se necessario, ad esempio, 5 micron di germe di grano agglutinnin (WGA) coniugato con Alexa 647 o DAPI accordo alle raccomandazioni del produttore, per 1 ora a temperatura ambiente.
- Ad esempio, utilizzare Alexa 488 o Alexa 647 per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare 5x con PBS e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce fino al momento di immagine.
6.2) Microscopia Confocale e Image Analysis
- Campioni di immagine su un microscopio confocale invertito con un obiettivo ad immersione 63x olio.
- Immagine canale verde utilizzando la linea 488 nm di un laser ad argon, con emissione di banda tra i 492-542 nm.
- Immagine canale rosso con un diodo laser 633 nm, con emissione di banda tra i 640-718 nm.
- Immagine canale blu utilizzando un diodo laser 405 nm, con emissione di banda tra i 407-453 nm.
- Garantire il canale più z-stacks coprono la totalità del volume cellulare.
- Immagini di processo con un'adeguata software di elaborazione delle immagini.
7. Affinity Purification
- Lavare le cellule elettroporate due volte con 4 ° C PBS dopo un periodo di recupero di 4 ore.
- Lyse con ~ 1,0 ml di tampone di lisi (1% Triton X-100 con cocktail inibitore di proteasi e fosfatasi inibitore in PBS) su ghiaccio. Utilizzare inibitori secondo le istruzioni del produttore. Nota: Per esempio, sia gli inibitori delle proteasi e fosfatasi utilizzati in questo studio sono stati forniti a 100x, ma altre formulazioni dovrebbe funzionare altrettanto bene.
- Prontamente raschiare le cellule con poliziotto in gomma e raccogliere in provette coniche.
- Lyse con vortex vigorosa e ultrasuoni. Nota: Altri metodi di lisi può funzionare altrettanto bene, ma l'efficienza dovranno essere empiricamente determinato come l'idoneità dei requisiti di analisi.
- Sonicare 3 x 30 sec con vortex intermittente.
- Centrifugare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per raccoglieredetriti cellulari e aggregati insolubili; salvare il surnatante.
- Combinare volumi uguali (~ 1,0 ml) di lisato cellulare elettroporate con 50 ml di sospensione di resina agarosio Streptavidin a 4 ° C per una notte con rotazione end-over-end. Nota: Questa resina cattura la proteina elettroporate (e complessi associati) attraverso il suo tag affinità peptide-streptavidina vincolante.
- Centrifugare a 2.500 xg per 2 minuti e scartare il surnatante.
- Lavare due volte con 40 volumi di letto (~ 1 ml) PBS.
- Aggiungere 30 ml 4x LDS tampone di caricamento (141 mM Tris base, 2% LDS, 10% glicerolo, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Blu G, fenolo 0,175 mm Rosso, pH 8.5), 20 ml diH 2 O, e 1 ml di 0,5 M tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), consentendo un certo volume per rimanere in perline.
- Riscaldare a 95 ° C per 10 minuti e raffreddare su ghiaccio.
- Spin> 10.000 xga 4 ° C per 5 min.
- Raccogliere il surnatante.
- Eseguire un Western Blot utilizzando anticorpi adeguati Nota: Sire, viene utilizzato l'anticorpo primario anti-PKN1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Come una prova iniziale di concept, la proteina fluorescente verde purificata è stato introdotto con successo in cellule di mammifero utilizzando elettroporazione. GFP, un approssimativo 27 kD proteina peso molecolare è comunemente introdotti in cellule di mammifero (normalmente espressi dal plasmide DNA) come strumento di biologia molecolare senza significative tossicità cellulare. Cellule HeLa sono state incubate (Figura 1A) o elettroporate (Figura 1B) con 25 mg / ml GFP, seguita da immunofluorescenza microscopia confocale per cercare il segnale fluorescente GFP. Per dimostrare che il GFP era all'interno del citoplasma cellulare, le cellule sono state anche colorate con agglutinina di germe di grano (WGA) per delineare il confine citosolico (rosso), nonché una macchia di acido nucleico, DAPI (blu) per indicare il nucleo. Segnale GFP intracellulare è stata osservata solo dopo l'elettroporazione, mentre nessuna proteina intracellulare è stata osservata in cellule incubate con GFP. Risultati simili sono stati osservati con il mouse RAW264.7i macrofagi (Figura 1C e 1D). Si noti che WGA è una lectina che si lega preferenzialmente ai residui nella membrana plasmatica e quindi possono presentare una colorazione puntiforme in base alla lunghezza di incubazione. Confronto Figura 1A e la Figura 2A, in cui la figura 2A è stata incubata per una durata superiore Figura 1A.
