Introduction
אפיתל ריח העכבר בחלל האף כולל 6-10,000,000 עצב סנסורי חוש הריח דו קוטבי 1. כל נוירון חוש הריח בוחר אחד של 1,200 גני קולט odorant לביטוי. איתור של odorants מתחיל בodorant מחייב קולטני ריח 2, אשר לאחר מכן מפעיל cyclase adenylyl סוג III (ACIII) 3 דרך חלבון G הספציפי Gα חוש הריח olf 4. העלייה וכתוצאה מכך monophosphate המחזורית אדנוזין (cAMP) פותחת מחזורי (CNG), ערוץ קטיון לא סלקטיבי שהוביל לזרם של Ca 2 + וNa +, ולאחר מכן Ca מגודרת נוקלאוטיד 2 + זרם מוביל לפתיחת Cl Ca 2 + מופעל - ערוץ 5,6. וכתוצאה מכך כלפי חוץ Cl - השטף הוא הקל על ידי Cl תאיים גבוה - ריכוז מתוחזק על ידי Cl היציב - ספיגה, סביר להניח באמצעות Na + / K + / Cl - NKCC1 cotransporter,Cl - / HCO3 - SLC4A1 מחליף, ומובילים עדיין להיות מזוהים אולי נוספים 6-8.
יש נוירונים חוש הריח דו קוטביים אקסונים בודדים, unbranched שמקרינים ישירות לנורת חוש הריח, ודנדריט שמשתרע על פני השטח של האפיתל ומסתיים כתא מיוחד, הידית דנדריטים. מהכפתור הזה, 10-30 cilia, שיכול להגיע לאורך של עד 50-60 מיקרומטר, נובע לריר המכסה את פני השטח האפיתל 9. חלבונים של המפל הולך אותות הקנונים הם מקומיים בעיקר בקרום של cilia אלה. המשטח החושי המוגבר של האפיתל מגביר את היכולת לזהות odorants. עקב הצפיפות של עצב סנסורי, cilia המשתרע מידיות דנדריטים שכנות להתערבב. כך מצויים בתערובת אקראית של cilia מתאי עצב שונה, המבטאים סוגים שונים של קולטני ריח, על פני השטח של האפיתל. האיתור והתאהקצאת רגילה של חלבוני הריסים אשר נמצאים רק בתת-קבוצה של תאי עצב תחושתיים היא קשה ולכן בcryosections. בנוסף, האיתור המדויק של חלבונים כגון לאורך הריסים הוא בקושי אפשרי, שכן cryosections הוא בדרך כלל דק יותר מהאורך הממוצע של cilia.
כדי לאפשר חקירה של לוקליזציה הריסים של חלבונים בממברנה עד כה uncharacterized בתאי עצב הרחה, אנו מותאמים en טכניקת הכנת פנים המאפשרת ניתוח מפורט של לוקליזציה חלבון בcilia. בקצרה, העכבר הוא הקריב והראש לפצל ליד קו האמצע. Turbinates, האף, ועצמות חזיתיות יוסרו כדי לחשוף את המחיצה. המחיצה עם חלק חוש הריח של האפיתל הבטנה הוא התיר על ידי חיתוך כל החיבורים לחלל האף. לאחר לשים את המחיצה לתוך צלחת פטרי מלא בפתרון של רינגר, האפיתל הוא קילף und הועבר לשקופיות זכוכית מצופים. בעקבות fixat קצרצעד יון, ניתן לבצע נהלי immunostaining אם הטיפול הוא עדין ככל האפשר, כדי למנוע נזק של רקמת הרירית. אנחנו מדגימים את הרזולוציה השגה על ידי השוואת ההכתמה של שני חלבוני קרום שונים בcilia חוש הריח בcryosections הקלאסי ובen הפנים ההכנה תיארה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל נהלי בעלי החיים טופלו בCharité או אוניברסיטת מרפאת Jena בקנה אחד עם חוקים הגרמנים טיפול בבעלי חיים הימנעות מכל סבל מיותר של בעלי חיים.
1. פתרונות הכנה וDissection מקום עבודה
- פתרונות
הערה: הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת נתיחה של האפיתל.- פתרונות להליך לנתיחה:
- הכן את הפתרון של רינגר (pH 7.4) עם ריכוזים של 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ CaCl 2, 1 מ"מ MgCl 2, ו -10 מ"מ גלוקוז.
- הכן PBS - / - פתרון (pH 7.4) עם ריכוזים של 2.68 מ"מ KCl, 1.47 מ"מ KH 2 PO 4, 136 מ"מ NaCl, ו -8.1 מ"מ Na 2 HPO 4.