Elettroporazione è stato poi esteso a un tag, purificato effettrici Salmonella, GtgE. GtgE, un fattore di virulenza nota 30, è stato scoperto dal nostro gruppo per essere secreto nelle cellule ospiti 31, ed è stato recentemente dimostrato di essere una proteasi cisteina 32. Cellule HeLa sono state incubate o elettroporate con 50 mg / ml GtgE. Per l'analisi di immunofluorescenza, le cellule sono state colorate con un anticorpo contro il peptide tag di affinità-streptavidina vincolante GtgE. Le cellule sono state anche colorate con WGA e DAPI. In cellule HeLa incubate (Figure 2A), non vi è alcuna GtgE intracellulare come visualizzato dalla mancanza di foci verde fluorescente. In contrasto, cellule HeLa elettroporate (Figura 2B) mostrano significativa segnale intracellulare proteina fluorescente indicante effettrici era entrato cellule a causa del processo di elettroporazione. Cellule RAW mostrato leggermente maggiore propensione ad accumulare proteina sulla superficie cellulare durante l'incubazione (Figura 2C), ma il segnale intracellulare è stata osservata solo su elettroporazione (Figura 2D).
Determinare i limiti di rilevamento per la visualizzazione di localizzazione sub-cellulare tramite microscopia confocale è importante garantire abbastanza proteine entrò nella cella, evitando di sovraccaricare la cella con effettori batterica potenzialmente tossici. In figura 3, GtgE stato elettroporate in cellule macrofagi come RAW a 2,5, 25 e 50 mg / ml. Le cellule sono state poi fissate e colorate con un anticorpo contro il tag su GtgE. Oolo un piccolo numero di focolai sono stati osservati a 2,5 ug / ml GtgE (Figura 3A), con aumento del numero di foci apparente a 25 ug / ml, (figura 3B), ma il maggior numero di foci distinte sono stati osservati con la proteina massima concentrazione testato, 50 mg / ml (Figura 3C). Pattern di colorazione simili sono stati osservati tra i campioni che indicano a queste concentrazioni di proteine proteina intracellulare potrebbe essere facilmente verificata mediante microscopia confocale. Le concentrazioni proteiche superiori a 50 ug / ml non sono stati testati per la concentrazione di proteine aumentato, così ha fatto la propensione per la proteina bersaglio per diventare adsorbita alla superficie delle cellule. Per evitare questi aggregati della membrana proteina associata, si è reso necessario mettere in comune due cuvette elettroporazione per ottenere abbastanza proteine ospite interagiscono visualizzare su una macchia occidentale (Figura 6, corsia di destra).
Per dimostrare ulteriormente che la intproteine roduced non era semplicemente adsorbito alla superficie della cellula, sezioni ottiche consecutivi sono stati ripresi in piani focali ogni 0,35-0,43 micrometri (Z-stack) utilizzando la microscopia confocale. Cellule RAW state elettroporate con 50 ug / ml GtgE e colorate come sopra descritto (Figura 4, A e B). Le Z-stack mostrato che GtgE era effettivamente intracellulare e le foci estendono dalla parte inferiore (Figura 4A, piano 6 di 36) alla sommità della cella (Figura 4B, piano 26 su 36). Risultati simili sono stati ottenuti per tutte le proteine elettroporate. Il profilo fluorescenza intrinseca di popolazioni di cellule di controllo con e senza proteine effettrici o elettroporazione è stata esaminata mediante microscopia confocale a fluorescenza, ed è stato ritenuto trascurabile.