- הכן פתרון מקבע (pH 7.2) עם ריכוזים של 1x PBS - / -, 0.2 מ"מ CaCl 2, סוכרוז 4%, וparaformaldehyde 4%. סוכרוז בפתרון מקבע משפר cryoחתך ואיסוף של cryosections. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
- פתרונות להליך מכתים
- הכן PBS + / + פתרון עם ריכוזים של 1x PBS - / -, 0.48 מ"מ MgCl 2, 0.9 מ"מ CaCl 2.
- הכן PBST + / + פתרון עם ריכוזים של 1x PBS + / + ו -0.1% Triton X-100.
- הכן פתרון חסימה עם ריכוזים של 1x PBST + / + ו -1% לטין.
- פתרונות להליך לנתיחה:
- מקום עבודה
- למקום העבודה לנתיחה, להשתמש מיקרוסקופ לנתח עם תאורה בהירה, כמו גם עט נוזלי בחסמי.
- הכן צלחת פטרי, מלא בפתרון של רינגר, ושקופיות זכוכית דבק.
- השג את מכשירי הניתוח הבאים: זוג מספריים כירורגית עם קצה קהה אחד חד ואחד, זוג מספריים אביב עם צורת קצה ישר, שני מלקחיים עם צורה עדינה מעוקלת קצה וסכין גילוח (
2. הכנת מחיצת האף
- בעלי חיים בכלובים שאושרו בית עם גישה סדירה למזון ומים ומחזור היום / לילה מתאים.
- לבצע הרדמה בגזת קיבול המכיל סגורה ספוגה עם isoflurane 100% ושיכוך כאבים צג על ידי בדיקת רפלקסים רגל אחורית. מאז נקע בצוואר הרחם יכול לגרום לדם בחללי האף, ישירות לערוף עכברים מורדמים.
- הסר את העור כדי לחשוף את העצם של כל הגולגולת והאף, ולנגב את הדם ורקמות שנותר באמצעות מגבת נייר ביסודיות. הסר את הלסת ושיניים הקדמיות התחתונות.
- לחתוך את עצם הגב של האף דו-צדדי במקביל מרחק 1-2 מ"מ לקו התפר כדי להפריד צד אחד של מחיצת האף (מדיאלית) מmaxilla (רוחבי). לפצל את האף עם חתך אחד. אם שרידי עצמות וturbinates עדיין מחוברים למחיצה, להסיר אלה בזהירות כדי לחשוף את המחיצה לחלוטיןמבלי לגעת בו.
- הסר את עצם האף הגבי על ידי הזזה הקצה מעוגל הקנס של מלקחיים בצד הגב של מחיצת האף, בין המחיצה ועצם האף. להפעיל לחץ קל על העצם, לדחוף אותו ולהסיר אותו.
- כדי לספק גישה לשתי רקמות במחיצה, אחד מכל חלל, להסיר בזהירות את maxilla של הצד של הראש האחר. בעת הכנת בעלי חיים מבוגרים (P> 28), להסיר את קצה העצם הקדמי מכסה את נורות חוש הריח.
- זהה את אפיתל ההרחה על ידי הצבע הצהוב מעט (איור 1). אפיתל הנשימה הגובל הוא לבן ומראה תנועה של cilia ניעתי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ לנתח. לחתוך לאורך הגבול בין אפיתל הרחה ונשימה עם זוג מספריים אביב נאה.
- להאריך את החתך ולהפריד את המחיצה מחיבור הגחון עד עצם vomer. ואז לחתוך לאורך הגבול בין המחיצה וcribrosa lamina של ethmoidal Osדואר. המחיצה כעת מבודדת לחלוטין מכל החיבורים לראש. השתמש בעמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג.
3. בידוד של האפיתל חוש הריח לImmunostaining
- הנח שקופיות זכוכית דבק בצלחת פטרי מלאים בפתרון של רינגר. מניחים אותו על הקצה של צלחת פטרי, כך שמחצית מהזכוכית טמונה בפתרון (איור 1 א) רינגר.
- השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את עצם הכברה עם אפיתל ההרחה לצלחת פטרי. הרם אותו ללא תופס אותו עם הטיפים מלקחיים.
- תפוס את הצלחת בניצב של העצם הכברה עם מלקחיים ולהשתמש שני אחת כדי להסיר בזהירות את האפיתל מצד אחד של מחיצת האף. חלק את הקצה המעוגל בין הצלחת ואפיתל בניצב לקלף את האפיתל מ.