Inoltre, la proteina elettroporate è stata esaminata per vedere se è stata mirata per la degradazione attraverso vie endocitiche. Le cellule sono state colorate per Ras-correlate proteina 5A (Rab5), unamarker per endosomi precoci (Figura 4C), o Lysosome-associata membrane proteina 1 (Lampada1), un marker per gli endosomi e lisosomi (Figura 4D) in ritardo. Co-localizzazione tra la proteina elettroporate e questi marcatori cellulari indicherebbe una stretta interazione fisica tra di loro (cioè che la proteina elettroporate era dentro endosomi / lisosomi). La microscopia confocale ha dimostrato che la proteina elettroporate (GFP o GtgE) non ha co-localizzare con LAMPADA1 o Rab5. E 'stato dedotto che ha introdotto la proteina non è stato direttamente endocitosi nelle cellule o mirata per via intracellulare entro quattro ore di trattamento.
Esogena introduzione proteina può avere effetti cellulari nel corso di diverse ore o giorni, e quindi è spesso utile esaminare la persistenza di proteine introdotte. Per determinare quanto tempo una proteina elettroporate si manterrà senza degradazione dopo l'elettroporazione. O Basedn visualizzazione di attaccamento e di diffusione delle cellule, 4 ore è stato determinato per essere il tempo di recupero approssimativo minimo per le cellule elettroporate. Per osservare temporalmente la persistenza proteina un esperimento time-corso è stata eseguita, colorazione delle cellule 4, 24, o 96 ore dopo l'elettroporazione. Dopo 4 ore (Figura 5A), quando morfologia cellulare suggerito recupero, c'era una quantità apprezzabile di proteina intracellulare. Dopo 24 ore (Figura 5B), c'era ancora considerevole di proteine all'interno delle cellule elettroporate. Anche quando il tempo dopo elettroporazione è stato esteso a 96 ore prima della fissazione e la colorazione (Figura 5C) c'erano focolai osservabili anche se ad un abbondanza apparente ridotta, dimostrando giorni persistenza proteine dopo il trattamento iniziale.
Due precisazioni importanti sono stati notati nel corso di questi esperimenti. Cellule RAW mostrato una tendenza maggiore di cellule HeLa di accumulare le proteine esogene sulla irre superficie cellulareprospettiva di incubazione (Figura 6A) o elettroporazione (Figura 6B). Nonostante ciò, tutti i campioni erano aumentati elettroporate proteina interno (figure 1, 2, 5b). Inoltre, la proteina associata alla membrana scomparve nel tempo. Un secondo avvertimento era una piccola frazione di cellule che presentano un fenotipo comprendente piccole, cellule caricate con elevate quantità di proteine esogene sia controllo arrotondato (incubata) e (elettroporate) cellule trattate (Figura 6 C e D, i campioni di incubazione mostrato). I nuclei di queste cellule mostravano cromatina condensata sulla base di colorazione DAPI, e riempito la totalità del volume cellulare, suggestivo di apoptosi. È quindi possibile che le cellule apoptotiche (derivanti da una parte normale del ciclo cellulare oa causa di raccolta / trattamento) hanno una propensione ad assorbire proteine dal buffer.
Per dimostrare che le proteine elettroporate erano funzionali e potrebbe localizzare correctly all'interno della cellula ospite, co-localizzazione e interazione proteina-proteina tra il effettrici proteine Salmonella SspH1 e il suo target di accoglienza noto, proteina chinasi N1 (PKN1) 33 è stato mostrato. Dopo l'elettroporazione, l'interazione fisica tra SspH1 e PKN1 è stato verificato da un immunoprecipitation basato affinità seguita da Western Blot (Figura 7A). Co-localizzazione è stata anche osservata mediante microscopia confocale, che indica i fluorofori sono abbastanza vicini spazialmente sovrapporsi 34. Dopo elettroporazione con 50 ug / ml SspH1, cellule HeLa (Figura 7B) erano fissate e colorate per SspH1 (verde) e PKN1 (rosso). Alla potenza del laser a bassa focolai distinti (giallo) sono stati osservati nel nucleo indicando SspH1 e PKN1 fosse fisicamente abbastanza vicino per interagire. Questa interazione è stata stabilita in letteratura; tuttavia questo studio è il primo a dimostrare co-localizzazione nel nucleo.