- להיות תמיד בטוח כדי לזהות את צד הריסים, במקרה אפיתל סלטות בsoluti רינגרעל. אם אפיתל סלטות, זה כמעט בלתי אפשרי לזהות את צד הריסים לאחר מכן. בעיקר, האפיתל מתגלגל עם משטח הריסים בפנים.
- השווה את צורת הרקמה נרשמה עם עמדות החיתוך שמוצגים באיור 1 ג. תפוס את האפיתל בעמדה בגבול ולמשוך אותו לשקופית הזכוכית. אל תיגע בצד הריסים עם המלקחיים כדי למנוע נגעים של הרקמה.
- הפעל מחץ ולחזור על התהליך עם אפיתל מהצד השני.
- ייבש את שקופיות הזכוכית סביב שני החתיכות של אפיתל ריח עם מגבת נייר ולהקיף את הרקמה עם עט נוזלי בחסמי.
- לתקן את הרקמה עם 150 פתרון מקבע μl 10 דקות ב RT. בנוגע ליציבות cilia ויושרה, להשתמש פעמים קיבעון קצרות עבור מגוון רחב של נוגדנים נבדקו. בתוך cilia 10 דקות אלה קבועים, אבל כנראה לא כל רקמת האפיתל. לפיכך, מיידי לדמיין עם מיקרוסקופ לאחר staining הליך. עם זאת, פעמים מקבע עשויות להשתנות לנוגדנים בודדים.
4. מכתים פרוטוקול
הערה: ידית הרקמה מאוד בזהירות כדי לשמור על מבני הריסים של עצב סנסורי חוש הריח. הסר פתרונות על ידי pipetting. אל תפיל את כל פתרונות ישירות על גבי האפיתל, ככוחות מכאניים יכולים לשבש את הריסים העדינים. לבצע את כל השלבים בRT אם לא צוין אחרת.
- הסר את הפתרון מקבע ולשטוף 2 פעמים עם PBS + / +.
- דגירה אפיתל במשך שעה לפחות 1 עם חסימת פתרון.
- הכן פתרון נוגדן ראשוני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 200 לנוגדנים המשמשים במחקר זה) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה כדי להסיר כל משקעים.
- דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים בתא לח על 4 מעלות CO / N.
- אפיתל לשטוף עם PBS + / + 5 דקות לפחות 3 פעמים.
- הכן פתרון נוגדנים משני על ידי המסת הנוגדן בחסימת פתרון (1: 500) וצנטריפוגות במשך 5 דקות במהירות מלאה.
- דגירה אפיתל עם פתרון נוגדנים משני עבור שעה 1 בתא חשוך.
- אפיתל לשטוף עם PBS + / + 5 דקות לפחות 3 פעמים.
- הסר את הנוזל בחסמי בסכין גילוח או מגבת נייר. שטוף את האפיתל במים מזוקקים למשך 5 s.
- לשמר את הרקמה בantifade מגיב הרכבה.
הערה: עליות הקרינה רקע במהירות בתוך ימים; ניתוח Microscopical לא יאוחר מ 2 ימים לאחר ההטבעה בהרכבה בינונית לכן, מומלץ. טיפול מיוחד צריך להילקח לא לסחוט את הרקמה בעת חיפוש מישור המוקד הנכון, שכן הוא עלול לגרום נזק חמור להכנה. בשל הקרינה מחוץ לפוקוס, חקירה נוספת עם מיקרוסקופיה confocal מומלצת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיתל ריח en הכנות פנים יכול לשמש כדי לחקור לוקליזציה של חלבונים בcilia של תאי עצב תחושתיים, המאפשר חקירה מפורטת של חלבוני הלוקליזציה אינה ברורה לאחר ניתוח cryosections. בעיה זו יכולה להיות שהודגמה במקרה של ההכתמה לKin של חלבון כמו IRRE-2 (Kirrel2). Kirrel2 (המכונה גם Neph3) הוא חבר של superfamily אימונוגלובולינים (Ig) של חלבונים בממברנה ומתפקד כחלבון הידבקות homophilic. זה היה הראה לשחק תפקיד בהאקסון הדרכה במערכת חוש הריח, ולהתבטא בתת-קבוצה של תאי עצב הרחה בפעילות אופן תלוי 10.
Immunostaining לKirrel2 בcryosection טיפוסי דרך אפיתל ריח מתגלה לוקליזציה של Kirrel2 באקסונים, (איור 2 א) סומה ודנדריטים. כל הפתרונות הוכנו כפי שתואר לעיל לen טכניקת הכנת פנים. למרות שחלק labeling מופיע על גבי השכבה המורכבת מהידיות הדנדריטים, לוקליזציה הריסים נשארה לא ברורה לאחר ניתוח cryosections. נוירונים מסוימים הציגו צביעה ובסביב ידית חוש הריח שלהם, אבל cilia היחיד היו קשה לזהות. בניגוד לכך, en פנים הכנת אפיתל ההרחה מבוצע על פי הפרוטוקול שתואר לעיל באופן חד משמעי הראה לוקליזציה הריסים של Kirrel2 (איור 2). מעניין, Kirrel2 בא לידי ביטוי רק בcilia של תת-קבוצה קטנה יחסית של תאי עצב הרחה, למרות שהניתוח של cryosections מוכתם הראה ביטוי באחוז הרבה יותר גדול של תאי עצב. יתר על כן, en הפנים ההכנה לא רק להפגין צביעת הריסים באופן כללי, אבל חשפה שינויים בדפוסי ביטוי הריסים החל נוירונים עם הרבה ריסים ארוכים לנוירונים עם כמה רק cilia קצר. בחלק מהתאים, Kirrel2 התגלה בידית דנדריטיים, אך לא בcilia המשתרע מכפתור זה. ג ause ורלוונטי פונקציונליים של ממצא זה עדיין לא הובהרו, אבל זה ממחיש את הפוטנציאל של en הפנים ההכנה לספק תובנות חדשות על לוקליזציה חלבון במערכת ההרחה.
בנוסף, ביצענו immunostaining לקולטני ריח מור-EG, המציג ביטוי הריסים חזקים 11. קולט הוא כבר ברור לזיהוי בשכבת הריסים בcryosections (איור 3 א). עם זאת, ניתוח של המאפיינים מפורטים כגון מספר cilia לידית או אורך הריסים בודדים אינו אפשרי. השימוש בen פנים הכנה, זיהוי cilia מנוירונים המבטאים את קולטני הריח בקלות אפשרי (איור 3 ב, ג). En הפנים ההכנה יכולה להתבצע עם בעלי חיים בגילים שונים. אפילו cilia מבעלי החיים טרום לידתי היה מוכתם בהצלחה ומדמיין (איור 3D).
תוכן "> En הכנות פנים לכן מייצג כלי המתאים כדי לנתח את מורפולוגיה הריסים והלוקליזציה של חלבוני הריסים ידועים בפירוט.
איור 1. הכנת ראש העכבר. הסדר (א) למקום העבודה לנתיחה. צלחת פטרי מלאה בפתרון של רינגר ומחזיקה שקופיות זכוכית דבק. מכשירי הניתוח מומלצים לen פנים הכנה. (ב) לאחר הסרת מחצית מראש העכבר, מחצה חשוף. המחיצה צופה אפיתל הרחה (OE) ואפיתל הנשימה (RE). OB: הנורה חוש הריח, V:. איבר יעקובסון (C) כדי לבודד את החלק של מחיצת האף מרופד באפיתל ההרחה, לחתוך את המחיצה לאורך הקווים הפגינו עם זוג מספריים קנס. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. השוואה של immunostaining Kirrel2 בcryosections וen הכנות פנים. (א) תמונת Confocal (הקרנה המרבית) של 60 cryosection יום לידה (P60) immunostained עבור Kirrel2 מגלה לוקליזציה חלבון בתאי עצב תחושתי חוש הריח. ידיות חוש הריח חד להראות צביעה חזקה וKirrel2 הלוקליזציה בcilia הנחה (כוכבית), אבל לא בטוחה. (ב) תמונת Confocal (הקרנה המרבית) של אפיתל ריח P65 en פנים הכנת תערוכות צביעת Kirrel2 ברורה בcilia של קבוצת משנה של עצב סנסורי חוש הריח . (מוטות סולם, 10 מיקרומטר)9 52299fig2large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. השוואה של immunostaining מור-EG בcryosections וen הכנות פנים. (א) תמונת Confocal (הקרנה המרבית) של cryosection P60 immunostained לקולטני ריח מור-EG. לוקליזציה הריסים היא כבר גילוי. תמונת Confocal של P65 en פנים הכנת immunostained לקולטני ריח מור-EG (B). מור-EG בא לידי ביטוי בולט בcilia של קבוצת משנה של עצב סנסורי חוש הריח. בניגוד לcryosections, מאפייני cilia לגבי אורך, מספר cilia ליכולים להיות מנותחות ידית ולוקליזציה חלבון מדויקת. ההגדלה (C) גבוהה יותר של האזור בארגזים ב( B). (ד) Confocתמונה של אל יום עוברי 18 (E18) en פנים הכנת immunostained לקולטני ריח מור-EG. צביעת הריסים באופן ברור ניתן לראות. (מוטות סולם, 10 מיקרומטר) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