= "Always"> 
Figura 1: Elettroporazione di GFP - HeLa o RAW 264.7 cellule cellule sono state incubate o elettroporate con 25 mg / ml di purificato la proteina fluorescente verde (GFP) e colorati con anti-GFP anticorpi (Verde), DAPI, una sonda specifica nucleare (blu. ), e WGA (rosso) per delineare il confine citosolico. Incubate cellule (A) HeLa mostrano un'assenza di fluorescenza verde indica una mancanza di internalizzazione di GFP. (B) mostra una microfotografia rappresentante GFP elettroporate. Si noti la comparsa di focolai intracellulare indicare GFP era entrato cellule. (C) e (D) sono immagini rappresentative di cellule RAW incubate (C), o elettroporate (D) con 25 ug / ml di proteina fluorescente verde purificata.
es / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
Figura 2:. Elettroporazione di Salmonella effettrici GtgE - cellule HeLa cellule sono state incubate (A) o elettroporate (B) con 50 mg / ml di un'affinità taggati Salmonella effettori, GtgE, e macchiato con un tag anticorpo anti-effector (Verde), DAPI, una maschera nucleare (blu), e WGA (rosso) per delineare il confine citosolico. In (A), incubate cellule HeLa mostrano l'assenza di fluorescenza verde che indica la mancanza di interiorizzazione di GtgE. (B) mostra una microfotografia rappresentante elettroporate GtgE, mostrando intracellulare di proteine effettrici elettroporate. (C) e (D) sono immagini rappresentative di cellule RAW che erano o incubate o elettroporate, rispettivamente, nello stesso modo con 50 ug / ml di Salmonella GtgE. Azzurro è la combinazione, o sovrapposizione, di fluorescenza rossa dalla WGA efluorescenza verde dal anticorpo secondario.
Figura 3: titolazione di proteine elettroporate - i macrofagi RAW cellule sono state elettroporate con 2,5 mg / ml (A), 25 mg / ml (B), o 50 mg / ml (C) Salmonella effettrici GtgE e permesso di recuperare per. 4 ore. Le cellule sono state fissate e colorate con un anticorpo anti-SBP-tag (verde) e la maschera nuclei, DAPI (blu). È possibile visualizzare foci fluorescente, indicativo di GtgE intracellulare a 2,5 ug / ml tramite microcopy confocale, anche se i risultati migliori sono stati ottenuti quando sono stati usati maggiore quantità di partenza di proteine. I risultati soddisfacenti (tra cui proteine intracellulari facilmente osservata al microscopio confocale senza eccessivo membrana aggregati associati) sono stati ottenuti a 50 mg / ml per GtgE e quindi no maggiori concentrazioni sono stati testati.
Figura 4:. Proteine internalizzazione e la mancanza di co-localizzazione con marcatori endosome fette ottici consecutive (z-stack) ottenuti mediante microscopia confocale di visualizzare se la proteina elettroporate era interna. Cellule RAW state elettroporate con 50 ug / ml GtgE. (A) mostra fetta ottico 6 di 36, z-stack (2,1 micrometri) sopra il fondo del piatto. (B) mostra lo stesso campo visivo ma fetta 26 36. Le foci intracellulari estendono per tutta la cella indica che la proteina è veramente intracellulare e non aggregati sulla superficie della cellula. Azzurro è la combinazione di WGA rosso, anticorpo secondario verde e blu DAPI. Co-localizzazione test con marcatori di endosomi / lisosomi, Rab5, (C) o di un marker lisosomi, LAMP1 
Figura 5: Proteine persistenza dopo l'elettroporazione microscopio confocale mostra la persistenza di GtgE elettroporate nel tempo.. 50 mg / ml è stata GtgE elettroporate in cellule HeLa. Le cellule sono state poi fissate e colorate con un anticorpo anti-SBP-tag (verde) e la maschera nuclei, DAPI (blu). 4 ore (A) è stato determinato a essere l'importo minimo di tempo per consentire alle cellule di recuperare e come previsto mostra proteina intracellulare massimo. Dopo 24 ore (B) e 96 ore (C), foci verde, sia intracellulare e sul celsuperficie lular, mostra la persistenza effettore indicando che la proteina non è giorni degradati dopo il trattamento iniziale. Il colore azzurro in questa immagine è la sovrapposizione di DAPI blu e l'anticorpo colorazione verde. 
Figura 6: Cell. Di superficie di proteine di aggregazione e un fenotipo elettroporazione i macrofagi RAW erano o incubate (A) o elettroporate (B) con 50 mg / ml GtgE e colorati con anti-SBP-tag anticorpi (Verde), WGA (Red ), e con DAPI (blu). Sia le cellule HeLa RAW 264.7 e, in misura minore, tendevano ad aggregare effettore sulla superficie della cellula; tutte le cellule elettroporate sono stati mostrati essere aumentato proteina interna (HeLa non mostrato). Giallo è la sovrapposizione di rosso di WGA e verde dalla proteina bersaglio. RAW (C) e (D) HeLa cellule showing un fenotipo alterato dopo incubazione con GtgE (illustrato). Diversi esperimenti hanno mostrato un fenotipo costituito da celle più piccole con differenziale DAPI colorazione e una perdita di citoplasma. Azzurro è la sovrapposizione della WGA rosso, anticorpo secondario verde e blu DAPI. Microscopia confocale stato utilizzato per mostrare la proteina bersaglio accumulo nel nucleo. Dal momento che questo fenotipo delle cellule proteiche carichi esogeni apparso dopo sia incubazione e elettroporazione, si potrebbe ipotizzare questo fenotipo essere indicativo di apoptosi. 
Figura 7:. Interazioni proteina ospite con elettroporate Salmonella SspH1 - cellule HeLa cellule sono state elettroporate alle concentrazioni elencate con SspH1, ha permesso di recuperare per 4 ore prima di eseguire una purificazione per affinità modificata seguita da western blot (A) per arricchire erilevare la nota socio interagenti eucariotica: proteina serina / treonina chinasi N1 (PKN1). Si noti che la corsia di destra (2x EP) comprende 2 cuvette pool, come il segnale da una cuvetta miscelato in fondo, ma PKN1 era ancora arricchito sopra la mancanza di legame visto nel controllo no-esca. Il Western Blot è stato eseguito con nativo HeLa lisato, purificato SspH1, ei campioni di depurazione affinità prima di essere sondati con un anticorpo monoclonale per PKN1. Individuazione di destinazione è stato ottenuto tramite un anticorpo secondario perossidasi coniugato con reattività contro l'isotipo dell'anticorpo primario. Cellule HeLa (B) mostra co-localizzazione (giallo) tra PKN1 (rosso) e SspH1 (verde) via mediante microscopia confocale dopo elettroporazione con 50 ug / ml SspH1. Questa sovrapposizione ottica indica che l'effettore e la proteina ospite sono abbastanza vicino per interagire fisicamente. Il fatto che l'interazione è stato mostrato nel nucleo per la prima volta, offre supporto aggiuntivola proteina è stata trafficata correttamente dall'host.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effettori secreti dai batteri patogeni si sono evoluti per funzionare nell'ambiente cellula ospite e quindi è utile per loro studiare in situ all'interno dell'ospite. Introduzione di effettori specifici di interesse nelle cellule ospiti permette pertinenti interazioni patogeno-ospite da studiare in isolamento senza interferenze da altre proteine batteriche. L'obiettivo era di esplorare elettroporazione come un mezzo per introdurre le proteine effettrici batteriche nelle cellule ospiti eucariotiche, evitando in tal modo alcune delle sfide connesse con trasfezione o trasduzione. Proteina fluorescente verde è stato usato come controllo e proteine Salmonella effettrici sono stati testati. A causa di interesse in batteri patogeni che colpiscono ospitare le cellule epiteliali e cellule immunitarie, sono stati utilizzati una linea uomo epiteliali-come celle (HeLa) e macrofagi come mouse (RAW 264.7). Elettroporazione in grado di fornire proteine esogene in cellule ospiti senza diminuzione apprezzabile viabili cellularety, e le proteine di costo erano rilevabili nelle cellule fino a quattro giorni.
Per isolare gli effetti delle proteine elettroporate, è necessaria proteina pura. In questo studio, le proteine sono state espresse in E. coli ceppo BL21 con tag polyhistidine N-terminale e streptavidina vincolante-peptide. Le proteine sono state purificate con resina Ni-NTA, analizzati per la concentrazione (generalmente compresa tra 5-25 mg / ml) e purezza, e conservati a -80 ° C fino elettroporazione. Proteine commercialmente prodotte sarebbe anche accettabile per elettroporazione, in quanto tendono ad essere di elevata purezza e ben caratterizzato.
Passaggi chiave in questo protocollo incluso rimuovere completamente il terreno di coltura per il lavaggio e la sospensione le cellule in tampone privo di proteine. Questo assicura che qualsiasi fenotipi valle osservati sono dovuti alla proteina esogena di interesse e non proteine presenti nel mezzo di coltura. Migliore efficienza di elettroporazione è stata osservata quando la densità cellulare erasuperiore (ad esempio 6 x 10 6 contro 1 x 10 6 cellule), anche se il numero migliore varierà con la dimensione e il tipo cellulare. Un altro passo fondamentale nella dell'esperimento era di consentire alle cellule di tempo per recuperare e ricollegare ai piatti; questo era necessario perché le cellule aderenti sono stati utilizzati in questo studio. Un periodo di recupero deve essere meno importante per cellule in sospensione, anche se può essere necessario fornire proteine tempo per una corretta traffico intracellulare, interazioni proteina-proteina, o attività enzimatica, a seconda della natura dello studio previsto. Poiché le proteine consegnati sono stati osservati nelle cellule per un massimo di 96 ore, c'è molto spazio per la regolazione per il periodo di incubazione prima della microscopia visualizzazione o dosaggio cellulare.
Diverse variabili in questo protocollo possono essere ottimizzati per diversi tipi di cellule, proteine bersaglio, o schemi di analisi a valle. La quantità di proteine da elettroporate può essere messa a punto per la concentrazione intracellulare desiderato. Fovisualizzazione r di localizzazione delle proteine, può essere utilizzato appena 1 mg. Per gli studi funzionali, possono essere necessari più elevati importi di base delle proteine. Inoltre, la quantità di tempo per il recupero cellula post-elettroporazione può essere cortocircuitata o esteso. Bersagli proteici labili o processi a valle veloci richiederebbero un tempo di incubazione più breve. Inoltre, la quantità di cellule piastrate può essere regolata oltre i suggerimenti qui. Le cellule possono essere placcato più scarsamente se la proteina introdotta deve essere monitorata da microscopio, o placcato più densamente se la proteina elettroporate è da recuperare per le applicazioni come le macchie occidentali.
Mentre elettroporazione è un metodo semplice e diretto per l'introduzione di proteine nelle cellule viventi, ci sono alcune limitazioni alla tecnica. Il metodo richiede proteine altamente puri in quantità microgrammi. Il meno 1 mg è stato elettroporate e visualizzato con microscopia confocale, ma più elevati importi di base delle proteine ha Better risultati visivi. Mentre la funzione delle proteine non è stato valutato a tutte le concentrazioni dopo l'elettroporazione, concentrazioni di proteine pari o superiore a 50 mg / ml sono stati richiesti per segnale adeguato per western blot. Inoltre, a causa dei vincoli dimensionali delle cuvette elettroporazione, scaling up può richiedere l'elaborazione di molteplici cuvette di cellule. Tuttavia, visto che il processo di elettroporazione richiede pochi secondi una volta le cellule sono preparati, elaborazione parallela richiede po 'di tempo e fatica.
Se la proteina è introdotto da visualizzare mediante western blot, la microscopia, o utilizzati per la purificazione di affinità, la proteina dovrebbe avere un tag 35 per la purificazione di affinità, o un anticorpo disponibile per il rilevamento. Tuttavia, per ragioni sconosciute, alcune interazioni note dalla letteratura o altri metodi biochimici (dati non riportati) non sono stati in grado di essere ricapitolato dopo elettroporazione. Può essere che l'ospite riconosce alcune proteine elettroporate come foreign e rapidamente li segna per la degradazione del proteasoma.
Elettroporazione detiene diversi vantaggi rispetto ad altri metodi esistenti per la consegna delle proteine. Rispetto alla microiniezione, elettroporazione è molto più veloce e più semplice, e un gran numero di cellule può essere trattata in una volta con quasi il 100 percento redditività per le condizioni testate. Elettroporazione è anche più economico di proteine trasfezione con reagenti disponibili in commercio. Trasfezioni di DNA sono spesso utilizzati per studiare le proteine effettrici batteriche nelle cellule ospiti; tuttavia, questo fa sì che le proteine batteriche da sintetizzare non ideale dall'host. D'altra parte, elettroporazione di proteine batteriche elimina la dipendenza da mammiferi macchine espressione proteica, consentendo una migliore rappresentazione del processo infettivo dove proteine effettrici sono espresse dai batteri.
Molte applicazioni potrebbero utilizzare proteine elettroporazione come metodo per lo studio di Intera batterica-hostAZIONI. Innanzitutto, cellule primarie che sono spesso difficili da trasfettare possono essere più suscettibili di elettroporazione per la consegna proteine. Ciò consentirà per lo studio della funzione effettrice in altri tipi di cellule biologicamente rilevanti. Elettroporazione dà anche la possibilità di proteine e / o trattamenti multiplexing. Per esempio, più proteine possono essere introdotte simultaneamente, o droghe e altre piccole molecole possono essere forniti insieme proteine. Il più importante per ottenere una comprensione funzionale dell'effetto delle proteine introdotte, proteine elettroporazione può essere accoppiato con saggi per la funzione delle proteine e le interazioni, come purificazione per affinità, western blot contro obiettivi noti, analisi di espressione cellula intera, e microscopia per determinare subcellulare la localizzazione della proteina introdotta. Quindi, questo metodo ha un grande potenziale come strumento per chiarire batterica patogeno biologia accanto ad altre tecniche di biologia cellulare e molecolare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2088 | |
| 100% Methanol | Any | N/A | Flammable, Toxic |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter | Beckman Coulter | Model Z1 | |
| Cell Culture Incubator | Any | N/A | Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C |
| Cell Culture Plastic | Any | N/A | Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman |
| Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM) | Cellgro | 10-013 | Warm to 37 °C |
| Electroporator | Bio-Rad | E. coli Pulser | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-016-CV | |
| Fluorescent confocal microscope | Ziess | Model LSM 710 | |
| Glass Bottom Dishes for Microscopy | Wilco Wells | HBSt-3522 | |
| HALT Protease Inhibitor Cocktail | Pierce | 78430 | Corrosive, Toxic |
| HeLa Cell Line | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| LDS 4X Loading Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Minimal Essential Medium (MEM) | Cellgro | 10-010 | Warm to 37 °C |
| Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent | Any | N/A | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-Cl | |
| RAW 264.7 Cell line | ATCC | TIB-71 | |
| Primary Antibody Against Target of Interest | Any | N/A | |
| Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore | Any | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Chill to 4 °C |
| Sterile Phosphate Buffered Saline | Any | N/A | Warm to 37 °C |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin Agarose Resin Suspension | Pierce | 20353 | |
| Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred) | Any | N/A | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | 646547 | Corrosive, Toxic |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8585 | Irritant, Toxic |
References
- Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
- Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
- Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
- Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
- He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
- Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
- Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
- Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
- Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74 (2013).
- Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
- McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
- Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
- Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
- Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
- Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
- Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
- Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
- Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
- Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
- Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
- Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
- Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
- Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
- Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A.
- Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
- McAteer, J. A., Douglas, W. H.
- Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
- Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
- Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
- Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
- Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).
